流式液相蛋白定量技術(shù)測(cè)定生物醫(yī)用材料產(chǎn)品體液免疫評(píng)價(jià)中免疫球蛋白含量

侯麗，王國(guó)偉，孫曉霞，高冉冉

山東省醫(yī)療器械產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)中心; 國(guó)家藥品監(jiān)督管理局生物材料器械安全性評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；國(guó)家藥品監(jiān)督管理局藥品包裝材料質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；山東省醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南市，250101

0 引言

免疫原即醫(yī)療器械中所含有的，可以刺激機(jī)體發(fā)生免疫應(yīng)答的異源性物質(zhì)。對(duì)于醫(yī)療器械而言，聚合材料、陶瓷制品及金屬材料可能具有的溶出物、磨損或可降解部分能夠與宿主蛋白結(jié)合。生物源性的材料，如膠原、天然乳膠蛋白、白蛋白和動(dòng)物組織等都可以刺激機(jī)體發(fā)生免疫應(yīng)答[1]。目前，評(píng)價(jià)醫(yī)療器械免疫毒性主要依據(jù)GB/T 16886.20—2015[2]，該標(biāo)準(zhǔn)為醫(yī)療器械免疫毒理學(xué)試驗(yàn)提供了指南。目前，鑒于生物科學(xué)新方法新技術(shù)的研究更加深入，評(píng)價(jià)醫(yī)療器械免疫學(xué)毒理學(xué)試驗(yàn)方法也不斷涌現(xiàn)。

流式液相多重蛋白定量技術(shù)（CBA）是基于熒光微球技術(shù)與“雙抗體夾心”液相檢測(cè)技術(shù)的結(jié)合，特異性捕獲樣品中或標(biāo)準(zhǔn)品中的目的蛋白，捕獲微球、目的蛋白與加入的檢測(cè)抗體形成雙抗體夾心的“三明治”結(jié)構(gòu)復(fù)合物，利用流式細(xì)胞儀對(duì)該復(fù)合物的熒光強(qiáng)度進(jìn)行檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)多種可溶性蛋白同時(shí)定量檢測(cè)。

本研究為充分評(píng)價(jià)CBA技術(shù)，以臨床常見的動(dòng)物源醫(yī)療器械作為研究對(duì)象，對(duì)生物醫(yī)用材料產(chǎn)品體液免疫評(píng)價(jià)中的免疫球蛋白進(jìn)行檢測(cè)，為深入研究CBA技術(shù)在醫(yī)療器械免疫毒理學(xué)提供了研究數(shù)據(jù)。

1 材料

1.1 試劑

磷酸鹽緩沖液(PBS)、牛血清白蛋白(BSA)、完全弗氏佐劑(CFA)、LENGENDplexTMMulti-Analyte Flow Assay Kit(Cat No.740493)。

1.2 器具和儀器設(shè)備

流式細(xì)胞儀、生物安全柜、離心機(jī)、電動(dòng)渦旋儀、搖床等。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

Balb/C小鼠，6～8周齡，共50只，雌雄各半。購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 實(shí)驗(yàn)組

將受試樣品（牛源異種脫細(xì)胞真皮基質(zhì)）植入小鼠，設(shè)高、中、低劑量組，植入劑量分別為3.28、1.64、0.82 cm2產(chǎn)品/只小鼠。

2.2 植入方式

戊巴比妥鈉（55 mg/kg）腹腔麻醉小鼠，在其背部脊柱兩側(cè)剃毛，面積約2 cm×2 cm，碘伏消毒，用眼科剪剪約5 mm直徑切口，用眼科鑷在皮膚切口部位制備皮下囊，將被測(cè)樣品植入囊內(nèi)并縫合。植入周期為28 d。

2.3 對(duì)照組

陰性對(duì)照組：除不用受試樣品進(jìn)行處理以外，與實(shí)驗(yàn)組的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行相同的操作和處理方式。

陽性對(duì)照組：采用牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）作為陽性對(duì)照。免疫前，取3 mg BSA和9 mL PBS（pH=7.4）制成混合溶液。充分混勻后，取3 mL混合溶液與3 mL弗氏完全佐劑等體積混合。取0.12 mL混懸液注射到小鼠皮下，從試驗(yàn)第一天開始，每周免疫一次，免疫3次，于免疫后第2周對(duì)陽性對(duì)照動(dòng)物進(jìn)行評(píng)價(jià)。

