蠶絲蛋白肽對(duì)S180荷瘤小鼠免疫調(diào)節(jié)作用的研究

徐姍 杜雙雙 閻昭②

肽類藥物在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用日益廣泛，近年來(lái)多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，多種來(lái)源于自然界的生物活性肽以及人工合成的多肽具有免疫調(diào)節(jié)作用，且其可通過(guò)提高機(jī)體的免疫功能發(fā)揮抗腫瘤作用［1］。研究發(fā)現(xiàn)，免疫活性肽可同時(shí)增強(qiáng)機(jī)體特異性及非特異性免疫調(diào)節(jié)能力，如促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖，提高巨噬細(xì)胞的吞噬功能，調(diào)節(jié)體液中免疫細(xì)胞因子的分泌水平等，進(jìn)而提高機(jī)體自身防御外界病原體侵襲的能力，以直接或間接的方式發(fā)揮抗腫瘤作用［2-3］。

蠶絲蛋白肽（silk fibroin peptide，SFP）是一種利用水解提取工藝從桑蠶絲中提取的生物活性肽。前期研究結(jié)果證實(shí)SFP 濃縮液是分子量集中在8～10 kd的混合溶液，主要包含胱氨酸、甘氨酸、絲氨酸及丙氨酸等氨基酸，其中甘氨酸的含量最高。有研究表明蠶絲蛋白肽具有抗氧化活性，且可修復(fù)以及預(yù)防實(shí)驗(yàn)動(dòng)物過(guò)氧化肝損傷，該作用可能與蠶絲蛋白肽減少過(guò)氧化物產(chǎn)生、增加抗氧化酶活性相關(guān)［4］。另有研究發(fā)現(xiàn)，蠶絲蛋白肽可直接抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、調(diào)控其凋亡并阻滯其細(xì)胞周期，還可提高機(jī)體清除氧自由基的能力、增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能，從而減少腫瘤的發(fā)生［5］。因此，本研究旨在探索蠶絲蛋白肽在腫瘤環(huán)境下的免疫調(diào)節(jié)作用，為其進(jìn)一步的臨床應(yīng)用奠定藥理學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物與主要試劑 研究藥物為蠶絲蛋白肽溶液，由清華大學(xué)趙紅平課題組制備，濃度為100 mg/mL。陽(yáng)性對(duì)照藥物為胸腺五肽注射液（1 mL：10 mg），由海南中和藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。RPMI-1640 培養(yǎng)基（生產(chǎn)商Gibco）；胎牛血清（生產(chǎn)商Corning）；胰蛋白酶（生產(chǎn)商Gibco）；青霉素-鏈霉素（購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；刀豆蛋白A（concanavalin A，Con A；購(gòu)自北京索萊寶生物技術(shù)有限公司）；綿羊紅細(xì)胞（購(gòu)自北京博爾西科技有限公司）；鼠抗鼠CD3e抗體/兔抗鼠CD4 抗體/兔抗鼠CD8a 抗體（BD）；Th1/Th2 CBA細(xì)胞因子試劑盒（BD）。

1.1.2 細(xì)胞系與動(dòng)物 本研究建模所用細(xì)胞株為小鼠惡性肉瘤細(xì)胞株S180，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院昆明細(xì)胞庫(kù)。建模所用小鼠為SPF 級(jí)Balb/c 小鼠（4～5 w，18±2 g，雌性，30只），購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源研究所（國(guó)家嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種子中心），飼養(yǎng)于SPF 環(huán)境中，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（蘇）2018 0008。

1.1.3 主要儀器 Celltac E血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（購(gòu)自上海光電醫(yī)用電子儀器有限公司）；多功能酶標(biāo)儀（Bio Tek Epoch）；萬(wàn)能正置熒光顯微鏡及成像系統(tǒng)（Olym?pus）；流式細(xì)胞儀（BD）。

