濾紙搭橋法在食品檢驗(yàn)中對(duì)沙門菌血清型鑒定的應(yīng)用探究

吳欣欣，程 媛，余土養(yǎng)，潘梅珍

婺源縣疾病預(yù)防控制中心 (上饒 333200)

沙門菌屬是引起食物中毒的重要病原菌，該菌的株型繁多，迄今世界上已鑒定出2 500多個(gè)不同的沙門菌血清型，分屬于近50個(gè)血清組[1]。我國(guó)已檢出的血清型數(shù)至少320個(gè)，食物中毒檢出率最高的依次是腸炎沙門菌、鼠傷寒沙門菌、德?tīng)柋吧抽T菌、都柏林沙門菌四個(gè)血清型[2]。因此正確鑒定沙門菌的血清型對(duì)確定人和動(dòng)物沙門菌病的感染源及降低沙門菌病發(fā)病率有重要的意義。為提高沙門菌血清分型的準(zhǔn)確性，在GB 4789.4—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門氏菌檢驗(yàn)》的基礎(chǔ)上[3]，對(duì)用簡(jiǎn)易平板法無(wú)法準(zhǔn)確確定血清分型的沙門菌用濾紙搭橋法[4,5]做進(jìn)一步的鞭毛抗原誘導(dǎo)及血清型鑒定。

1 材料與方法

1.1 主要材料

血平板，批號(hào)20190927，有效期20191226，青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；半固體培養(yǎng)基，批號(hào)20180423，有效期3年，青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；沙門氏菌屬診斷血清，批號(hào)20190101，有效期20210106， 寧波天潤(rùn)生物藥業(yè)有限公司；生理鹽水，本中心實(shí)驗(yàn)室自配；沙門菌菌株， 菌株均分離于2015～2019年婺源縣疾病預(yù)防控制中心食品污染物和有害因素風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)的食品(生畜肉、即食食品、預(yù)制水產(chǎn)品、外賣等)，所有菌株均已做生化鑒定，同時(shí)已用診斷血清作玻片凝集試驗(yàn)，確定了O群和一個(gè)H位相，并且另一H位相暫時(shí)無(wú)法確定。

1.2 主要儀器與設(shè)備

無(wú)菌手術(shù)刀；無(wú)菌小鑷子；0.5 cm×1.5 cm無(wú)菌濾紙(用普通濾紙剪成所要求尺寸后包裝好經(jīng)高壓滅菌后使用)；LRH-150型生化培養(yǎng)箱，36 ℃±1 ℃，上海一恒科技股份有限公司；BSC-1500Ⅱ型生物安全柜，過(guò)濾效率>99.999%，山東鑫貝西生物技術(shù)股份有限公司；微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備。

1.3 方法

1.3.1簡(jiǎn)易平板法[3]

將0.35%～0.40%半固態(tài)瓊脂平板烘干表面水分，挑取待檢菌株相應(yīng)的抗血清一環(huán)，滴在半固態(tài)平板表面，放置片刻，待血清吸收到瓊脂內(nèi)，在血清部位的中央點(diǎn)種待檢菌株，36 ℃±1 ℃培養(yǎng)24～48 h，取成蔓延生長(zhǎng)的菌苔邊緣菌落進(jìn)行血清型鑒定。通常要進(jìn)行數(shù)次誘導(dǎo)培養(yǎng)，確定另一相H位相，如經(jīng)多次誘導(dǎo)仍未出現(xiàn)另一位相，而且誘導(dǎo)方法可靠，則應(yīng)考慮此菌株可能是單相菌[2]。

1.3.2濾紙條搭橋法[4,5]

用無(wú)菌手術(shù)刀沿血平板中間線切除一條0.5～1.0 cm寬的培養(yǎng)基，將血平板上的培養(yǎng)基分成沒(méi)有接觸點(diǎn)的A、B 2個(gè)獨(dú)立區(qū)域，用無(wú)菌小鑷子夾取2根濾紙條架于 2個(gè)獨(dú)立區(qū)域之間，形成A、B區(qū)域間兩條相距2 cm的“橋”。

