不同恢復階段熱帶森林土壤nirS型反硝化微生物群落結構及多樣性特征

曹乾斌,王邵軍,2,*,陳閩昆,曹 潤,王 平,左倩倩,趙 爽,楊 波

1 西南林業(yè)大學生態(tài)與環(huán)境學院,昆明 650224 2 南京林業(yè)大學南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心,南京 210037

土壤反硝化微生物群落結構及多樣性受生態(tài)系統(tǒng)類型及土壤環(huán)境因子的影響顯著[2,4]。研究表明,在溫帶農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中,土壤質地、含水量、硝態(tài)氮含量是調(diào)控反硝化過程的主控因子[8]。而在森林生態(tài)系統(tǒng)中,土壤有機碳、易容性有機碳、全氮、銨態(tài)氮及pH則成為調(diào)控反硝化微生物群落的重要因子[9-11]。熱帶森林生態(tài)系統(tǒng)每年N2O的排放量高達3.0 Tg,占全球總排放量的40%,是地球上最大的天然N2O排放源[12],因此,熱帶森林土壤反硝化微生物具有更高的多樣性和豐富度。另外,由于熱帶森林具有相對較高的降雨量,年均溫度變化小,植物群落多樣性及異質性較高,土壤理化性質具有較大的變異性[2],可能導致熱帶森林區(qū)域土壤反硝化微生物群落結構及多樣性的巨大差異。目前,nirS型反硝化標記基因已被廣泛用于草地、河口沉積物、農(nóng)田土壤、濕地、北方森林等區(qū)域土壤反硝化微生物多樣性研究[2,13],而有關熱帶森林中土壤nirS型反硝化細菌的群落結構及多樣性的研究,卻十分缺乏。因此,探明熱帶森林中土壤nirS型反硝化細菌群落多樣性及其與土壤理化因子間相互關系,具有十分重要的科學意義。

云南西雙版納位于北回歸線以南的熱帶濕潤區(qū),地貌復雜,小氣候多樣,水熱條件優(yōu)越,物種豐富,是我國原始熱帶雨林保存最為完整的地區(qū)之一。由于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方式改變及人口增加等因素的影響,熱帶雨林遭受了刀耕火種等農(nóng)業(yè)活動的嚴重人為破壞,形成了一系列處于不同恢復階段的次生恢復類型[14]。不同恢復階段形成的森林群落結構會對土壤微生物區(qū)系組成產(chǎn)生重要影響,可能影響反硝化微生物群落的結構及多樣性[15-16]。因此,本研究以中國科學院西雙版納熱帶植物園區(qū)為研究區(qū),選擇3種處于不同恢復階段的熱帶森林群落為研究對象,以nirS型基因標記物,采用Illumina MiSeq高通量測序技術,對比分析不同森林群落土壤nirS型反硝化微生物群落結構及多樣性特征,深入探討nirS型反硝化微生物與土壤理化因子的關系,進而揭示影響熱帶森林土壤反硝化功能微生物的主要因子,為評估熱帶森林恢復過程中土壤N2O排放動態(tài)及土壤N循環(huán)過程提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究樣地位于云南省西雙版納州的中國科學院西雙版納熱帶植物園(21°55′N,101°16′E)區(qū)內(nèi),屬東南亞北熱帶季風氣候區(qū),自然植被類型為熱帶雨林和季雨林,自然恢復的次生植被主要包括白背桐群落、崖豆藤群落、高檐蒲桃群落等,人工林主要為橡膠林[17]。全年平均氣溫21.5℃。干濕季節(jié)分明,年均降水量1557 mm,其中,全年降雨量的87%集中在5—10月的雨季,為1335 mm；而13%則集中于11月至次年4月的干季,為202 mm。研究區(qū)土壤類型為白堊紀砂巖發(fā)育而成的磚紅壤。

1.2 樣地設置

根據(jù)中國科學院西雙版納熱帶森林植物園建園以來的相關森林維護記錄,在植物園區(qū)內(nèi)選取起源于熱帶雨林經(jīng)刀耕火種后自然恢復形成的次生熱帶森林(白背桐群落、崖豆藤群落及高檐蒲桃熱帶森林群落)為研究對象,3個群落處于連續(xù)演替的不同恢復階段且起源(植被與土壤類型)和立地條件(包括坡度、坡向與坡位等)基本類似[18]。樣地詳情如下：