1.2 方法

1.2.1 小鼠S180皮下移植瘤模型的構(gòu)建 構(gòu)建小鼠S180腹水瘤模型，收集S180細(xì)胞懸液調(diào)整濃度至5×105個(gè)/mL，吸取0.2 mL 注射至小鼠腹腔，約5 天后可見(jiàn)小鼠腹部隆起，說(shuō)明小鼠S180 腹水瘤模型構(gòu)建成功。待小鼠腹水瘤模型構(gòu)建成功后脫頸處死小鼠，每只模型小鼠可取約1.5 mL腹水，收集后用3倍生理鹽水進(jìn)行稀釋，調(diào)整為細(xì)胞濃度1×107個(gè)/mL 的S180單細(xì)胞懸液進(jìn)行皮下注射，3天后小鼠腹股溝處可見(jiàn)皮丘樣瘤塊（約2 mm×2 mm），表明模型構(gòu)建成功。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組與給藥 建模成功后，約5 天后，待腫瘤生長(zhǎng)至30～50 mm3時(shí)，選取腫瘤體積形態(tài)相近的24 只小鼠按體質(zhì)量分層隨機(jī)分為4 組，每組6只，分別為：空白對(duì)照組（生理鹽水）、陽(yáng)性對(duì)照藥胸腺五肽組（TP-5，1 mg/kg）、蠶絲蛋白肽低劑量組（SFP-L，300 mg/kg）和蠶絲蛋白肽高劑量組（SFP-H，600 mg/kg）。本研究采取腹腔注射的方式進(jìn)行給藥，每天給藥1次，連續(xù)給藥28天。

1.2.3 體內(nèi)抗腫瘤活性評(píng)價(jià) 連續(xù)給藥期間每天記錄小鼠體質(zhì)量，隔2天測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑及短徑并計(jì)算其體積。給藥結(jié)束次日，脫頸處死小鼠，剝離瘤塊稱重記錄并計(jì)算抑瘤率。腫瘤體積（mm3）=腫瘤長(zhǎng)徑×腫瘤短徑2/2。抑瘤率（%）=（對(duì)照組小鼠瘤塊的平均重量-實(shí)驗(yàn)組小鼠瘤塊的平均重量）/對(duì)照組小鼠瘤塊的平均重量×100%。

1.2.4 免疫臟器指數(shù)計(jì)算 停藥次日，對(duì)小鼠稱重后脫頸處死，分離其脾臟及胸腺進(jìn)行稱重，計(jì)算免疫臟器指數(shù)。脾臟（胸腺）指數(shù)=脾臟（胸腺）重量（mg）/體質(zhì)量（g）。

1.2.5 脾淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 本研究采用MTT法評(píng)價(jià)SFP對(duì)脾淋巴細(xì)胞增殖的影響。脫頸處死小鼠后取出脾臟，剪去筋膜和結(jié)締組織，置于200目細(xì)胞篩上進(jìn)行研磨，不斷加入PBS直至脾臟發(fā)白并不斷吹打研磨液使細(xì)胞分散。過(guò)濾脾淋巴細(xì)胞研磨液并收集，1 000 rpm離心5 min，棄上清，PBS重懸清洗2～3遍。根據(jù)細(xì)胞沉淀加入適量紅細(xì)胞裂解液，室溫裂解15 min后，1 000 rpm離心5 min，棄上清，PBS清洗后，用RPMI-1640培養(yǎng)基重懸為單細(xì)胞懸液于4℃暫存。

取適量脾淋巴細(xì)胞懸液用RPMI-1640調(diào)整細(xì)胞濃度至5×105個(gè)/mL并接種于96孔板。每個(gè)樣品設(shè)6個(gè)復(fù)孔，每孔加入100 μL 的細(xì)胞懸液，對(duì)照組為RP?MI-1640 培養(yǎng)基。上邊3 個(gè)復(fù)孔為含5 μg/mL Con A的培養(yǎng)基，下邊3 個(gè)復(fù)孔為100 μL 培養(yǎng)基，于37℃，5%CO2的條件下孵育72 h，避光下每孔加入20 μL MTT，繼續(xù)孵育4 h 后吸除上清液，每孔加入150 μL DMSO，于搖床上緩慢搖至紫色結(jié)晶充分溶解。用酶標(biāo)儀在490 nm處測(cè)得每孔的吸光度值（OD），計(jì)算淋巴細(xì)胞的刺激指數(shù)。淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)（SI）=（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白對(duì)照孔OD值）/（對(duì)照孔OD值-空白對(duì)照孔OD值）。

