CDCA7通過與MCM3相互作用介導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞增殖、侵襲及遷移

鄧 路 ，何志偉 ，朱昌毫，陳世裕，劉燕青，李 琳，孫誠誼，喻 超

[作者單位]1.貴州醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院肝膽外科，貴州 貴陽 550004；3.貴州醫(yī)科大學(xué)肝膽胰脾重點實驗室，貴州 貴陽 550004；4.貴州省肝膽胰脾疾病研究所，貴州 貴陽 550004

胰腺癌的惡性程度高，2019年美國腫瘤年度報告指出，胰腺癌死亡率在所有腫瘤中位列第6，5年生存率低于7%[1]。隨著臨床醫(yī)療水平的提高，針對胰腺癌患者的系統(tǒng)治療也在不斷地改善。目前認(rèn)為，早期手術(shù)切除是治療胰腺癌最有效的方式，但由于胰腺癌發(fā)病隱匿，早期診斷極為困難，大多數(shù)患者在確診時已錯過了最佳的手術(shù)時機[2]。而且胰腺癌發(fā)展迅速，預(yù)后差，其原因是胰腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移能力很強[3]。因此，研究胰腺癌細(xì)胞增殖、侵襲及遷移的生物學(xué)功能和分子機制有助于闡明胰腺癌的發(fā)生和發(fā)展過程，利于早期診斷和治療。

細(xì)胞分裂周期相關(guān)蛋白7（cell division cycleassociated protein 7，CDCA7）基因又名JPO1，是一種新型c-Myc應(yīng)答基因，定位于人染色體2q31上，編碼由371個氨基酸組成的核蛋白[4]。JPO1基因在細(xì)胞周期中周期性表達(dá)，在G1和S期之間達(dá)到最高水平，2005年被人類基因組命名委員會正式命名為CDCA7[5]。研究發(fā)現(xiàn)，CDCA7與Myc具有關(guān)聯(lián)，而且這種關(guān)聯(lián)受磷酸化依賴方式調(diào)節(jié)。蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）可使CDCA7的第163位點蘇氨酸發(fā)生磷酸化，促進(jìn)與14-3-3蛋白（14-3-3 proteins，14-3-3）的結(jié)合，與Myc分離，并被轉(zhuǎn)運到細(xì)胞質(zhì)中[6]。以往對CDCA7基因的研究主要集中在CDCA7和Myc之間的相互作用上[4,6-7]，而對CDCA7基因本身的功能和機制研究較少。已有研究表明，CDCA7基因是轉(zhuǎn)錄因子Myc和E2F轉(zhuǎn)錄因子1（E2F Transcription Factor 1，E2F1）的下游靶基因，參與細(xì)胞周期過程，可作為很多基因的表達(dá)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，提示其很可能通過調(diào)控某一基因的表達(dá)來調(diào)控細(xì)胞的增殖或凋亡，從而引起腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[8]。

近年來，有研究者相繼報道了CDCA7基因在人類腫瘤中的表達(dá)情況[9-11]，發(fā)現(xiàn)各種腫瘤中CDCA7的表達(dá)量均有顯著增高，但是CDCA7基因是否參與胰腺癌的發(fā)生和發(fā)展尚待進(jìn)一步研究。本研究主要從增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移等方面探討CDCA7在胰腺癌中所起的作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和試劑

人正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞HPDE和人胰腺癌細(xì)胞株Bxpc-3、CFPAC-1、PANC-1、MIA PaCa-2、Capan2及SW1990細(xì)胞均由武漢華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院膽胰實驗室惠贈。胎牛血清、胰蛋白酶、DMEM及RPMI 1640培養(yǎng)液購自美國Gibco公司。兔抗人CDCA7多克隆抗體購自美國Affanity公司，兔抗人微型染色體維持蛋 白3（minichromosome maintenance protein 3，MCM3）多克隆抗體、兔抗人波形蛋白（Vimentin）單克隆抗體、小鼠抗人E-鈣黏蛋白（E-cadherin）單克隆抗體、兔抗人細(xì)胞周期蛋白D1（cyclin D1）單克隆抗體和小鼠抗人cyclin E1單克隆抗體購自美國Cell Signaling公司，鼠抗人GAPDH單克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠或兔IgG（二抗）、高靈敏化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司，Protein A＋G瓊脂糖和CCK-8試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司；Transwell小室購自美國Corning公司，基質(zhì)膠（Matrigel）購自美國BD公司，RNA提取試劑TRIzol購自美國Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR Premix ExTaq試劑盒均購自日本TaKaRa公司。攜帶CDCA7-shRNA的重組慢病毒及陰性對照病毒、HitransG A病毒感染試劑購自上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司；CDCA7-shRNA（CDCA7-shRNA1序列：5’-GACTATTGATACCAAAACA-3’，CDCA7-shRNA2序列：5’-GTGCATGCCTACTTGAAAA-3’，CDCA7-shRNA3序列：5’-CCAACTCCGATTCAGAAGA-3’）。CDCA7基因引物由武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司設(shè)計并完成；CDCA7基因上游引物序列為5’-GAGAACGTCTGCAGCAATTC-3’，下游引物序列為5’-ATCCCTGACCTCTTCACCATA-3’；GAPDH基因（內(nèi)參照）上游引物序列為5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’，下游引物序列為5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’。