白背桐群落(Mallotuspaniculatuscommunity,簡稱MP),恢復年限約12 a,海拔600 m。植被蓋度約60%,枯枝落葉層厚1—2 cm,平均樹高8.85 m,平均胸徑7.13 cm。樣地內(nèi)喬木樹種為白背桐(M.paniculatus)；下木為小喬木粉被金合歡(Acaciapruinescens)；灌木植物包括椴葉山麻稈(Alchorneatiliifolia)；草本層蓋度約為40%,包括野生風輪草(Clinopodiumchinensis)、豐花草(Borreriastricta)等。

崖豆藤群落(Millettialeptobotryacommunity,簡稱ML),恢復年限約42 a,海拔 568 m。植被蓋度90%左右,枯枝落葉層厚4—5 cm,平均樹高12.25 m,平均胸徑9.93 cm。樣地內(nèi)喬木樹種為思茅崖豆(M.leptobotrya)；下木為小喬木鈍葉金合歡(A.megaladena)；灌木植物包括銹毛魚藤(Derrisferruginea)、椴葉山麻稈(A.tiliifolia)、豬肚木(Canthiumhorridum)和滇南九節(jié)(Psychotriahenryi),灌木層優(yōu)勢種為銹毛魚藤；草本層蓋度約為25%,包括剛莠竹(Microstegiumciliatum)、銀葉砂仁(Amomumsericeum)等。

高檐蒲桃群落(Syzygiumoblatumcommunity,簡稱SO),恢復年限約53 a,海拔619 m。植被蓋度95%左右,凋落物層厚 6—7 cm,平均樹高23.56 m,平均胸徑23.45 cm。樣地內(nèi)喬木樹種為高檐蒲桃(S.oblatum)；下層喬木為思茅崖豆(M.leptobotrya)、雞嗉子榕(Ficussemicordata)、印度栲(Castanopsisindica)和云南黃杞(Engelhardiaspicata)；灌木植物包括黑風藤(Fissistigmapolyanthum)、南山花(Prismatomerisconnata)；草本層蓋度約為15%,包括多型叉蕨(Tectariapolymorpha)、紅豆蔻(Alpiniagalanga)、子分叉露兜(Pandanusfurcatus)等,草本層優(yōu)勢種為多型叉蕨。

1.3 樣品采集和理化因子測定

于2019年3月、9月中旬在3個處于不同恢復階段樣地內(nèi),各設置3個50m×50m樣地,樣地與樣地間距至少200m。每個樣地內(nèi)在對角線取3個取樣點,扒開取樣點上方枯枝落葉,按0—10cm取土,混合均勻后裝入無菌自封袋,分2份帶回實驗室。其中一份用于土壤基本理化指標測定,另一份用于土壤反硝化微生物測定。

土壤溫度采用便攜式土壤水分溫度測量儀(SIN-TN8,昆侖中大)測定；土壤含水率(%)采用烘干稱量法(105℃,24h)測定；土壤容重采用環(huán)刀法測定；土壤pH采用電位法(土水比1∶2.5)測定；土壤有機碳采用油浴加熱-重鉻酸鉀氧化法測定；土壤易氧化有機碳采用高錳酸鉀氧化法測定；土壤全氮、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮采用全自動流動分析儀測定；土壤水解性氮采用堿解擴散法測定；土壤微生物量碳采用氯仿水浴法測定[19]。