1.2.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞亞群的比例 調(diào)整脾淋巴細(xì)胞懸液濃度為1×106～1×107個(gè)/mL。于4℃下1 000 rpm離心5 min棄上清液，預(yù)冷PBS清洗2遍，用200 μL PBS 重懸細(xì)胞并進(jìn)行分組標(biāo)記?？瞻讓?duì)照組：分為5 管做單克隆抗體標(biāo)記：1）僅脾淋巴細(xì)胞懸液，不做抗體標(biāo)記；2）僅加PerCP-Cy 鼠抗CD3e標(biāo)記；3）僅加FITC 兔抗CD4 標(biāo)記；4）僅加PE 鼠抗CD8a；5）3 種抗體同時(shí)標(biāo)記。實(shí)驗(yàn)組：每個(gè)樣品均進(jìn)行3種抗體標(biāo)記。標(biāo)記好的樣品室溫避光孵育30 min，4℃，1 000 rpm 離心5 min，棄上清，預(yù)冷PBS 清洗2遍，用200 μL PBS 重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，Cell?quest軟件獲取細(xì)胞，分析數(shù)據(jù)。

1.2.7 血清溶血素含量測(cè)定 用無(wú)菌生理鹽水將綿羊紅細(xì)胞（sheep red blood cells，SRBC）（4%）稀釋成0.2%細(xì)胞懸液，荷瘤小鼠在停藥后腹腔注射0.2 mL的0.2%SRBC 細(xì)胞懸液，免疫4～5 天后，摘眼球取血收集后于室溫靜置3～4 h。待血液凝固與管壁剝離，血清充分析出，3 000 rpm 室溫離心10 min，收集血清。用生理鹽水將血清倍比稀釋至1、2、4、8倍，于微量血凝實(shí)驗(yàn)板中每孔加入100 μL 不同稀釋度的血清，再加入100 μL 0.5%SRBC 懸液混勻，每個(gè)樣品設(shè)置6 個(gè)復(fù)孔，于37℃，5%CO2中孵育3 h，觀察血球凝集水平，進(jìn)而判斷血清抗體水平。

1.2.8 流式液相多重蛋白定量技術(shù)（CBA）測(cè)免疫細(xì)胞因子 血清的制備同上述1.2.7。取標(biāo)準(zhǔn)品用2 mL稀釋液重懸作為最高濃度標(biāo)準(zhǔn)品，而后進(jìn)行梯度稀釋（1:2，1:4，1:8，1:16，1:32，1:64，1:128，1:256）。每管中均加入5 種微球各10 μL，充分斡旋確保微球混合均勻防止沉淀，并對(duì)樣本進(jìn)行稀釋。待測(cè)實(shí)驗(yàn)管分為標(biāo)準(zhǔn)品、樣品以及陰性對(duì)照管，分別做好標(biāo)記，每個(gè)流式管中加入50 μL混合的捕獲微球再加入50 μL梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品/待測(cè)樣品（陰性對(duì)照管不加標(biāo)準(zhǔn)品/樣品），最后加入50 μL 的PE 檢測(cè)試劑，室溫避光孵育3 h。每管加入1 mL洗液，200 g離心5 min，棄上清，每管加入300 μL洗液重懸微球，上機(jī)檢測(cè)。

