稻瘟病抗性基因Pita2的克隆及其介導(dǎo)的防御相關(guān)基因表達分析

徐鑫，姜偉高，梁華兵，王曉婉，劉松青，王春臺

(中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院&武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護與利用湖北省重點實驗室&生物技術(shù)國家民委重點實驗室，武漢430074)

由稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)引起的稻瘟病是水稻最嚴重的病害之一[1].稻瘟病在水稻的整個生育期都可以發(fā)生，每年可造成10%～20%水稻減產(chǎn)，嚴重時減產(chǎn)40%～50%，甚至顆粒無收[2].稻瘟病在全球各地稻區(qū)均有發(fā)生，嚴重威脅著水稻的增產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)[3].長期的實踐證明，利用水稻自身對稻瘟病的宿主抗性，借助單個抗性基因或聚合多個抗性基因以提高水稻抗性，從而來培育抗稻瘟病水稻品種，被普遍認為是當(dāng)前最為經(jīng)濟、有效且安全的措施[4].由于稻瘟病菌群體普遍存在高度變異性，培育的單一抗性基因抗稻瘟病水稻品種通常在種植幾年后會喪失對稻瘟病的抗性[5].目前解決該問題的主要辦法就是聚合多個抗性基因，從而使得水稻品種獲得具有持久性的稻瘟病廣譜抗性，因此在遺傳資源中挖掘新的稻瘟病抗性基因尤為重要.

通過圖位克隆、全基因組序列分析和轉(zhuǎn)錄組分析等方法，研究人員對稻瘟病抗性基因進行廣泛研究，現(xiàn)已確定了大量的抗稻瘟病相關(guān)抗性基因[6].截至目前為止，研究人員已成功鑒定了100多個主要稻瘟病抗性基因，30個基因已經(jīng)完成分子克隆[7].稻瘟病抗性基因Pita2與Pita來源于同一抗性供體品種即菲律賓秈稻Tadukan[8]，兩個基因聚集并定位于水稻12號染色體的著絲粒區(qū)域.Pita很早就被克隆[9]，并在分子水平上研究了與相應(yīng)無毒基因AVR-Pita的相互作用[10]，在生產(chǎn)實踐上得到了廣泛應(yīng)用.Pita2對稻瘟病菌生理小種的抗譜比Pita更廣，擁有更大的應(yīng)用前景[11]，但由于染色體著絲粒區(qū)域存在高度重復(fù)序列和抑制重組的特性，Pita2的研究工作一直進展很慢.

通常，在病原微生物侵染植物后，被侵染的植物體部位與病原體會相互作用產(chǎn)生信號，并將信號傳導(dǎo)到其他組織，進而誘發(fā)植物體產(chǎn)生一系列防衛(wèi)防御反應(yīng).目前許多研究表明，水楊酸(Salicylic Acid,SA)和茉莉酸(Jasmonic Acid,JA)在植物體免疫應(yīng)答抗病信號途徑中具有重要的調(diào)控作用[12].一方面，在植物免疫應(yīng)答過程中，SA主要在系統(tǒng)獲得性抗性(Systemic Acquired Resistance,SAR)過程起到重要作用——即病原菌在成功侵染寄主植物后，寄主體內(nèi)會產(chǎn)生大量SA，導(dǎo)致病程相關(guān)蛋白(Pathogenesis Related Protein,PR)基因的表達，從而增強植物的抗病性[13].NH1和WRKY45是SA信號途徑的主要調(diào)控因子，過表達OsNH1或其同源基因后，成功激活SAR反應(yīng)后增加水稻的抗病性；若缺失OsNH1則SA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑不能被正常激活[14].此外，SA及其衍生物苯并噻二唑(BTH)可誘導(dǎo)OsWRKY45的表達，大量研究表明OsWRKY45的過表達可顯著增強水稻的抗病性，但該基因的沉默大大減弱了BTH誘導(dǎo)的稻瘟病抗性[15].另外一方面，水稻中JA可誘導(dǎo)OsPR1a,OsPR1b,OsPR2等PR基因的表達[16].OsAOS2是JA的合成相關(guān)基因，過表達該基因可以使PR基因表達上調(diào)，并且增強水稻抗病性.

在前期研究中，利用Co39 × Reiho(Pita2抗性親本的Co39近等基因系材料)的2031株F2群體，根據(jù)日本晴的參考序列，將Pita2定位于水稻12號染色體10.79～10.85 Mb靠近著絲粒的區(qū)域約75 kb范圍內(nèi).但由于目的區(qū)段與水稻日本晴及9311的基因組存在較大差異，無法通過常規(guī)的電子定位和長距離PCR等技術(shù)進行分離和克隆[17].本研究擬通過構(gòu)建并篩選該基因供體品種的Fosmid文庫，構(gòu)建Pita2候選區(qū)域的物理圖譜并互補驗證候選基因.進一步從本實驗室前期在武陵山區(qū)收集的稻瘟病菌生理小種庫中，篩選出基因型接近、對Pita2致病性完全相反的菌株組對水稻進行離體接種，擬通過檢測接種稻瘟病菌前后相關(guān)防御基因的表達量變化，分析在抗病過程中Pita2基因與水稻抗病信號通路的關(guān)系.