1.4 土壤微生物DNA提取及反硝化基因測定和測序

準確稱取0.5g鮮土,根據(jù)E.Z.N.A. ? soil試劑盒(Omega Bio-tek,Norcross,GA,U.S.)說明書進行總DNA抽提,DNA濃度和純度利用NanoDrop2000進行檢測,利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質量；對每份土壤樣品,采用nirS型反硝化細菌引物對：Cd3aF (5′-GTSAACGTSAAGGARACSGG- 3′)和R3cd (5′-GASTTCGGRTGSGTCTTGA- 3′),對V3-V4 可變區(qū)進行PCR擴增。擴增程序為：95℃預變性3 min,27個循環(huán)(95℃變性 30 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s),最后72℃延伸10 min(PCR儀：ABI GeneAmp? 9700型)。擴增體系為20μL,4μL 5*FastPfu緩沖液,2μL 2.5mmol/L dNTPs,0.8μL引物(5μmol/L),0.4μL FastPfu聚合酶；10ng DNA模板,剩余體積用雙蒸水補足。每個樣本均進行3個重復,將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測,使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司)切膠回收PCR產(chǎn)物,Tris_HCl洗脫；2%瓊脂糖電泳檢測。將PCR產(chǎn)物用QuantiFluorTM-ST藍色熒光定量系統(tǒng)(Promega公司)進行檢測定量,采用Illumina PE250平臺構建系統(tǒng)文庫并測序。對Illumina PE250測序得到的PE reads,首先根據(jù)overlap關系進行拼接,同時對序列質量進行質控和過濾,區(qū)分樣本后進行OTU聚類分析和物種分類學分析。使用QIIME軟件,對OUT豐度矩陣中每個樣本的系列數(shù)在不同深度下隨機抽樣,以每個深度下抽取到的系列數(shù)和對應的OUT數(shù)繪制稀釋曲線。根據(jù)上述OUT劃分和分類水平鑒定結果,使用RDP classifier貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學分析,并分別在各個分類水平：domain(域),kingdom(界),phylum(門),class(綱),order(目),family(科),genus(屬),species(種)統(tǒng)計各樣本的群落組成。之后在各分類水平進行Alpha多樣性指數(shù)及物種組成分析。

圖1 各樣地不同月份土壤樣品稀釋曲線 Fig.1 The rarefaction curves of soil samples in different monthsMP- 1與MP- 2分別代表白背桐群落(M. paniculatus)3月和9月的測量數(shù)據(jù)；ML- 1與ML- 2分別代表崖豆藤群落(M. leptobotrya)3月和9月的測量數(shù)據(jù)；SO- 1與SO- 2分別代表高檐蒲桃群落(S. oblatum)3月和9月的測量數(shù)據(jù)

1.5 數(shù)據(jù)處理

土壤數(shù)據(jù)用Excel進行整理,數(shù)據(jù)分析前進行正態(tài)性及方差齊性檢驗,采用單因素方差分析(one-way ANOVA)比較不同恢復階段、不同月份數(shù)據(jù)之間的差異；采用雙因素方差分析比較不同月份(3月、9月)及不同樣地對土壤nirS型反硝化微生物Shannon指數(shù)的影響；使用R語言繪圖包(ggplot2)進行數(shù)據(jù)處理及圖形繪制。

2 研究結果

2.1 土壤nirS基因測序結果

在97%的相似性水平下,對測序結果進行OTU劃分,一共獲得1640個OTUs,經(jīng)比對鑒定后獲得5門7綱17目22科27屬70種土壤nirS型反硝化菌群信息。采用隨機抽樣方法構建的樣品稀釋曲線(Rarefaction curve),結果如圖1。3個樣地2個月份的樣品稀釋曲線均趨于平坦,表明測序數(shù)據(jù)量合理,且OUT數(shù)目隨恢復年限增加而增多。從各樣地的稀釋曲線在水平方向上跨度范圍來看,SO樣地的nirS型反硝化菌群豐富度最高,而MP樣地最低。此外,ML和SO樣地的稀釋曲線平緩程度以及OUT數(shù)目相似,表明處于恢復后期的熱帶森林群落內(nèi)nirS型反硝化細菌群落豐富度以及物種均勻度相似。

2.2 土壤反硝化微生物群落組成的變化

從門分類水平來看(圖2),不同恢復階段土壤nirS型未分類反硝化細菌門變化極大(1.37% — 94.04%),在已經(jīng)被注釋的nirS型反硝化細菌門中,主要集中于變形菌門(Proteobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、酸桿菌門(Acidobacteria)和放線菌門(Actinobacteria)。變形菌門成為熱帶森林不同恢復階段中的優(yōu)勢門(32.71% — 98.63%),其相對豐度3月表現(xiàn)為MP(98.63%)>ML(68.66%)>SO(32.71%),9月份則表現(xiàn)為ML(79.62%)>MP(72.35%)>SO(60.90%)。此外,綠彎菌門(0.12%—28.3%)和放線菌門(0.54% — 2.31%)均沿恢復年限增加而增加,但酸桿菌門相對豐度表現(xiàn)為恢復初期的ML群落最高(1.09%—11.64%)。