1.2 生物信息學(xué)分析

利用癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）和基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)動態(tài)分析（Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA）數(shù)據(jù)庫（http://gepia2.cancer-pku.cn）網(wǎng)站，依次選擇Expression Analysis和Genaral，輸入基因名稱CDCA7，分析數(shù)據(jù)庫中各種腫瘤組織和正常組織中CDCA7的表達(dá)水平；進(jìn)一步在GEPIA網(wǎng)站中選擇Expression DIY，輸入基因名稱CDCA7，選擇胰腺導(dǎo)管腺癌數(shù)據(jù)庫PAAD，在線分析CDCA7在胰腺癌組織和正常胰腺組織中的表達(dá)。利用STRING網(wǎng)站（https://version11.string-db.org）在線分析，選擇胰腺導(dǎo)管腺癌數(shù)據(jù)庫PAAD，輸入基因名稱CDCA7，進(jìn)行數(shù)據(jù)庫分析，結(jié)果顯示CDCA7與MCM3存在相互作用；進(jìn)一步利用GEPIA數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站，依次選擇Correlation Analysis和胰腺導(dǎo)管腺癌數(shù)據(jù)庫PAAD，輸入CDCA7和MCM3，在線分析CDCA7和MCM3蛋白存在相關(guān)性。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

人正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞株HPDE和人胰腺癌細(xì)胞株Bxpc-3、CFPAC-1、PANC-1、MIA PaCa-2、Capan2及SW1990細(xì)胞分別用含10%胎牛血清的DMEM及RPMI 1640培養(yǎng)液培，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.4 實時熒光定量PCR檢測人正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞和胰腺癌細(xì)胞中CDCA7 mRNA的表達(dá)水平

收集處于對數(shù)生長期的各組細(xì)胞（人正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞HPDE和人胰腺癌細(xì)胞株Bxpc-3、CFPAC-1、PANC-1、MIA PaCa-2、Capan2及SW1990細(xì)胞），提取細(xì)胞總RNA，選取D260nm/D280nm值在1.8～2.0的樣品進(jìn)行PCR擴增。取800 ng總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA；反轉(zhuǎn)錄體系（20 μL）：5×PrimeScript Buffer 4 μL，PrimeScript反轉(zhuǎn)錄酶混合液1 μL，Oligo dT引物1 μL，隨機的6核苷酸引物1 μL，總RNA 800 ng，然后用無酶水補充體積至20 μL。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明，將200 μL無酶EP管置于反轉(zhuǎn)錄儀器內(nèi)，條件參數(shù)設(shè)置為37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，將樣品反轉(zhuǎn)錄為cDNA。再選擇GAPDH基因作為內(nèi)參，使用SYBR Premix Ex Taq試劑盒進(jìn)行實時熒光定量PCR擴增，反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex Taq 6.25 μL，CDCA7基因或GAPDH基因上下游引物各0.25 μL，cDNA 1.0 μL，無酶水4.75 μL；PCR擴增條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。以2－ΔΔCt值表示目的基因的相對表達(dá)水平。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測人正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞和胰腺癌細(xì)胞中CDCA7蛋白的表達(dá)水平

將生長狀態(tài)良好的各組細(xì)胞（人正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞株HPDE和人胰腺癌細(xì)胞株Bxpc-3、CFPAC-1、PANC-1、MIA PaCa-2、Capan2及SW1990細(xì)胞）用胰蛋白酶消化后，裂解細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白，將處理后的蛋白樣品行SDSPAGE，電泳結(jié)束后將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用含5%脫脂牛奶的封閉液封閉2 h；加入一抗[兔抗人CDCA7多克隆抗體和鼠抗人GAPDH單克隆抗體（體積稀釋比例均為1∶1 000）]4 ℃反應(yīng)過夜；隨后加入二抗[辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠或兔IgG（體積稀釋比例均為1∶5 000）]進(jìn)行反應(yīng)，最后加入高靈敏電化學(xué)發(fā)光劑曝光、顯影。以目蛋白條帶與內(nèi)參照GAPDH蛋白條帶灰度值之比表示目的蛋白的相對表達(dá)水平。

