毛白楊葉際酵母Wapdr15基因的克隆及功能鑒定

郝甜,趙新偉,孫然,才滿,杜克久

(1 河北農(nóng)業(yè)大學 林學院，河北 保定 071000；2 河北林木種質資源與森林保護重點實驗室，河北 保定 071000)

多溴聯(lián)苯醚(polybrominated diphenyl ethers，PBDEs)作為常見的環(huán)境有機污染物[1-2]，可沿食物鏈逐級富集至生物體內(nèi)[3-5]。環(huán)境中PBDEs同系物因還原反應脫溴，生成低溴聯(lián)苯醚[6]，其中4-溴帶聯(lián)苯醚(4-bromodiphenyl ether，BDE-3)作為 PBDEs 脫溴反應的終產(chǎn)物之一[7]，在 PBDEs 生物修復研究中備受關注[8-10]。

ABC 轉運蛋白參與生物對逆境的適應過程[11-12]，目前多數(shù)研究集中于其對金屬或農(nóng)藥抗性等方面[13-15]，并且將酵母 ABC 轉運蛋白在植物體內(nèi)超表達，發(fā)現(xiàn)可提高植物對于重金屬的抗性[16-17]，而對于其是否參與包括 PBDEs 在內(nèi)環(huán)境持久性有機污染物(POPs)的轉運和解毒過程研究尚無報道。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

毛白楊葉際異常維克漢姆酵母、煙草組培苗由河北農(nóng)業(yè)大學植物修復實驗室保存

1.2 試驗方法

1.2.1 目的基因的克隆及序列分析 以異常維克漢姆酵母菌體 DNA 為模板，根據(jù)轉錄組測序結果(未公開)，由上海生工合成如下2條引物分別為正向引物 5′-GGGACTCTTGACCATGTCA

TCAGATATCAGA和反向引物5′-AGTCAGATCTACCATGTCACTTCTTGGGTTTTTC。PCR反應體系(50 μL)包括： 正向引物與反向引物各 1 μL；普通 Taq 酶 Mix：25 μL；DNA：1 μL；ddH2O：22 μL。PCR 擴增反應程序：(1)預變性：94 ℃，2 min。(2)變性：94 ℃，30 s，退火：56 ℃，30 s，延伸：72 ℃，5 min，30個循環(huán)。(3)最終延伸，72 ℃ 10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳回收擴增片段，連接pMD18-T載體，轉化大腸桿菌，菌落 PCR 鑒定陽性菌落，重組質粒送生工生物工程(上海)有限公司測序。

采用 GSDS 在線軟件分析基因結構；利用 SMART 進行蛋白質結構域分析，由 DNAMAN 軟件與其他物種進行氨基酸序列比對。

1.2.2 植物過表達載體的構建 首先根據(jù)對基因全長和載體進行酶切位點分析，選擇目的基因內(nèi)部沒有相應酶切位點的酶SalI和SpeI，再將 pCambia1 302-35s、pT-Wapdr15 質粒酶切后，電泳檢測，回收目的片段。利用北京全式金生物技術有限公司出品的 T4DNA Ligase 試劑，連接產(chǎn)物轉化至大腸桿菌 DH5α 感受態(tài)細胞，過夜培養(yǎng)，挑取菌落進行菌落 PCR，陽性克隆提取質粒進行雙酶切鑒定目的基因過表達載體是否構建成功。將制備成功的重組載體轉化農(nóng)桿菌，獲得攜帶目的基因的陽性農(nóng)桿菌菌株。

1.2.3 葉盤法轉化煙草及轉基因煙草的鑒定 采用葉盤法轉化煙草，轉化方法參考郭曉蓉[18]。利用 PCR 技術鑒定目的基因是否轉入煙草。

同時，對于上市問題，宗慶后此前一直堅持娃哈哈不差錢、不上市。而今年3月，也有媒體報道稱，娃哈哈開始為上市而瘦身——清退員工股份。宗慶后也改口表示，未來如果有大的產(chǎn)業(yè)要投資，娃哈哈也要上市募集資金。

1.2.4Wapdr15基因功能初步分析 從生長一致的未轉基因和轉入Wapdr15基因的煙草組培苗相同部位，剪取葉片，平鋪到煙草分化培養(yǎng)基上，并吸取 10 μL 5 mg/mL BDE-3 滴到不同煙草葉片上，觀察記錄不同煙草葉片的受害情況。