3種不同恢復階段熱帶森林群落中,土壤nirS型反硝化細菌門相對豐度在不同月份間差異顯著(圖2)。與3月份相比,9月份變形菌門在ML、SO群落中出現(xiàn)不同程度增幅(3.56% — 86.18%),表現(xiàn)為SO(52.19倍)>ML(4.82倍)>MP(0.59倍),但MP群落降低了26.64%。此外,各樣地的新檢測出的反硝化細菌門差異較大,如9月份ML群落新檢測出2門(放線菌門和綠彎菌門),其余樣地均新檢測出1門(擬桿菌門)。放線菌門(Actinobacteria)是3個樣地內(nèi)9月份的共有新增反硝化細菌門,相對豐度表現(xiàn)為MP(2.31%)>SO(1.91%)>ML(0.54%)。變形菌門的最高和最低相對豐度均出現(xiàn)在3月份,分別為MP(98.63%)和SO(32.71%)群落。

圖2 不同恢復階段、不同月份間門水平反硝化微生物相對豐度Fig.2 Relative abundance of phylum-level denitrification microorganisms in different months across three recovery stages

從屬分類水平來看(圖3),3種不同群落類型的nirS型反硝化細菌屬相對豐度在不同恢復階段表現(xiàn)差異較大。除未分類細菌屬(0.37% — 94.04%)之外,3個樣地在3月和9月共有的nirS型反硝化細菌屬為：貪銅菌屬(Cupriavidus,2.20% — 60.27%)、脫氯單胞菌屬(Dechloromonas,0.04%—40.67%)、嗜鹽單胞菌屬(Halomonas,0.04%—5.17%)、假單胞菌屬(Pseudomonas,0.76%—21.09%)以及羅思河小桿菌屬(Rhodanobacter,0.02%—34.19%)。除貪銅菌屬的相對豐度表現(xiàn)為沿恢復年限增加而降低外,其余共有反硝化細菌屬在相同月份內(nèi)的相對豐度變化趨勢差異巨大。脫氯單胞菌屬、嗜鹽單胞菌屬和羅思河小桿菌屬在3月份表現(xiàn)為MP>SO>ML,假單胞菌屬表現(xiàn)為ML>SO>MP；而在9月,脫氯單胞菌屬和羅思河小桿菌屬的相對豐度則表現(xiàn)為沿恢復年限增加而增加,嗜鹽單胞菌屬表現(xiàn)為MP>ML>SO,假單胞菌屬則表現(xiàn)為MP>SO>ML。

圖3 不同恢復階段、不同月份間屬水平反硝化微生物相對豐度Fig.3 Relative abundance of genus-level denitrification microorganisms in different months across three recovery stages

與3月相比,9月份各樣地的nirS型反硝化細菌屬種類數(shù)差異較大。其新檢測出的種類數(shù)表現(xiàn)為：SO(19種,0.01% — 2.17%)>MP(13種,0.02%—2.31%)>ML(7種,0.01% — 0.59%)。在各樣地共有的nirS型反硝化細菌屬中,9月ML群落的羅思河小桿菌屬、嗜鹽單胞菌屬、脫氯單胞菌屬和貪銅菌屬的相對豐度分別是3月的473.7、31.1、10.8和1.3倍,SO群落的羅思河小桿菌屬和貪銅菌屬則為16.9和7.9倍,而MP群落的假單胞菌屬則為16.7倍；同一樣地內(nèi)的共有反硝化菌屬相對豐度在9月表現(xiàn)出不同程度的降低,如MP群落的脫氯單胞菌屬、ML群落的假單胞菌屬的相對豐度僅為3月的0.04和0.27。

2.3 土壤nirS型反硝化微生物α多樣性的樣地差異

如表1所示,在相似性水平為97%下,3種不同恢復階段熱帶森林中土壤反硝化微生物多樣性表現(xiàn)為9月(濕季)高于3月(干季)。Shannon多樣性指數(shù)隨恢復年限增加而增加(1.65—3.93),且各樣地間差異性顯著(P<0.05),9月份MP、ML、SO樣地的Shannon指數(shù)分別是3月份的2.28、2.20和1.48倍；Simpson多樣性指數(shù)隨恢復年限增加而降低(0.04—0.28),除3月的SO樣地和9月的MP樣地與其它樣地差異性顯著外(P<0.05),其余相同月份間差異不顯著；Chao指數(shù)則表現(xiàn)為：3月份SO群落最低,ML群落最高,而9月份則隨恢復年限增加而增加,其變化范圍在25—365之間。