1.2.9 小鼠碳粒廓清指數(shù)檢測(cè) 停藥次日，對(duì)小鼠進(jìn)行稱重并記錄。取適量印度墨汁用生理鹽水稀釋3～4倍后向小鼠眼內(nèi)眥靜脈叢注射稀釋墨汁0.1 mL/10 g。于注射后第2 min和第10 min取血2滴于6 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，立即移取20 μL至2 mL 0.1%碳酸鈉溶液中震蕩搖勻，避免血液凝固。吸取200 μL加入到96孔板中，每個(gè)樣品設(shè)6個(gè)復(fù)孔，0.1%碳酸鈉溶液作為空白對(duì)照，用酶標(biāo)儀在680 nm處測(cè)得OD值并計(jì)算碳粒廓清指數(shù)K值和吞噬系數(shù)α值。K=（lgOD1-lgOD2）/（t2-t1）；α=（K1/3×體質(zhì)量）/（肝質(zhì)量+脾質(zhì)量）。α值代表小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的強(qiáng)弱；t值代表注射墨汁后的時(shí)間。

1.2.10 小鼠NK細(xì)胞活性測(cè)定實(shí)驗(yàn) YAC-1為靶細(xì)胞，脾淋巴細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞。吸取4×104個(gè)效應(yīng)細(xì)胞和2×105個(gè)靶細(xì)胞至96 孔板中。靶細(xì)胞對(duì)照孔只含有YAC-1 單細(xì)胞，效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照孔僅含有脾淋巴細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)孔加脾淋巴細(xì)胞和靶細(xì)胞各100 μL，空白對(duì)照組加200 μL 1640 培養(yǎng)基，每組設(shè)6 個(gè)復(fù)孔，置于37℃，5%CO2孵箱中孵育4 h，每孔避光加20 μL MTT溶液，繼續(xù)孵育4 h 后吸除上清液，加150 μL DMSO溶液，于搖床中緩慢搖至紫色結(jié)晶完全溶解，全程避光操作。用酶標(biāo)儀在570 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值并計(jì)算NK細(xì)胞的活性。NK細(xì)胞活性（%）=［1-（實(shí)驗(yàn)組OD 值-效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照組OD 值）/靶細(xì)胞對(duì)照孔OD值］×100%。

1.2.11 蘇木精-伊紅（Hematoxylin and Eosin，H&E）染色 將瘤塊浸泡于10%福爾馬林溶液中固定至少24～48 h，送本院病理科由專業(yè)技術(shù)人員制作切片并進(jìn)行染色。在萬(wàn)能正置熒光顯微鏡下觀察腫瘤組織中的腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的數(shù)量、分布情況以及浸潤(rùn)的深度

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。每個(gè)實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以的形式表示。多組間比較采用單因素方差分析（Oneway-ANOVA），兩兩比較選用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 蠶絲蛋白肽對(duì)S180荷瘤小鼠體內(nèi)抗腫瘤作用

SFP通過(guò)腹腔注射連續(xù)給藥28天，將臨床常用的免疫調(diào)節(jié)肽類藥物胸腺五肽（thymopentin 5，TP-5）作為陽(yáng)性對(duì)照藥，記錄給藥期間荷瘤小鼠的腫瘤體積以及體質(zhì)量變化，并在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后計(jì)算抑瘤率。結(jié)果如圖1 所示，相比于對(duì)照組，SFP 可顯著抑制S180鼠肉瘤的體內(nèi)生長(zhǎng)，與陽(yáng)性對(duì)照藥物TP-5 相比具有更高的抑瘤率。給藥期間，各組小鼠均無(wú)行為學(xué)異常且生理狀態(tài)良好，體質(zhì)量均呈穩(wěn)定增長(zhǎng)的趨勢(shì)，SFP 高劑量給藥組的小鼠體質(zhì)量增加趨勢(shì)更為明顯。由此說(shuō)明，SFP對(duì)于S180荷瘤小鼠具有良好的體內(nèi)抗腫瘤活性和安全性，對(duì)小鼠的生命體征無(wú)影響并可能改善其生活狀態(tài)。