1 材料與方法

1.1 Fosmid文庫構(gòu)建

用CTAB法提取PiNo.4植株(Pita2抗性親本)的基因組DNA，經(jīng)酶切處理回收總長度25～50 kb的條帶.將回收的片段進行末端平滑化和磷酸化處理，再連接到pCC1FOS(EPICENTRE)載體上.4 ℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化后涂布平板.根據(jù)效價公式，titer(CFU/mL)=(克隆數(shù)×稀釋倍數(shù)×103μL/mL)/所用稀釋未擴增文庫的量(μL)，得出文庫的滴度為(2.7～4.3)×105CFU/mL.構(gòu)建的文庫預(yù)計總共獲得克隆為10萬多個，其平均插入片段為35 kb，按照大小約為430 Mb的日本晴水稻基因組，該文庫覆蓋基因組約為8.0～11.4倍.

1.2 真菌材料和疾病的評估

稻瘟病菌菌株來自本實驗室在武陵山區(qū)收集的病菌生理小種庫.菌株在燕麥培養(yǎng)基上培養(yǎng)14 d后，滅菌的去離子水清洗，然后在藍光環(huán)境下培養(yǎng)7 d(25 ℃，高濕度).用分生孢子懸浮液[(2～3)×105分生孢子/mL]噴灑接種4～5葉期幼苗.接種后在濕度培養(yǎng)箱(25 ℃，100%相對濕度)中培養(yǎng)30 h，再將水稻幼苗移至溫室，當(dāng)其出現(xiàn)病斑10 d后對其進行復(fù)查.在調(diào)查發(fā)病情況時，選擇病斑長度最長的植株.

1.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化

處理后的日本晴水稻種子在N6誘導(dǎo)培養(yǎng)基上28 ℃光照培養(yǎng)6 d之后，在水稻胚的一端長出淺黃色致密的愈傷組織；用含有候選基因的農(nóng)桿菌侵染生長狀態(tài)良好的愈傷組織，在28 ℃暗培養(yǎng)3 d后，置于篩選培養(yǎng)基上培育至長出新的愈傷組織；將新生長出的愈傷組織置于分化培養(yǎng)基上，28 ℃光照培養(yǎng)，根據(jù)分化狀態(tài)再選擇性地進行分化繼代工作.最后將分化出來的小苗移植到生根培養(yǎng)基上2周左右.

1.4 qPCR分析

用TRIzol法對接種前后水稻葉片提取RNA，在DNase處理后經(jīng)反轉(zhuǎn)錄形成cDNA.用Actin引物進行PCR擴增，條帶大小符合預(yù)期.以cDNA為模板，進行RT-PCR程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共36個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min，制備1%瓊脂糖凝膠檢測PCR產(chǎn)物.內(nèi)參基因與目的基因同時擴增，每個樣品3次技術(shù)重復(fù).qPCR在實時熒光定量PCR儀上進行，采用2-△△Ct算法分析計算結(jié)果.

2 結(jié)果與分析

2.1 Pita2物理圖譜的構(gòu)建和候選基因的預(yù)測

通過對本課題組前期篩選出的分子標記的進一步驗證，挑選出8對特異性分子標記，進行PiNo.4文庫的篩選，獲得覆蓋Pita2候選區(qū)域的3個Fosmid克隆，構(gòu)建了Pita2區(qū)域基于抗性親本PiNo.4的物理圖譜(圖1)，并對該區(qū)域的候選基因進行了功能預(yù)測(表1).

圖1 稻瘟病抗性基因Pita2的物理圖譜以及候選基因的分布Fig.1 The physical map of the rice blast resistance gene Pita2 with the candidate ORF

表1 Pita2候選基因功能預(yù)測Tab.1 The function prediction of the Pita2 candidate genes

2.2 Pita2候選基因的互補驗證

通過反轉(zhuǎn)錄PCR擴增來分析Pita2候選基因表達情況，確認有5個具有表達的基因(Pi-ta2-Seq4，Pi-ta2-Seq5，Pi-ta2-Seq6，Pi-ta2-Seq8和Pi-ta2-Seq9).選用這些基因進行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化,經(jīng)鑒定為陽性的轉(zhuǎn)基因植株培育至四葉期后，采摘劍葉，離體接種稻瘟病菌生理小種race007.觀察統(tǒng)計10 d后接種情況如圖2所示，與陰性對照Nip(“日本晴”品種，表現(xiàn)為稻瘟病感病表型)相比，含有候選基因Pi-ta2-Seq5、Pi-ta2-Seq6、Pi-ta2-Seq8和Pi-ta2-Seq9的植株表現(xiàn)出與Nip相近的病斑情況——表現(xiàn)出感病表型.而含有候選基因Pi-ta2-Seq4植株表現(xiàn)出與陽性對照PiNo.4一致的病斑情況——表現(xiàn)出對稻瘟病極強的抗病性，揭示了候選基因Pi-ta2-Seq4就是稻瘟病抗性基因Pita2.