表1 不同恢復階段熱帶森林土壤nirS型反硝化微生物α多樣性指數(shù)

熱帶森林不同恢復階段和月份對土壤nirS型反硝化微生物的影響均達極顯著水平(表2)。由表2可知,恢復年限和月份變化(3月到9月)均對土壤nirS型反硝化細菌的群落結構及多樣性特征產(chǎn)生顯著影響(P<0.01),且恢復年限與月份變化也會對土壤nirS型反硝化細菌共同產(chǎn)生影響(P<0.01)。

表2 恢復階段和取樣時間對土壤nirS型反硝化微生物Shannon指數(shù)影響的雙因素方差分析

2.4 土壤理化性質與反硝化微生物的關系

3種不同恢復階段熱帶森林土壤理化指標的測定結果見表3。由表可知,土壤含水率、全氮、水解氮、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮、微生物量碳及土壤有機碳隨恢復年限增加而增加,且不同樣地差異性顯著(P<0.05),盡管SO群落的pH值最高,但與ML群落差異不顯著,而土壤溫度表現(xiàn)為隨恢復年限增加而降低,土壤容重表現(xiàn)為ML群落最高,MP群落最低。

表3 不同恢復階段熱帶森林土壤理化性質特征

熱帶森林不同恢復階段土壤nirS型反硝化微生物群落α多樣性指數(shù)與土壤環(huán)境因子的相關分析結果見表4。其中,Shannon指數(shù)與土壤含水率、溫度、微生物量碳、土壤全氮、水解氮、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮呈極顯著正相關(P<0.01),而Simpson指數(shù)與土壤易氧化碳、全氮、水解氮、銨態(tài)氮及硝態(tài)氮呈極顯著負相關(P<0.01)。Chao指數(shù)與土壤微生物量碳、全氮及硝態(tài)氮呈極顯著正相關(P<0.01),與土壤pH、有機碳、水解氮及銨態(tài)氮呈顯著正相關(P<0.05)。

表4 土壤nirS型反硝化微生物群落α多樣性指數(shù)與土壤理化性質間的關系

采用主成分分析(PCA)對影響熱帶森林不同恢復階段土壤nirS型反硝化細菌α多樣性指數(shù)的理化因子進行分析,其結果如圖4。PC1和PC2的主成分累積解釋量為67.32%,Shannon指數(shù)與各土壤理化指標的夾角排序為：土壤硝態(tài)氮<土壤微生物量碳<全氮<易氧化碳<含水率<水解氮

圖4 土壤反硝化微生物α多樣性指數(shù)與土壤理化因子的主成分分析(PCA)Fig.4 PCA of alpha diversity index of soil denitrification microbial community with soil physicochemical propertiesShannon：Shannon指數(shù)；Simpson：Simpson指數(shù)；Chao：Chao指數(shù)；SOC：土壤有機碳 Soil organic carbon；MBC：微生物生物量碳 Microbial biomass carbon；TN：全氮 Total nitrogen；ROC：易氧化碳 Readily oxidizable organic carbon；HN：水解氮 Hydrolyzable 銨態(tài)氮 Ammonium 硝態(tài)氮 Nitrate nitrogen；SW：土壤水分 Soil water；ST：土壤溫度 Soil temperature；BD：容重 Bulk density；1—9：樣方數(shù)據(jù)平均值Average of sample plots

