香連片抗細菌性痢疾相關(guān)疾病的網(wǎng)絡(luò)藥理學研究

黃先菊，董悅，王晶，李竣，楊光忠，石召華

(1中南民族大學 藥學院，武漢 430074；2 武漢愛民制藥股份有限公司，武漢 436070)

細菌性痢疾(bacterial dysentery)是由志賀菌屬細菌引起的腸道傳染病，會引發(fā)一系列后續(xù)疾病和癥狀，諸如腸炎性相關(guān)疾病和泄瀉等癥狀[1].香連片，由萸黃連和木香組成，其組方藥對在《太平惠民和劑局方》、《本草綱目》等典籍均有收載,是臨床上治療腸炎、細菌性痢疾等的常用藥[2].香連片屬于中藥復方制劑，有中藥成分復雜的特點，本研究將網(wǎng)絡(luò)信息化預測的數(shù)據(jù)運算方法與中藥成分復雜的特點相結(jié)合，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學從系統(tǒng)、整體的角度將藥物與疾病聯(lián)系起來[3，4]，預測香連片在抗細菌性痢疾相關(guān)疾病方面的作用靶點，進一步預測其潛在作用機制.

1 方法

1.1 香連片活性成分的篩選

通過藥理學分析平臺(TCMSP)對“吳茱萸”、“黃連”及“木香”3種中藥進行成分檢索，以口服生物利用度(OB)>30%及藥物相似度(DL)>0.18為條件，結(jié)合文獻研究篩選出香連片的主要活性成分.

1.2 香連片活性成分的靶點預測

將香連片的活性成分輸入到PubChem數(shù)據(jù)庫(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)，得到化合物的“Canonical SMILES”，然后將“Canonical SMILES”輸入SwissTarget Prediction平臺(http：//www.swisstarget prediction.ch/)，物種選擇“人類(Homo sapiens)”，預測香連片活性成分的潛在作用靶點.

1.3 香連片抗細菌性痢疾相關(guān)疾病作用靶點預測

使用GeneCards(https://genecards.weizmann.ac.il/v3/)、OMIM(http://omim.org/)、及PHARMGKB(https://www.pharmgkb.org/)3個疾病靶點數(shù)據(jù)庫，以“enteritis”、“dysentery”及“diarrhea”為關(guān)鍵詞進行檢索，刪除重復基因.將獲得的疾病靶點與活性成分靶點進行對比，得出共同靶基因.

1.4 香連片抗細菌性痢疾相關(guān)疾病的靶蛋白相互作用(protein protein interaction， PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

登錄STRING 數(shù)據(jù)庫(https：//string-db.org/)，輸入 1.3 項下收集的共同靶基因，設(shè)置物種為“人類(Homo sapiens)”，最低相互作用閾值為中等置信度(medium confidence)，其余參數(shù)保持默認，獲取靶蛋白相互作用數(shù)據(jù)，構(gòu)建 PPI 網(wǎng)絡(luò).通過Cytoscape 3.2.1 軟件構(gòu)建香連片的成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò).

1.5 GO功能富集與KEGG通路富集分析

將所得的成分與疾病共同靶基因通過DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)進行基因本體論(GO)分類富集分析和全基因組及代謝途徑富集分析(KEGG)，通過GO分類富集提取靶標基因或蛋白質(zhì)的分子功能(MF)、細胞組分(CC)，及其所參與的生物學反應(yīng)(BP)，通過這三個功能大類，對一個基因的功能進行多方面的限定和描述.通過KEGG通路富集靶點所涉及的信號通路，以P<0.01為條件進行靶基因篩選，分析香連片抗細菌性痢疾類疾病主要信號通路及生物過程.

2 結(jié)果

2.1 藥物活性成分和靶點預測

篩選香連片活性成分，按照 OB>30%，DL>0.18 的篩選條件，一共獲得42個活性成分，549個預測靶點.藥物活性成分和預測靶點數(shù)量見表1，成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖見圖1.

表1 香連片“中藥-成分-靶點”基本信息Tab.1 Xianglian Tablet "Traditional Chinese Medicine- Ingredients-Targets" basic information

圖1 香連片成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖Fig.1 Xianglian Tablet ingredient-target network map

2.2 香連片抗細菌性痢疾相關(guān)疾病活性靶點預測

使用OMIM等3個疾病數(shù)據(jù)庫，檢索到204個相關(guān)基因靶點.將549個活性成分靶點與204個疾病靶點進行對比，得到19個共有靶點(表2).構(gòu)建香連片的成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)(圖2).

表2 香連片抗細菌性痢疾相關(guān)疾病的作用靶點Tab.2 Targets of Xianglian Tablet for anti-bacterial dysentery-related diseases

圖2 香連片成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Xianglian Tablet ingredients-target-disease network map

2.3 共同靶蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過STRING 數(shù)據(jù)庫分析 19個映射得到的細菌性痢疾相關(guān)疾病的交集靶點，構(gòu)建預測香連片抗細菌性痢疾相關(guān)疾病靶點 PPI網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果見圖3.

圖3 香連片抗細菌性痢疾靶蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 PPI network diagram of Xianglian Tablet anti- bacterial dysentery-related diseases

2.4 GO功能富集分析

以P<0.01 為篩選條件，可篩選出參與藥效的主要分子功能(MF)有蛋白結(jié)合、ATP結(jié)合、蛋白酪氨酸激酶活性及Ras鳥嘌呤核苷酸交換因子活性等功能；參與藥效的主要細胞組分(CC)有質(zhì)膜、受體復合物、膜筏等；參與藥效的主要生物學過程(BP)有炎癥反應(yīng)、MAP激酶活性的正調(diào)控、蛋白質(zhì)磷酸化正調(diào)控及平滑肌細胞的正調(diào)控等(圖4).

2.5 KEGG富集分析

KEGG富集分析結(jié)果顯示，主要信號通路有8條，作用靶點及其所在信號通路見表 3.香連片中活性成分通過作用于人體中的相關(guān)靶點，對體內(nèi)信號通路如鈣信號通路、癌癥通路、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶信號通路等產(chǎn)生影響，最終影響疾病的發(fā)生發(fā)展.

圖4 GO功能富集分析Fig.4 GO function enrichment analysis

表3 KEGG通路富集Tab.3 KEGG pathway enrichment

3 討論

香連片組方藥來自于中藥傳統(tǒng)治痢名方“香連丸”，研究表明，香連片具有抗?jié)僛5]、抗腹瀉[6]、抗?jié)冃越Y(jié)腸炎和胃腸功能調(diào)節(jié)[7]等作用，常用于治療大腸濕熱所致的痢疾、腸炎、細菌性痢疾，癥見大便膿血、里急后重、發(fā)熱腹痛等.對于治療細菌性痢疾相關(guān)疾病，香連片的臨床使用是常與西藥聯(lián)合用藥[8-10]，弄清香連片在此類疾病上的作用機制，有利于研究探討其毒副作用.研究通過主要活性成分-疾病-靶點的預測，得到了大量相關(guān)靶點基因，如ERBB2、TNF、EPHA2等炎癥相關(guān)靶點基因.通過GO功能富集與KEGG富集分析，認為香連片抗細菌性痢疾等相關(guān)疾病與鈣信號通路、癌癥通路、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶信號通路有關(guān).此外本研究預測通路中還有很多癌癥相關(guān)通路，如膀胱癌信號通路、胰腺癌信號、癌癥中的蛋白聚糖信號通路等，為本方抗癌提供了新的研究方向.