在濾紙條中間滴加待檢菌株相應(yīng)的因子血清10～15 μL，同時(shí)用接種環(huán)取少量菌苔輕輕涂抹在A區(qū)濾紙條邊緣的血培養(yǎng)上，36 ℃±1 ℃倒置培養(yǎng)24～48 h，利用濾紙條的吸附作用，菌落沿濕潤(rùn)濾紙條向另一端蔓延生長(zhǎng)，途中已知H抗原被濾紙條上的抗血清吸附，取B區(qū)新生長(zhǎng)的菌苔邊緣菌落進(jìn)行血清型鑒定。

2 結(jié)果與討論

2.1 簡(jiǎn)易平板法及菌株培養(yǎng)

圖1為加因子血清Hd后的半固體培養(yǎng)基平板，待血清吸收到瓊脂內(nèi)，在血清部位的中央點(diǎn)種已知O抗原4,5,12和H抗原d的待分型沙門菌，于37 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)48 h。圖2為培養(yǎng)48 h后的半固體培養(yǎng)基平板，菌落呈片狀生長(zhǎng)，取邊緣菌落玻片凝集試驗(yàn)，未發(fā)現(xiàn)可凝集的H血清，可判斷此沙門菌的抗原結(jié)構(gòu)為4,5,12:d:-。

圖1 加因子血清后的半固體培養(yǎng)基平板

圖2 誘導(dǎo)培養(yǎng)48 h后的半固體培養(yǎng)基平板

2.2 濾紙條搭橋及菌株培養(yǎng)

圖3為已分區(qū)、加濾紙條搭橋后的血平板，A區(qū)濾紙條邊緣分別接種待檢沙門菌，于37 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)48 h。1號(hào)濾紙條A區(qū)接種已知O抗原4,5,12和H抗原d的待分型沙門菌，濾紙條中間滴加Hd；2號(hào)濾紙條A區(qū)接種已知O抗原4,5,12和H抗原1,2的待分型沙門菌，濾紙條中間滴加H1,2；3號(hào)濾紙條A區(qū)接種已知O抗原4,5,12和H抗原i的待分型沙門菌，濾紙條中間滴加Hi；4號(hào)濾紙條A區(qū)接種已知O抗原4,5,12和H抗原i的待分型沙門菌，濾紙條中間滴加Hi。

圖3 已分區(qū)、加濾紙條搭橋的血平板

圖4為誘導(dǎo)培養(yǎng)48 h后的血平板，可以看出1、2號(hào)濾紙條B區(qū)有菌落生長(zhǎng)，取濾紙條邊緣菌落做玻片凝集試驗(yàn)，1號(hào)濾紙條B區(qū)菌落H抗原1,2凝集，抗原結(jié)構(gòu)為4,5,12:d:1,2；2號(hào)濾紙條B區(qū)菌落H抗原e,h凝集，抗原結(jié)構(gòu)為4,5,12:e,h:1,2；3、4號(hào)濾紙條B區(qū)無(wú)菌落生長(zhǎng)，可判斷3、4號(hào)A區(qū)接種的待分型沙門菌抗原結(jié)構(gòu)均為4,5,12:i:-。