3 討論

3.1 熱帶森林恢復對nirS型反硝化細菌群落結構的影響

3種不同恢復階段的熱帶森林土壤nirS型反硝化細菌群落結構差異顯著。變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和放線菌門(Actinobacteria)成為該熱帶森林區(qū)域的優(yōu)勢門,且變形菌門的相對豐度變化范圍較寬(32.71% — 98.63%),這一結果與Gu[20]及Zhao[4]等人的研究結果相似。變形菌門在土壤生態(tài)系統(tǒng)中廣泛存在,其拷貝數(shù)在總克隆文庫中占比高達25- 40%[21],且一些厭氧異養(yǎng)變形菌相對豐度會隨土壤氧氣濃度的周期波動出現(xiàn)顯著變化[2]。本研究中,變形菌門、酸桿菌門的相對豐度表現(xiàn)為恢復初期高于恢復后期。這可能與變形菌門和酸桿菌門屬于寡營養(yǎng)型反硝化微生物有關,它們在養(yǎng)分有效性較低的環(huán)境中反而具有較高的相對豐度[22]；而綠彎菌門和放線菌門可能屬于富營養(yǎng)型反硝化細菌門,處于恢復后期的高檐蒲桃群落具有充足的有效養(yǎng)分,因此其在恢復后期具有較高的相對豐度。此外,本研究區(qū)在3月期間會出現(xiàn)周期性的濃霧(從夜晚持續(xù)至第二天早上),這使得研究區(qū)內(nèi)的土壤相對濕度保持在一個相對穩(wěn)定水平[23],加之處于恢復初期的群落植被結構和蓋度比處于恢復后期更單一,無法維持一個相對穩(wěn)定的土壤含水率及養(yǎng)分有效性水平,使得反硝化細菌相對豐度出現(xiàn)激烈波動(如變形菌門)。9月份新檢測出的放線菌門表現(xiàn)為恢復中后期高于恢復初期,可能是因為放線菌門對水分和溫度更為敏感,在水分充足的月份具有更高的豐度[24],且處于恢復后期的土壤養(yǎng)分有效性更高,最終導致高溫濕潤的9月比低溫干燥的3月檢測出更多的放線菌門。

與3月份相比,9月份各樣地的nirS型反硝化細菌屬種類數(shù)出現(xiàn)不同程度的增幅。貪銅菌屬、脫氯單胞菌屬、嗜鹽單胞菌屬、假單胞菌屬及羅思河小桿菌屬成為3個樣地內(nèi)的優(yōu)勢屬(圖3)。這一結果與陳秀波[15]等人的研究結果相同,但其采用的是nosZ型引物,這說明上述幾種反硝化細菌屬不但具有亞硝酸還原酶,同時也具有氧化亞氮還原酶(Nos酶,一種能將N2O氣體還原成N2的酶)。此外,除貪銅菌屬的相對豐度在3月、9月表現(xiàn)為沿恢復年限增加而降低外,其余反硝化細菌屬的相對豐度變化趨勢各不相同,如9月的脫氯單胞菌屬和羅思河小桿菌屬在沿恢復年限增加而增加,3月則表現(xiàn)為MP>SO>ML；9月新檢測出的反硝化細菌種數(shù)表現(xiàn)為SO(19種)>MP(13種)>ML(7種),說明這些反硝化細菌屬的相對豐度對樣地及季節(jié)變化(干濕季)較為敏感。處于恢復初期的ML群落內(nèi)土壤nirS型反硝化細菌相對豐度變化最大,而處于恢復后期的SO群落變化相對較小,說明恢復年限對nirS型反硝化細菌的群落結構造成顯著影響。洪璇[25]、Winter[26]等人認為,nirS型反硝化細菌群落結構會隨著季節(jié)及所處的生境出現(xiàn)顯著變化,且與生境中的含氮化合物的濃度密切相關。3個樣地內(nèi)均發(fā)現(xiàn)的羅思河小桿菌屬、假單胞菌屬、脫氯單胞菌屬和貪銅菌屬等nirS型反硝化細菌屬,也在河口區(qū)[25]、水稻土[27]、湖泊底泥及森林土壤[13]中被發(fā)現(xiàn),說明這些nirS型反硝化細菌屬的生態(tài)幅較廣。因此,熱帶森林區(qū)域季節(jié)的變換,會使得土壤nirS型反硝化細菌群落的豐富度隨生態(tài)類型出現(xiàn)顯著差異。