圖2 轉(zhuǎn)基因T1陽性植株接種稻瘟病菌race007Fig.2 The symptom of the T1 progeny inoculated with M.oryzae race 007

2.3 Pita2介導(dǎo)的抗性反應(yīng)中相關(guān)防御基因表達量檢測

從前期在武陵山區(qū)收集的稻瘟病病菌生理小種庫中，篩選出了一組遺傳距離相近、對PiNo.4致病性差異較大的菌株13014和13015進行離體接種.NIP(粳稻，水稻標準測序品種)、LTH(麗江新團黑谷，秈稻，稻瘟病易感品種)、Co39(粳稻，稻瘟病易感品種)、Pita2供體品種PiNo.4繁種移栽培育至4～5葉期后，采摘劍葉或下一葉，離體接種稻瘟病菌13014和13015.觀察統(tǒng)計接種10 d后情況如圖3所示，與感病植株Nip、LTH、Co39相比，PiNo.4對稻瘟病菌13014的侵染表現(xiàn)出感病情況，然而PiNo.4對稻瘟病13015的侵染則表現(xiàn)出抗病情況.這兩組菌表現(xiàn)的致病性結(jié)果與篩選菌株時所用的致病性分析結(jié)果完全吻合，可以作為研究防御基因變化接種使用的稻瘟病菌.

圖3 四種水稻植株接種不同稻瘟病菌的感病情況Fig.3 Four rice cultivars inoculated with different rice blast fungus

對接種稻瘟病菌株13014和13015前后水稻中稻瘟病相關(guān)的防御基因(WRKY45、PR1b、NPR1和AOS2)進行檢測，結(jié)果如圖4所示.PiNo.4植株中WRKY45基因本底表達水平比其他易感植株高，在接種稻瘟病菌13014和13015后，易感株WRKY45基因均無明顯變化；在PiNo.4植株中WRKY45基因呈顯著下調(diào)，說明該信號通路可能受到抑制.在SA信號通路中，WRKY45和OsNH1基因獨立表達，互不干涉[18].PiNo.4株中OsNH1基因在接種稻瘟病菌后呈顯著上調(diào)，表明PiNo.4植株通過基因OsNH1介導(dǎo)SA免疫信號通路.位于OsNH1下游的OsPR1b在接種稻瘟病菌13014后顯著下調(diào)，說明該基因的表達受到稻瘟病菌的抑制；在接種稻瘟病菌13015后上調(diào)，表明稻瘟病菌13015不足以抑制OsPR1b的表達.在接種稻瘟病菌13014和13015后，PiNo.4植株中OsAOS2表達量均出現(xiàn)顯著上調(diào)的現(xiàn)象，表明稻瘟病菌的侵染成功激活了水稻中JA抗病信號通路.上述稻瘟病相關(guān)防御基因的表達量表明PiNo.4植株在稻瘟病菌侵染后均成功激活了SA和JA抗病信號通路，但在接種了稻瘟病菌13014的PiNo.4植株中，SA信號通路的OsPR1b受抑制，下游免疫信號途徑受抑制，表現(xiàn)出感病癥狀；而接種了稻瘟病菌13015的植株中，OsPR1b表達上調(diào)，能成功激活下游抗病基因，從而產(chǎn)生抗病反應(yīng)，與離體接種的實驗結(jié)果完全吻合.

圖4 接種前后與抗病防御相關(guān)基因的表達量Fig.4 Expression level of defense-related genes before and after inoculation

3 結(jié)語

在前期研究中利用近等基因系群體，通過HEGES系統(tǒng)和SNPs測序?qū)CR標記進行研究，成功分離Pita和Pita2基因，對Pita2進行了精細定位.鑒于該區(qū)段與日本晴序列差異很大，通過常規(guī)長片段PCR克隆的方法很難得到目的基因，本研究通過構(gòu)建基于抗性親本 PiNo.4的Fosmid 文庫，篩選了覆蓋目標約75 kb區(qū)段的3個Fosmid克隆，構(gòu)建了基于抗性親本的物理圖譜.通過候選基因的互補驗證，確定了候選基因Pita2-Seq4就是稻瘟病抗性基因Pita2.賈育林課題組在抗性親本Katy克隆了Ptr基因，發(fā)現(xiàn)其特異性地參與Pita/Pita2介導(dǎo)的抗稻瘟病過程，Ptr的突變消除了Pita2相關(guān)的AVR-Pita和Pita2特異性AVR基因的識別.同時Ptr與Pita2的抗譜也高度相似，推測其可能就是Pita2[19].Ptr與候選基因Pita2-Seq4的日本晴同源基因一致，因此本研究通過在Pita2標準抗性親本中的基因克隆及互補驗證，確定Ptr和Pita2為同一基因.

一組稻瘟病菌基因型接近、對Pita2致病性相反的菌株對Pita2抗性水稻進行離體接種，結(jié)果表明Pita2基因在稻瘟病菌侵染后均成功激活了SA和JA抗病信號通路，但主要是通過參與水稻SA信號通路，從而賦予水稻抗性.