圖4 誘導(dǎo)培養(yǎng)48 h后的血平板

2.3 血清型鑒定結(jié)果

表1 食品中檢出沙門菌的血清型鑒定結(jié)果

依據(jù)世界衛(wèi)生組織國(guó)際沙門菌中心在2007年公布的第九版White-Kauffmann-Le Minor 抗原表(簡(jiǎn)稱K-W表)，對(duì)食品中檢出沙門菌進(jìn)行血清型確定，血清型鑒定結(jié)果如表1所示。其中，鼠傷寒沙門菌、腸炎沙門菌、里森沙門菌、都柏林沙門菌用簡(jiǎn)易平板法和濾紙條搭橋法檢出相同的抗原結(jié)構(gòu)，查K-W表可確定里森沙門菌，腸炎沙門菌，都柏林沙門菌。同時(shí)K-W表上顯示鼠傷寒沙門菌存在i單相變種，故也可以確定鼠傷寒沙門菌。另外，斯坦利沙門菌、圣保羅沙門菌、維爾肖沙門菌和病牛沙門菌的菌株在瓊脂斜面上經(jīng)三次傳代后用簡(jiǎn)易平板法仍不能誘導(dǎo)出未知H抗原，同時(shí)在K-W表上未找到與其抗原結(jié)構(gòu)匹配的單相菌，不能準(zhǔn)確分型，但是經(jīng)濾紙條搭橋法能快速得到H抗原結(jié)構(gòu)，準(zhǔn)確確定另一H位相。由以上結(jié)果可以看出，濾紙條搭橋法與簡(jiǎn)易平板法相比較，傳代次數(shù)更少，所耗時(shí)間更為短暫，且血清分型結(jié)果更為準(zhǔn)確。

3 結(jié)論

研究表明，世界上已鑒定出的沙門菌血清型數(shù)有2 500多個(gè)，能夠感染人類的致病菌株主要集中于4個(gè)血清組(即血清組A、B、C和D)，其中傷寒沙門菌、乙型副傷寒沙門菌、丙型副傷寒沙門菌、鼠傷寒沙門菌、嬰兒沙門菌、腸炎沙門菌、豬霍亂沙門菌和雞沙門菌等8種血清型是最常見(jiàn)的感染人體和禽畜類動(dòng)物的菌型[1,5]。我國(guó)已檢出的血清型數(shù)至少320個(gè)，其中引起食物中毒檢出率最高的依次是腸炎沙門菌、鼠傷寒沙門菌、德?tīng)柋吧抽T菌、都柏林沙門菌四個(gè)血清型，其次為明斯特沙門菌、里森沙門菌和斯坦利沙門菌[2,6]。故正確鑒定沙門菌的血清型對(duì)確定人和動(dòng)物沙門菌病的感染源及降低沙門菌病發(fā)病率有重要的意義。

隨著分子分型技術(shù)的發(fā)展，采用多重PCR、脈沖場(chǎng)凝膠電泳、液相懸浮芯片技術(shù)等越來(lái)越多的方法可以快速準(zhǔn)確的對(duì)沙門菌進(jìn)行血清分型[7-11]。但是在實(shí)際檢驗(yàn)工作中，大部分縣級(jí)基層實(shí)驗(yàn)室尚不能達(dá)到分子分型技術(shù)要求，運(yùn)用血清分型仍是鑒定沙門菌最廣泛、最基礎(chǔ)的分型方法。由于大多數(shù)沙門菌具有兩個(gè)或者更多的位相，通常位相之間能發(fā)生可逆性變異，一般不能直接確定所有位相，要用位相變異試驗(yàn)方法通過(guò)已知位相確定其另一位相。目前，應(yīng)用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.4—2016中的血清學(xué)鑒定方法，多數(shù)能做到血清分型，但是仍有部分沙門菌常遇到凝集效價(jià)不高、結(jié)果不易判斷、傳代多次依然不能準(zhǔn)確分型。本實(shí)驗(yàn)是在國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.4—2016血清學(xué)鑒定方法的基礎(chǔ)上，對(duì)結(jié)果仍不明確的菌株采用濾紙條搭橋法進(jìn)行進(jìn)一步鞭毛誘導(dǎo)及鑒定，雖然試驗(yàn)菌株只有31株，依據(jù)不夠充足，但已知結(jié)果表明濾紙條搭橋法對(duì)沙門菌的鞭毛抗原誘導(dǎo)效果更佳，耗時(shí)更短，準(zhǔn)確性更高，在沙門菌血清分型實(shí)際檢驗(yàn)工作中可以把濾紙條搭橋法作為國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.4—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門氏菌檢驗(yàn)》方法的補(bǔ)充。