3.2 熱帶森林恢復對nirS型反硝化細菌群落多樣性的影響

熱帶森林的恢復過程對nirS型反硝化細菌群落多樣性產(chǎn)生重要影響。隨著熱帶森林恢復年限的增加,土壤nirS型反硝化微生物群落多樣性也逐漸增加,9月份MP、ML、SO樣地的Shannon指數(shù)分別是3月份的2.28、2.20和1.48倍,說明恢復年限越高,其Shannon指數(shù)變化越小,nirS型反硝化微生物群落結構就越趨于穩(wěn)定。隨著恢復年限增加,植被蓋度及郁閉度會逐漸增加,凋落物數(shù)量及質量也逐年累積,同時土壤溫度及濕度等環(huán)境因子趨于穩(wěn)定,在累積大量養(yǎng)分的同時刺激了微生物活性[14,28],使得高檐蒲桃群落的nirS型反硝化細菌的群落多樣性最高,而白背桐群落最低。此外,處于恢復后期的崖豆藤群落和高檐蒲桃群落的稀釋曲線位置及寬度接近,說明隨著恢復年限的增加,熱帶森林群落土壤反硝化細菌的群落結構及多樣性趨于相似。處于恢復后期的2個樣地的土壤pH值及土壤有機碳、全氮及硝態(tài)氮含量相近,這為nirS型反硝化微生物提供了較為相似土壤理化環(huán)境,從而使得恢復后期的崖豆藤群落和高檐蒲桃群落的nirS型反硝化微生物群落結構及多樣性趨于相似。但土壤有機碳、全氮及硝態(tài)氮等養(yǎng)分濃度仍存在差異,最終使得恢復后期的兩個群落內(nèi)的反硝化微生物具有一定的差異性。土壤pH、有機碳、全氮及硝態(tài)氮含量會刺激土壤養(yǎng)分有效性,顯著影響熱帶森林土壤nirS型反硝化細菌的群落多樣性[29- 31]。因此,熱帶森林恢復過程中形成不同的植物群落,會改變?nèi)郝渫寥览砘h(huán)境,最終影響土壤nirS型反硝化細菌的群落多樣性。

取樣月份不同對不同恢復階段的土壤nirS型反硝化細菌多樣性影響顯著。本研究表明,隨恢復年限增加,9月份各樣地Shannon指數(shù)比3月份平均增加將近2倍,且不同樣地增加倍數(shù)差異顯著,說明月份變化也會對不同恢復階段的土壤nirS型反硝化細菌多樣性造成顯著影響。研究表明,西雙版納熱帶森林中干季(3月)的溫度及降雨量顯著低于濕季(9月),使得濕季微生物分解底物的有效性顯著高于干季[23,32]。此外,熱帶森林中土壤溫度年均變化不大,但土壤含水率會隨季節(jié)出現(xiàn)顯著變化,這導致土壤氧分壓隨含水率出現(xiàn)周期性波動,刺激土壤反硝化作用,促進土壤nirS型反硝化細菌的活性[33]。另一方面,隨著恢復年限的增加,各種土壤碳(如微生物量碳、易氧化碳)、氮(如銨氮、硝氮)含量會在濕季(9月)大量積累,水分過多導致根系分泌物浸出也會使得土壤積累更多的含碳、氮類物質,使得即使在干季也能保持較高的反硝化細菌多樣性[34]；而在濕季,適宜的溫度和水分使得微生物繁殖速率加快,最終使得9月的nirS型反硝化細菌多樣性高于3月。因此,熱帶森林季節(jié)變化改變了不同恢復階段的土壤含水率的時間分配,進而影響微生物棲息的土壤微環(huán)境,最終對土壤nirS型反硝化細菌產(chǎn)生重要影響。

3.3 熱帶森林恢復過程中土壤理化環(huán)境變化對nirS型反硝化細菌的影響

本研究表明,土壤含水率、全氮、水解氮、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮、微生物量碳及土壤有機碳隨恢復年限增加而增加,且不同樣地差異性顯著(P<0.05),這與nirS型反硝化微生物的Shannon指數(shù)變化趨勢一致,且與Shannon指數(shù)呈顯著正相關,說明熱帶森林不同恢復階段土壤理化性質變化對土壤nirS型反硝化細菌群落結構及多樣性產(chǎn)生重要影響。隨著熱帶森林恢復年限增加,植物枯枝落葉的輸入量和積累量增加,處于恢復后期的熱帶森林土壤積累了更多的活性C、N養(yǎng)分,為反硝化細菌的生長和繁殖提供了更適宜的環(huán)境[16,20]。不同林型的枯落物的輸入數(shù)量及質量,會改變土壤理化性質特征,且反硝化功能微生物與土壤理化環(huán)境因子間也存在著復雜的交互作用[13],最終使得處于不同恢復時長的群落土壤反硝化細菌的豐度和結構[20,23,32]出現(xiàn)顯著差異。而處于恢復前期的熱帶森林群落,植被覆蓋度低,群落內(nèi)土壤溫度、水分及土壤C、N養(yǎng)分波動劇烈,最終使得土壤反硝化微生物的活性低于恢復后期的熱帶森林群落。

4 結論