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    三種品牌牛奶的熒光光譜特性研究

    2021-02-03 08:03:54殷文志王婷鈺馬超群陳國慶
    光譜學(xué)與光譜分析 2021年2期

    殷文志,王婷鈺,朱 拓,馬超群,辜 姣,朱 純,李 磊,陳國慶*

    1.江南大學(xué)理學(xué)院,江蘇 無錫 214122 2.江南大學(xué)物聯(lián)網(wǎng)工程學(xué)院,江蘇 無錫 214122 3.江蘇省輕工光電工程技術(shù)研究中心,江蘇 無錫 214122

    引 言

    牛奶中富含蛋白質(zhì)、脂肪、維生素和無機(jī)鹽等多種人體需要的營養(yǎng)物質(zhì),其中蛋白質(zhì)是最重要的營養(yǎng)成分之一,牛奶中的蛋白質(zhì)可以為人體提供20多種氨基酸,其中有8種是人體不能合成的必需氨基酸,且消化率達(dá)到90%~100%[1-2]。目前,市場上牛奶的種類很多,質(zhì)量參差不齊,一些不法商販在牛奶中添加非法添加物或者摻假物,比如2008年的三聚氰胺事件和2011年的黃曲霉毒素M1超標(biāo)事件[3]。諸多乳品安全事件的發(fā)生,快速準(zhǔn)確的檢測牛奶已勢在必行[4-5]。

    目前,國內(nèi)外牛奶檢測領(lǐng)域存在多種方法,比如:酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)[6]和膠體金免疫層析法(CGIA)[7]是利用免疫學(xué)檢測技術(shù)對(duì)牛奶進(jìn)行檢測,具有較高的靈敏度和特異性,但也存在預(yù)處理步驟較為繁瑣和成本較高的問題;高效液相色譜法(HPLC)[8]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)[9]和電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)[10]等儀器分析方法具有靈敏度高和精度高的優(yōu)點(diǎn),比較適合低濃度目標(biāo)的檢測,但仍存在預(yù)處理步驟較多和易受干擾的不足;近紅外光譜法(NIR)[11]和拉曼光譜法(RS)[12]是使用光譜方法對(duì)目標(biāo)進(jìn)行分析檢測,具有檢測時(shí)間短和對(duì)目標(biāo)分子破壞較小等優(yōu)點(diǎn),然而近紅外光譜的靈敏度較低,拉曼光譜的強(qiáng)度較弱,限制了其應(yīng)用范圍。

    熒光光譜技術(shù)(FS)可以反映目標(biāo)分子的特性,可對(duì)目標(biāo)分子定性或定量檢測。熒光光譜法具有選擇性好、靈敏度高、操作簡單和用樣量少等優(yōu)點(diǎn),被應(yīng)用于諸多復(fù)雜混合物體系的精確檢測。

    本文采用熒光光譜技術(shù),對(duì)市場上的三種品牌的不同脂肪含量的純牛奶(超高溫滅菌奶)、鮮奶(巴氏殺菌奶)在不進(jìn)行預(yù)處理的情況下進(jìn)行測試,研究牛奶的熒光光譜,推斷牛奶的主要熒光物質(zhì),并分析全脂牛奶和脫脂牛奶熒光光譜的異同及其原因,為牛奶的成分鑒別和混合物的光譜檢測提供一定的幫助。

    1 實(shí)驗(yàn)部分

    1.1 儀器

    實(shí)驗(yàn)采用英國Edinburg生產(chǎn)的FLS920P型穩(wěn)態(tài)和時(shí)間分辨熒光光譜儀。

    1.2 樣品

    實(shí)驗(yàn)所用三個(gè)品牌牛奶分別記為A,B和C,牛奶的種類包括:全脂純牛奶、脫脂純牛奶、全脂鮮奶和脫脂鮮奶,共9種。實(shí)驗(yàn)所用酪蛋白(干酪素)為國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供。

    1.3 方法

    測量9種牛奶樣品和酪蛋白溶液的三維熒光光譜,每次取350 μL牛奶樣品移入石英微量比色皿中,激發(fā)波長范圍為250~450 nm,發(fā)射波長范圍為265~550 nm,激發(fā)波長步長為5 nm,發(fā)射波長步長為1 nm,激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均設(shè)置為5 nm,積分時(shí)間為0.1 s。