2 結果與分析

2.1 目的片段的克隆

目的基因克隆結果見圖1。

以酵母 DNA 為模板，PCR 擴增產(chǎn)物電泳檢測結果如圖1 a所示。引物設計時預計Wapdr15基因 PCR 擴增產(chǎn)物的片段長度為 4 536 bp，由圖1 a可知，各基因的 PCR 產(chǎn)物片段大小與預計片段長度一致?；厥占兓哪康幕?DNA 片段與 pUCm-T 載體進行連接，菌落 PCR 檢測電泳結果如圖1 b所示。由圖1 b 可知，泳道 1-4 號出現(xiàn)目的條帶，與泳道 5 陽性對照中條帶位置相同，而陰性對對照(泳道 6)中則無條帶。提取陽性轉化菌質粒送往生工(上海)生物有限公司測序。

Wapdr15測序結果及編碼氨基酸序列見圖2。

如圖2所示，經(jīng) NCBI 序列比對，與異常維克漢姆酵母目的基因的相似度為 98%，說明目的基因Wapdr15克隆成功，將序列正確的質粒命名為pT-Wapdr15。毛白楊葉際異常維克漢姆酵母(W.anomalus)Wapdr15基因長度為4 536 bp，編碼1 511個氨基酸。

2.2 Wapdr15基因生物信息學分析

Wapdr15基因結構分析結果如圖3所示。

由圖 3 可知，Wapdr15基因中無內(nèi)含子結構。

Wapdr15基因編碼氨基酸序列結構域分析結果如圖4所示。

圖4 WaPDR15蛋白質結構域Figure 4 Domain structure of WaPDR15 protein

由圖 4 可知 WaPDR 15轉運蛋白含有 ABC 蛋白的結構域PDR-CDR(710～802)，符合 ABC 轉運蛋白 G 家族的結構特點，所以WaPDR 15轉運蛋白屬于 ABCG 家族。WaPDR15 共包含 2 個 NBD (173～383，870～1 061)和 TMD (489～699，1 158～1 378)，形成了 NBD1～TMD1～NBD2～TMD2結構，為典型的全分子蛋白。

WaPDR15 與其他物種 ABC 轉運蛋白氨基酸序列比對結果如圖5所示。

圖5 WaPDR15與其他物種氨基酸比對Figure 5 The amino acids of WaPDR15 comparison with other species

由圖 5 可知 WaPDR15 N 端的 NBD 結構域中包含 ABC 轉運蛋白序列中高度保守的 Walker-A、Walker-B 基序。

2.3 植物過表達載體的構建

pT-Wapdr15、pCam1 302-35s 質粒酶切結果見圖6。

由圖6 a中可知，1～3泳道中片段長度為5 000 bp，與目的基因長度相符。由圖6 b中可知，1～5泳道片段長度為11 000 bp，與待連接質粒長度相符。

圖6 質粒酶切電泳檢測結果Figure 6 Detection results of plasmid enzyme cutting electrophoresis

重組質粒菌落PCR及酶切電泳檢測結果見圖 7。

圖7 重組質粒菌落PCR及酶切電泳檢測結果Figure 7 Detection results of recombinant plasmid colony PCR and enzyme digestion electrophoresis

由圖 7a可知，酶切回收產(chǎn)物與表達載體 pCam1 302～35 s連接，菌落PCR鑒定結果中泳道1、2號出現(xiàn)目的條帶，與泳道3陽性對照中條帶位置相同，而陰性對照中則無條帶，表明pCam-Wapdr15初步構建成功。為進一步確保載體構建正確，挑選目的條帶明亮的 2 號菌落，提取質粒，進行質粒 PCR 和酶切鑒定。由圖7 b可知，酶切產(chǎn)物電泳檢測出現(xiàn)兩條帶，大片段11 000 bp和小片段5 000 bp，結果與預期相符，經(jīng)鑒定獲得植物表達載體pCam-Wapdr15重組質粒。

農(nóng)桿菌菌落PCR結果如圖8所示。

圖8 農(nóng)桿菌菌落PCR凝膠電泳圖Figure 8 PCR gel release results of agrobacterium colonies

采用熱激法將pCam-Wapdr15轉入Agl 1農(nóng)桿菌，菌落PCR鑒定結果如圖8，所擴增的片段與陽性對照一致，說明基因成功轉入 Agl 1 農(nóng)桿菌中。