2.2 蠶絲蛋白肽對(duì)荷瘤小鼠免疫系統(tǒng)的影響

比較給藥后的免疫臟器指數(shù)（圖2）以及腫瘤組織中淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)程度（圖3）來(lái)評(píng)價(jià)SFP對(duì)荷瘤小鼠免疫系統(tǒng)的影響。結(jié)果表明，高劑量SFP可顯著提高脾臟和胸腺的臟器指數(shù)，低劑量下僅對(duì)脾臟指數(shù)有明顯改善，胸腺的臟器指數(shù)有升高趨勢(shì)，說(shuō)明SFP具有保護(hù)荷瘤小鼠免疫器官的作用，并且可能改善小鼠因腫瘤引起的免疫器官受損、機(jī)體免疫功能退化的現(xiàn)象。H&E染色結(jié)果圖（圖3）所示，TP-5陽(yáng)性對(duì)照組以及SFP低劑量組的荷瘤小鼠腫瘤組織均呈散在且少量的浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞，與空白對(duì)照組無(wú)明顯差異，而在高劑量SFP的作用下，浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞的數(shù)量及聚集程度顯著增加，說(shuō)明SFP有上調(diào)并募集荷瘤小鼠腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞（tumor infiltration lymphocytes，TIL）的作用，且該作用可能具有劑量依賴性，有望進(jìn)一步增強(qiáng)腫瘤微環(huán)境的局部免疫。

圖1 SFP的體內(nèi)抗腫瘤活性及安全性評(píng)價(jià)

圖2 免疫器官臟器指數(shù)（±s，n=6）

2.3 蠶絲蛋白肽對(duì)荷瘤小鼠特異性免疫應(yīng)答的影響

特異性免疫應(yīng)答包括細(xì)胞免疫和體液免疫。細(xì)胞免疫主要由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)，體液免疫主要由B淋巴細(xì)胞介導(dǎo)。本研究首先選取IL-2、IL-4、IL-5、IFN-γ和TNF-α 5種具有免疫調(diào)節(jié)作用且對(duì)T細(xì)胞及B細(xì)胞的增殖分化產(chǎn)生影響的細(xì)胞因子進(jìn)行評(píng)價(jià)，而后利用有絲分裂原Con A作為刺激物，使脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化為淋巴母細(xì)胞，通過(guò)MTT法檢測(cè)T淋巴細(xì)胞的增殖能力并利用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)CD4+T和CD8+T淋巴細(xì)胞亞群進(jìn)行定量，從而初步探索SFP對(duì)荷瘤小鼠細(xì)胞免疫的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4，在SFP 的作用下，荷瘤小鼠的血清中IL-2、IL-4和TNF-α的分泌水平均有所上調(diào)，且在高劑量下具有顯著性差異。說(shuō)明SFP具有一定的促進(jìn)T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞增殖分化和成熟的作用，有望進(jìn)一步增強(qiáng)機(jī)體的特異性免疫應(yīng)答。表1、2及圖5A、B所示結(jié)果顯示，SFP組的淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)均呈顯著增加，說(shuō)明SFP具有促進(jìn)荷瘤小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的能力，且在高劑量下還可顯著提高CD4+T和CD8+T淋巴細(xì)胞亞群的比例，說(shuō)明其確有促進(jìn)T淋巴細(xì)胞分化成熟的能力，從而增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫應(yīng)答。血清溶血素為體液免疫應(yīng)答的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)之一，其檢測(cè)結(jié)果如圖5C所示，各組小鼠的血清溶血素水平無(wú)明顯差異，說(shuō)明SFP對(duì)荷瘤小鼠的抗體生成能力無(wú)明顯影響。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SFP可促進(jìn)荷瘤小鼠的特異性免疫應(yīng)答，且該作用可能主要通過(guò)增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫來(lái)實(shí)現(xiàn)。