    測量9種牛奶樣品和酪蛋白溶液的時(shí)間分辨熒光光譜,以波長為273.7 nm脈沖光源激發(fā),探測波長為349 nm。

    將全脂純牛奶C以12 000 r·min-1的速度離心15 min,去除上層脂肪后,將下層樣品震蕩5 min,得到離心后的牛奶樣品,測量其熒光發(fā)射光譜。

    使用超純水分別將9種牛奶稀釋至0.1%濃度,測量得到光透過率曲線。

    2 結(jié)果與討論

    實(shí)驗(yàn)測得9種牛奶樣品的三維熒光光譜,以品牌C為例,圖1(a)和圖1(b)分別為全脂純牛奶C和脫脂純牛奶C的三維熒光光譜,可以看出牛奶在紫外光激發(fā)下產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光,二者的熒光光譜除熒光強(qiáng)度外基本一致。表1為9種牛奶的熒光光譜特征參數(shù),峰值波長為349 nm左右,最大相差5 nm,半高寬為66 nm左右,最佳激發(fā)波長為291 nm左右,最大相差4 nm,表明9種牛奶的主要熒光物質(zhì)是相同的。

    表1 牛奶的熒光光譜特征參數(shù)Table 1 Fluorescence spectral characteristic parameters of milk

    圖1 牛奶的三維熒光光譜(a):全脂純牛奶C;(b):脫脂純牛奶CFig.1 Three-dimensional fluorescence spectra of milk(a):Whole milk C;(b):Skim milk C

    牛奶主要由蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物和維生素等組成,實(shí)驗(yàn)表明脂肪(在牛奶中主要以脂肪球的形式存在)和碳水化合物沒有熒光,維生素中的維生素B2和維生素B6的熒光峰值波長和最佳激發(fā)波長分別為535和440 nm,395和325 nm。當(dāng)激發(fā)波長為291 nm時(shí),兩種維生素的熒光較弱。牛奶中酪蛋白占蛋白質(zhì)的80%左右,在300~400 nm范圍有較強(qiáng)的熒光。

    實(shí)驗(yàn)得到酪蛋白的熒光光譜,酪蛋白的熒光峰值波長為344 nm,半高寬為66 nm,最佳激發(fā)波長為295 nm。激發(fā)波長為291 nm時(shí)酪蛋白溶液和9種牛奶的熒光發(fā)射光譜如圖2。

    從圖2看出,酪蛋白與牛奶的熒光光譜除熒光強(qiáng)度外基本一致,且譜形相似。推斷牛奶在291 nm激發(fā)波長下產(chǎn)生熒光的主要熒光物質(zhì)是酪蛋白。

    圖2 酪蛋白溶液和9種牛奶的熒光發(fā)射光譜(激發(fā)波長為291 nm)Fig.2 Fluorescence emission spectra of casein solution and 9 kinds of milk (excitation wavelength is 291 nm)

    為驗(yàn)證這一推斷,測得9種牛奶和酪蛋白溶液的時(shí)間分辨熒光光譜,如圖3所示,9種牛奶的時(shí)間分辨熒光光譜無明顯的差別,平均熒光壽命都為4.6 ns左右,酪蛋白的平均熒光壽命為4.1 ns,熒光壽命擬合參數(shù)如表2所示。

    圖3 9種牛奶和酪蛋白溶液的時(shí)間分辨熒光光譜Fig.3 Time resolved fluorescence spectra of 9 kinds of milk and casein solution

    表2 9種牛奶和酪蛋白溶液的熒光壽命擬合參數(shù)Table 2 Fitting parameters of fluorescence lifetime of 9 kinds of milk and casein solution with excited

    從時(shí)間分辨熒光光譜可以看出牛奶與酪蛋白的熒光壽命基本一致,牛奶的主要熒光物質(zhì)為酪蛋白,而牛奶的熒光壽命稍大于酪蛋白,這可能是牛奶中其他物質(zhì)的影響,造成牛奶與酪蛋白的熒光壽命有較小差異。