2.4 葉盤法轉化煙草及轉基因煙草的鑒定

轉化煙草過程如圖9所示。

圖9 Wapdr15基因轉化煙草Figure 9 Tobacco transformed with the Wapdr15 gene

由圖9可知，將含有目的基因pCam-Wapdr15的農(nóng)桿菌轉入煙草，培養(yǎng)1個月后，進行篩選生根，得到疑似含 pCam-Wapdr15基因的抗性植株。選取生長狀況良好的煙草組培苗葉片(圖9a)，剪成1 cm2方塊，培養(yǎng)基中加入抗生素后篩選轉染成功的煙草葉片(圖9b)，葉片上開始出現(xiàn)不定芽(圖9c)，1個月后逐漸長出不定根(圖9d)。

轉基因煙草組培苗驗證結果如圖10所示。

圖10 轉基因植物的PCR擴增1%瓊脂糖凝膠電泳圖Figure 101% agarose gel electrophoresis of PCR product of transgenic plants

由圖10可知，以轉基因植株的 DNA 為模板，以含有目的基因片段pCam-Wapdr15的質粒為陽性對照，以野生型煙草植株作陰性對照，對 5 個煙草株系進行 PCR 擴增鑒定。轉基因煙草株系和陽性對照擴增結果一致，且陰性對照植株沒有擴增出特異性條帶，說明成功獲得了Wapdr15的轉基因植株，可用于后續(xù)試驗。

2.5 WaPDR 15轉運蛋白基因的功能分析

轉基因煙草和野生煙草對 BDE-3的耐受情況如圖11所示。

圖11 轉基因煙草對BDE-3的耐受情況Figure 11 Tolerance of transgenic tobacco to BDE-3

如圖11所示，為探究Wapdr15轉基因煙草植物對 BDE-3 耐受情況，分別在葉齡一致的煙草葉片下表面的固定位置滴加10 μL 5 mg/mL的BDE-3，每24 h觀察葉片滴加部位的壞死情況。野生型對照組煙草葉片在滴加BDE-3第4天出現(xiàn)褐化壞死斑(圖11白色箭頭所指)，而轉毛白楊葉際異常維克漢姆Wapdr15轉基因的煙草葉片未出現(xiàn)褐化壞死斑，表現(xiàn)出一定抗性。

3 討論與結論

ABC 轉運蛋白參與生物抗逆過程，真菌中 ABC 轉運蛋白在植物中的超表達可以提到轉基因植物的抗性；釀酒酵母 YCF1 可以明顯提高印度芥菜(Brassicajuncea)對Cd和Pb的耐性；粟酒裂殖酵母中的ABC轉運蛋白Sp HMT1可以提高擬南芥種子的Cd耐性[16-17]。

Wapdr15基因編碼蛋白質中包含保守度極高的 Walker-A、Walker-B 基序[12]，與葡萄中 ABCG 亞族中蛋白結構相似[19]，這些結構和保守基序都有助于NBD 與 ATP 結合并水解[20]，為物質的跨膜運輸提供能量，提高生物抗逆能力。Wolfge 等[21]的研究結果顯示，釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae) ABCG 轉運蛋白pdr15由轉錄因子pdr1和pdr3控制，pdr1和pdr3通過與順式作用位點 PDREs(PDR響應元件)結合，調(diào)控 ABC轉運蛋白藥物外排泵的表達，從而產(chǎn)生抗藥性。為研究Wapdr15基因對 BDE-3 的作用，對Wapdr15基因進行克隆、構建Wapdr15基因過表達載體并轉化煙草，分析轉入Wapdr15基因煙草對 BDE-3 的耐受情況，發(fā)現(xiàn)轉基因的煙草對 BDE-3 的耐受顯著好于野生型對照煙草，毛白楊葉際異常維克漢姆 WaPDR15 ABC轉運蛋白可以增強煙草對于PBDEs的耐受性。

綜上所述，Wapdr15基因編碼序列長4 536 bp，為全分子跨膜蛋白。毛白楊異常維克漢姆 WaPDR15ABC 轉運蛋白對 BDE-3 有解毒作用。這些發(fā)現(xiàn)都將有助于進一步揭示毛白楊葉際異常維克漢姆酵母對 BDE-3 耐受解毒分子機制，并可以為包括林木在內(nèi)的植物對有機污染物修復機制研究提供借鑒。毛白楊葉際異常維克漢姆酵母 ABC 轉運蛋白基因Wapdr15有望成為包括毛白楊在內(nèi)的楊樹以及其他木本植物遺傳轉化的抗有機污染物基因資源，為獲得可修復 BDE-3及其他 PBDEs 以及 POPs 的木本植物新種質奠定理論基礎。