2.4 蠶絲蛋白肽對(duì)荷瘤小鼠非特異性免疫應(yīng)答的影響

機(jī)體發(fā)生非特異性免疫應(yīng)答主要依賴于巨噬細(xì)胞的吞噬能力和NK細(xì)胞的殺傷作用。因此，本研究分別測(cè)定這兩種細(xì)胞的活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖6。SFP可顯著提高巨噬細(xì)胞的吞噬系數(shù)α值，說(shuō)明SFP可促進(jìn)巨噬細(xì)胞發(fā)揮吞噬作用。在NK 細(xì)胞的活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)中，高劑量的SFP 具有增強(qiáng)細(xì)胞活力的趨勢(shì)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由此可見(jiàn)，SFP可促進(jìn)荷瘤小鼠非特異性免疫應(yīng)答的發(fā)生，且該作用主要通過(guò)其增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的吞噬能力來(lái)實(shí)現(xiàn)。

圖3 腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞H&E染色結(jié)果

表1 淋巴細(xì)胞刺激指數(shù) （±s，n=6）

表1 淋巴細(xì)胞刺激指數(shù) （±s，n=6）

與空白對(duì)照組相比，**P<0.01；與陽(yáng)性對(duì)照藥物TP-5相比，#P<0.05

組別刺激指數(shù)對(duì)照組1.41±0.88 TP-5 1.53±0.11 SFP（L）1.74±0.12**#SFP（H）1.59±0.07**

圖4 細(xì)胞因子的分泌水平

表2 CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞亞群的比例 （±s，n=6）

表2 CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞亞群的比例 （±s，n=6）

與空白對(duì)照組相比，*P<0.05

組別對(duì)照組TP-5 SFP（L）SFP（H）劑量（mg/kg）-1 300 600 CD4+T淋巴細(xì)胞（%）35.55±2.47 46.00±7.30 39.87±7.26 50.33±0.64*CD8+T淋巴細(xì)胞（%）19.15±0.21 27.97±5.91 23.97±4.20 31.57±1.72*CD4+/CD8+1.86±0.11 1.66±0.15 1.66±0.02 1.60±0.07

圖5 CD4+及CD8+T淋巴細(xì)胞亞群分析及血清溶血素含量

圖6 巨噬細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞的活性評(píng)價(jià)