2.4 血清制備

試驗(yàn)第1天時(shí)，將試驗(yàn)樣品植入BALB/C小鼠背部皮下（記為植入第1天），在植入第29天時(shí)采取小鼠摘眼球取血法，收集外周血至1.5 mLEP管中，4 ℃靜置30 min后，2 000 g離心20 min，收集上層血清。

2.5 試劑及準(zhǔn)備

試驗(yàn)前將所需beads超聲1 min，渦旋30 s。將20×Wash Buffer靜置恢復(fù)室溫后，混勻使其中鹽分充分溶解。用去離子水將其配制成1×Wash Buffer。用250 μL Assay Buffer溶解Standard Cocktail，充分混勻后靜置10 min，然后轉(zhuǎn)入EP管中，標(biāo)記為C7。取7個(gè)EP管，分別加入75 μL Assay Buffer，4倍倍比稀釋。從C7中取25 μL進(jìn)行梯度稀釋，直到稀釋到C1為止，C0為Assay Buffer(0 pg/mL)。取血清血漿樣本，試驗(yàn)前需要用Assay Buffer進(jìn)行稀釋，稀釋50 000倍。

2.6 試驗(yàn)過程

所有樣品孔/標(biāo)準(zhǔn)孔中加25μL Assay Buffer，取25 μL稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品/樣品分別加入對(duì)應(yīng)的孔中；試驗(yàn)前渦旋beads 1 min，渦旋后每孔加入25 μL beads。避光，室溫300 r/min震蕩孵育2 h；孵育結(jié)束后，300 g離心5 min，棄上清；每孔加入200 μL Wash Buffer保持1 min，離心棄上清；每孔加入25 μL的檢測(cè)抗體，避光，室溫300 r/min震蕩孵育1 h；孵育結(jié)束后，直接向每孔中加入25 μL的SA-PE，避光，室溫300 r/min震蕩孵育30 min；每孔中加入150 μL 1×Wash Buffer，重懸beads準(zhǔn)備上機(jī)檢測(cè)。在流式細(xì)胞儀上開啟流式細(xì)胞儀分析軟件獲取數(shù)據(jù)。將獲取的數(shù)據(jù)在LEGENDplexTM軟件上進(jìn)行分析，根據(jù)已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品的平均熒光強(qiáng)度（MIF）制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，依據(jù)樣本的平均熒光強(qiáng)度（MIF）計(jì)算出樣本的可溶性蛋白濃度。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果都以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式展示，采用Student's t(等方差，單尾) 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05 時(shí)認(rèn)為兩組之間具有顯著性差異。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

以標(biāo)準(zhǔn)品濃度做為橫坐標(biāo)，平均熒光強(qiáng)度（MFI）為縱坐標(biāo)，通過五參數(shù)擬合模型繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。曲線R2值均大于0.99（如圖1～6所示）。

圖1 IgG1標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of IgG1

圖2 IgG2a標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The standard curve of IgG2a

圖3 IgG2b標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 The standard curve of IgG2b

圖4 IgG3標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 The standard curve of IgG3

圖5 IgA標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 The standard curve of IgA

圖6 IgM標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 The standard curve of IgM

3.2 各實(shí)驗(yàn)組免疫球蛋白含量

應(yīng)用流式液相多重蛋白定量技術(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)各劑量組以及對(duì)照組小鼠血清中IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA、IgM的含量進(jìn)行同時(shí)測(cè)定。與陰性對(duì)照組相比，陽性對(duì)照組中IgG3、IgA含量未見明顯差異，而IgG1、IgM、IgG2b含量顯著性高于陰性對(duì)照組(P＜0.01)，表明本試驗(yàn)系統(tǒng)運(yùn)行正常。被測(cè)樣品植入低、中、高劑量組IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA、IgM含量沒有明顯變化(P＞0.05)。各實(shí)驗(yàn)組中血清免疫球蛋白濃度數(shù)據(jù)見表1。