    酪蛋白是由多種氨基酸以肽鍵組成的高分子化合物,其中色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸是熒光物質(zhì)。圖4為色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的分子結(jié)構(gòu),這些氨基酸的苯環(huán)含有共軛雙鍵,分子被激發(fā)后,會(huì)發(fā)生π→π*躍遷,此時(shí)分子處于激發(fā)態(tài),但激發(fā)態(tài)的分子不穩(wěn)定,會(huì)通過S1→S0的輻射躍遷發(fā)射熒光。實(shí)驗(yàn)表明色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的熒光峰值波長和最佳激發(fā)波長分別為350和290 nm,300和270 nm,282和258 nm,且它們的相對(duì)熒光強(qiáng)度為100∶9∶0.5,所以酪蛋白在激發(fā)波長為291 nm時(shí)產(chǎn)生的熒光更多的是來自色氨酸[13]。

    圖4 色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的分子結(jié)構(gòu)Fig.4 Molecular structure of tryptophan, tyrosine and phenylalanine

    圖2中9種牛奶樣品在激發(fā)波長為291 nm時(shí)的熒光發(fā)射光譜,相同品牌的脫脂牛奶熒光強(qiáng)度高于全脂牛奶。全脂牛奶和脫脂牛奶的區(qū)別主要是脂肪含量,脂肪的存在對(duì)牛奶熒光強(qiáng)度有一定的影響。

    為了探究脂肪含量對(duì)熒光強(qiáng)度的影響,對(duì)全脂純牛奶C進(jìn)行了離心處理,去除脂肪,圖5是激發(fā)波長為291 nm時(shí)全脂純牛奶C、脫脂純牛奶C和離心后的全脂純牛奶C歸一化后的熒光發(fā)射光譜。

    圖5 全脂純牛奶C、脫脂純牛奶C和離心后的全脂純牛奶C歸一化后的熒光發(fā)射光譜(激發(fā)波長為291 nm)Fig.5 The normalized fluorescence emission spectra of whole milk C,skim milk and whole milk C after centrifugation (excitation wavelength is 291 nm)

    圖5中離心后的全脂牛奶熒光強(qiáng)度介于全脂和脫脂之間,脂肪的減少使得牛奶的熒光強(qiáng)度有所增加,而離心處理的牛奶脂肪含量高于脫脂牛奶也使得其熒光強(qiáng)度低于脫脂牛奶。

    測得291 nm激發(fā)下全脂純牛奶C和脫脂純牛奶C的熒光發(fā)射全譜,如圖6,可以看出全脂牛奶的瑞利散射強(qiáng)度明顯高于脫脂牛奶。全脂牛奶的脂肪含量高,散射強(qiáng),激發(fā)光入射全脂牛奶后更多地被散射,使得其熒光強(qiáng)度低于脫脂牛奶。

    圖6 全脂純牛奶C和脫脂純牛奶C的熒光發(fā)射全譜(激發(fā)波長為291 nm)Fig.6 Full fluorescence emission spectrum of whole milk C and skimmed milk C (excitation wavelength is 291 nm)

    圖7為9種牛奶稀釋后的光透過率曲線,全脂牛奶的透過率都低于脫脂牛奶。入射光通過全脂牛奶時(shí),除了一部分被酪蛋白吸收以外,還有一部分因脂肪的散射而損失,透過率減小,使得全脂牛奶的透過率都低于脫脂牛奶。

    圖7 9種牛奶的光透過率曲線Fig.7 The light transmittance curve of 9 kinds of milk

    實(shí)驗(yàn)研究表明脂肪的存在會(huì)導(dǎo)致散射增加,使得全脂牛奶的熒光強(qiáng)度低于同品牌的脫脂牛奶。

    3 結(jié) 論

    9種牛奶的三維熒光光譜和時(shí)間分辨熒光光譜顯示,牛奶可以在紫外光的激發(fā)下產(chǎn)生熒光,熒光峰值波長為349 nm左右,半高寬為66 nm左右,最佳激發(fā)波長為291 nm左右,平均熒光壽命為4.6 ns左右。實(shí)驗(yàn)表明9種牛奶熒光光譜除熒光強(qiáng)度外基本一致,牛奶的主要熒光物質(zhì)相同,并通過對(duì)比實(shí)驗(yàn)推斷牛奶的主要熒光物質(zhì)是酪蛋白。全脂牛奶的熒光強(qiáng)度低于同品牌的脫脂牛奶,是由于脂肪的存在會(huì)使得散射變強(qiáng)。研究工作可對(duì)人們健康飲用不同類型的牛奶有所指導(dǎo),也可為牛奶這種復(fù)雜混合物的分析檢測提供幫助。

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