3 討論

SFP 是通過(guò)水解提取工藝從蠶絲中提取的一種生物活性肽，以國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)布的《增強(qiáng)免疫力功能評(píng)價(jià)方法》為指導(dǎo)，初步探索SFP 在腫瘤環(huán)境下對(duì)免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用。脾臟和胸腺為機(jī)體重要的外周和中樞免疫器官，參與機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫，其指數(shù)是機(jī)體免疫功能的重要指標(biāo)和相關(guān)研究的基礎(chǔ)［6］。細(xì)胞免疫主要由T 淋巴細(xì)胞介導(dǎo)，在Con A的刺激下未成熟的T淋巴細(xì)胞可轉(zhuǎn)化為代謝旺盛、體積更大的淋巴母細(xì)胞，其轉(zhuǎn)化能力可作為細(xì)胞免疫能力的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)。在細(xì)胞因子的參與下，初始T細(xì)胞可活化為輔助性T細(xì)胞CD4+和細(xì)胞毒性T細(xì)胞CD8+T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)腫瘤免疫［7］。本研究發(fā)現(xiàn)，TP-5 陽(yáng)性對(duì)照組和SFP 組的荷瘤小鼠均在給藥后出現(xiàn)CD4+/CD8+T 淋巴細(xì)胞比值下降，說(shuō)明在藥物的作用下CD8+T淋巴細(xì)胞上調(diào)的比例大于CD4+T淋巴細(xì)胞。CD4+T淋巴細(xì)胞在機(jī)體識(shí)別抗原后被激活分化為Th1和Th2細(xì)胞，并分泌多種細(xì)胞因子分別介導(dǎo)細(xì)胞免疫和體液免疫，CD8+T淋巴細(xì)胞可分泌大量TNF-α以及釋放顆粒酶B、穿孔素等細(xì)胞毒性分子誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡，還可分泌IL-2、IFN-γ 等Th1 型以及IL-4、IL-5 等Th2 型細(xì)胞因子發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用［8-9］。由此可見(jiàn)，SFP 可能對(duì)于細(xì)胞免疫應(yīng)答有較強(qiáng)的促進(jìn)作用，通過(guò)促進(jìn)T細(xì)胞增殖并使其更趨于分化為CD8+T淋巴細(xì)胞，CD8+效應(yīng)T細(xì)胞可以抗原特異性的方式與腫瘤細(xì)胞相結(jié)合、分泌多種細(xì)胞因子和細(xì)胞毒性分子誘導(dǎo)其凋亡，驅(qū)動(dòng)腫瘤免疫。在非特異性免疫應(yīng)答的評(píng)價(jià)中，本研究發(fā)現(xiàn)SFP在高劑量下有增強(qiáng)NK細(xì)胞殺傷活力的趨勢(shì)。在腫瘤微環(huán)境中，CD8+T 淋巴細(xì)胞、Th1 細(xì)胞和NK 細(xì)胞均可表達(dá)趨化因子受體CXCR3，該受體可與Th1 型趨化因子CX?CL9 和CXCL10 相互作用發(fā)揮募集作用［10］。由此推測(cè)，SFP可能通過(guò)上調(diào)CXCR3的表達(dá)，提高CXCL9和CXCL10 的水平，使CD8+T 細(xì)胞、NK 細(xì)胞遷移至腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮抗腫瘤作用。有研究表明CD8+T 細(xì)胞及Th1型細(xì)胞因子與抗PD-1/PD-L1單抗的療效呈正相關(guān)，進(jìn)一步證實(shí)CD8+T細(xì)胞對(duì)于腫瘤局部免疫的重要意義［11］。體液免疫則主要由B 淋巴細(xì)胞分泌抗體來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)機(jī)體的保護(hù)［12］。本研究檢測(cè)荷瘤小鼠的血清溶血素并未發(fā)現(xiàn)明顯差異，說(shuō)明SFP可能不通過(guò)誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性抗體的方式發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。腫瘤微環(huán)境的局部免疫為目前的研究熱點(diǎn)，TILs的強(qiáng)度是腫瘤局部免疫的重要基礎(chǔ)，其不僅殺傷腫瘤細(xì)胞，降低腫瘤的轉(zhuǎn)移能力，同時(shí)也為免疫治療提供可能性［13-14］。本研究初步探索SFP 對(duì)于荷瘤小鼠腫瘤組織淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)性的影響，發(fā)現(xiàn)高劑量的SFP可明顯提高淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)，提示在后續(xù)的研究中，分離TILs可以進(jìn)一步研究SFP增強(qiáng)腫瘤局部免疫的機(jī)制。

本研究尚存不足，如TP-5 作為陽(yáng)性對(duì)照藥物在多項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果中未顯示出明顯的免疫增強(qiáng)效果，該現(xiàn)象可能與其劑量的選取以及實(shí)驗(yàn)小鼠的耐受性有關(guān)，有待進(jìn)一步證實(shí)。綜合分析本研究結(jié)果，推測(cè)CD8+T 淋巴細(xì)胞可能是介導(dǎo)SFP 免疫調(diào)節(jié)作用的關(guān)鍵，因此后續(xù)將進(jìn)一步探索可能對(duì)其分化、分泌效應(yīng)因子以及遷移產(chǎn)生影響的因素，深入了解SFP增強(qiáng)免疫的機(jī)制。與此同時(shí)，本研究為SFP作為免疫增強(qiáng)劑臨床輔助用藥抗腫瘤奠定基礎(chǔ)，亟需繼續(xù)觀察SFP聯(lián)合化療對(duì)于腫瘤治療是否具有減毒增效的作用，完善SFP進(jìn)入臨床的前期藥理學(xué)研究。