4 討論

隨著生物醫(yī)用材料的不斷發(fā)展與應(yīng)用，人們對(duì)醫(yī)療器械的安全性和有效性提出了更高的要求。其中，醫(yī)療器械或生物材料與機(jī)體免疫系統(tǒng)的相互作用也日益受到關(guān)注。若醫(yī)療器械所含材料的化學(xué)特性提示有免疫毒性的數(shù)據(jù)或任何化學(xué)物具有不可知的潛在免疫毒性時(shí)，都應(yīng)考慮進(jìn)行免疫毒性試驗(yàn)[2]。特別對(duì)動(dòng)物源性醫(yī)療器械評(píng)價(jià)時(shí)，需進(jìn)行免疫原性方面的安全風(fēng)險(xiǎn)分析。目前，雖然GB/T 16886.20給出了進(jìn)行醫(yī)療器械免疫毒性試驗(yàn)的指導(dǎo)，但并未給出具體的試驗(yàn)方法。YY/T 1465.7系列標(biāo)準(zhǔn)已給出了醫(yī)療器械免疫原性評(píng)價(jià)系列方法供使用方選擇。其中ELISA法測(cè)定血清免疫球蛋白和補(bǔ)體成分以及用流式細(xì)胞儀測(cè)定動(dòng)物脾臟淋巴細(xì)胞亞群等方法已作為標(biāo)準(zhǔn)化方法得到日益廣泛應(yīng)用[3-4]。但由于通常采用小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，獲取的樣本量過少導(dǎo)致不能滿足多個(gè)指標(biāo)的同時(shí)觀察，從而進(jìn)一步造成實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源浪費(fèi)。

表1 植入28天后小鼠血清中免疫球蛋白濃度 (±S,μg/mL,n=10)Tab.1 Immunoglobulin concentrations in serum of mice 28 days after implantation

表1 植入28天后小鼠血清中免疫球蛋白濃度 (±S,μg/mL,n=10)Tab.1 Immunoglobulin concentrations in serum of mice 28 days after implantation

CBA技術(shù)是基于流式細(xì)胞檢測(cè)系統(tǒng)，集ELISA和細(xì)胞流式技術(shù)優(yōu)點(diǎn)為一身的液相蛋白檢測(cè)技術(shù)可通過對(duì)應(yīng)的微球分別標(biāo)記有不同強(qiáng)度的熒光，每一種微球分別耦聯(lián)對(duì)應(yīng)目標(biāo)抗原的捕獲抗體，同時(shí)，通過標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，可實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)樣本中多種可溶性蛋白的定量檢測(cè),目前在藥物毒理研究的應(yīng)用已日益廣泛[5]。

與傳統(tǒng)的ELISA檢測(cè)相比，流式液相多重蛋白定量技術(shù)對(duì)樣本量需求小，特別是珍貴樣本獲取困難，利用該技術(shù)可大大緩解樣本量的難題；可同時(shí)對(duì)樣本中多個(gè)目標(biāo)蛋白進(jìn)行檢測(cè)，具有一定的經(jīng)濟(jì)性并且大大減少時(shí)間與人力的消耗；檢測(cè)靈敏度高檢測(cè)范圍更寬。同時(shí)，該技術(shù)操作步驟簡(jiǎn)化,檢測(cè)結(jié)果的重復(fù)性好，并易于標(biāo)準(zhǔn)化。IgM、IgA是評(píng)價(jià)體液免疫功能的重要指標(biāo)，IgG是血清中含量最高的免疫球蛋白，其作用大多通過IgG亞型來完成，不同亞型功能不同，由于一種IgG亞型水平的降低可以伴有一種或幾種其他亞型水平的提高，從而使IgG總量水平保持正常，故有必要測(cè)定IgG亞型的水平[6]。本研究中，取少量血樣即可應(yīng)用流式液相蛋白定量技術(shù)同時(shí)測(cè)定小鼠血清中不同類型免疫球蛋白含量，為今后在同組動(dòng)物中測(cè)量不同時(shí)期血液指標(biāo)變化趨勢(shì)提供基礎(chǔ)。牛血清白蛋白（BSA）是對(duì)生物醫(yī)用材料產(chǎn)品體液免疫評(píng)價(jià)時(shí)一種常用的陽性對(duì)照物[7]，本實(shí)驗(yàn)中陽性對(duì)照組IgG1、IgG2a、IgG2b、IgM含量顯著高于陰性對(duì)照組，說明通過CBA技術(shù)可以檢測(cè)出在適宜的免疫刺激下的免疫球蛋白指標(biāo)的變化。綜上所述，本方法可以替代ELISA法測(cè)定生物醫(yī)用材料產(chǎn)品體液免疫評(píng)價(jià)中免疫球蛋白含量。