1.6 重組慢病毒感染

選取對數(shù)期生長的PANC-1細(xì)胞接種于6孔板中，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個/孔，用HitransG A病毒感染試劑進(jìn)行重組慢病毒感染。實驗分組如下：空白對照組，不對細(xì)胞進(jìn)行處理的PANC-1細(xì)胞；陰性對照（negativecontrol，NC）-shRNA組，用NC-shRNA重組慢病毒感染PANC-1細(xì)胞；CDCA7-shRNA1組、CDCA7-shRNA2組和CDCA7-shRNA3組，分別用CDCA7-shRNA1、CDCA7-shRNA2和CDCA7-shRNA3重組慢病毒感染PANC-1細(xì)胞，構(gòu)建CDCA7干擾組。感染流程嚴(yán)格按照HitransG A病毒感染試劑說明書進(jìn)行操作，篩選穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株，并分別采用實時熒光定量PCR法和蛋白質(zhì)印跡法檢測感染效率（檢測流程參閱1.4節(jié)和1.5節(jié)）。

1.7 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖

收集NC-shRNA組、CDCA7-shRNA2組和CDCA7-shRNA3組PANC-1細(xì)胞消化并計數(shù)，按照3×103個/孔的密度接種于96孔板中（每組細(xì)胞設(shè)置5個復(fù)孔），分別于24、48及72 h共3個時間點檢測PANC-1細(xì)胞的增殖能力；每孔均加入CCK-8試劑10 μL，在避光條件下置于37 ℃恒溫箱中孵育2 h，取出后輕微振蕩搖勻，置于酶聯(lián)免疫檢測儀上450 nm波長處檢測各孔的D值，并繪制生長曲線。

1.8 平板克隆實驗

收集處于對數(shù)生長期的各組細(xì)胞（細(xì)胞分組同1.7節(jié)）消化并計數(shù)，以1×103個細(xì)胞/孔的密度接種于6孔板中，置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)10～14 d后，用4%多聚甲醛溶液固定20～30 min，再用0.1%結(jié)晶紫染液染色20～30 min，流水沖洗后置于烘干箱中烘干，拍照記錄克隆生長情況，以＞50個細(xì)胞的克隆計為1個克隆。

1.9 細(xì)胞劃痕愈合實驗

收集處于對數(shù)生長期的各組細(xì)胞（細(xì)胞分組同1.7節(jié)）消化并計數(shù)，以4×105個細(xì)胞/孔的密度接種于6孔板中，待其均勻單層鋪滿至90%時，用200 μL移液器槍頭置于各孔上方，沿直尺垂直均勻地劃線，用PBS清洗劃下的細(xì)胞，加入不含胎牛血清的培養(yǎng)液，分別于0、24及48 h時置于倒置光學(xué)顯微鏡（放大倍數(shù)為40倍）下拍照記錄細(xì)胞的遷移距離。

1.10 細(xì)胞侵襲及遷移實驗

收集處于對數(shù)生長期的各組細(xì)胞（細(xì)胞分組同1.7節(jié)）用無血清培養(yǎng)液饑餓處理24 h后消化計數(shù)，將Matrigel與無血清培養(yǎng)液按照1∶8的體積比例稀釋，取60 μL稀釋后的Matrigel鋪在Transwell小室的上室膜上，待膠凝固后。在上室中接種1×105個/孔的細(xì)胞懸液200 μL，下室加入600 μL含20%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，置于37 ℃恒溫箱中孵育24～48 h后，用4%多聚甲醛溶液固定細(xì)胞20～30 min，再用0.1%結(jié)晶紫染液染色20～30 min，用棉簽輕輕除去上室中未穿過小室的細(xì)胞，置于烘干箱中烘干；最后在倒置光學(xué)顯微鏡（放大倍數(shù)為400倍）選取5個視野拍照記錄并計數(shù)穿過小室膜的細(xì)胞數(shù)。Transwell小室遷移實驗中不鋪設(shè)Matrigel，其余步驟同前述的侵襲實驗。

1.11 蛋白質(zhì)印跡法檢測干擾CDCA7表達(dá)后對PANC-1細(xì)胞中上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialmesenchymal transition，EMT）相關(guān)蛋和細(xì)胞周期蛋白表達(dá)水平的影響

收集處于對數(shù)生長期的各組細(xì)胞（細(xì)胞分組同1.7節(jié)）采用蛋白質(zhì)印跡法檢測PANC-1細(xì)胞中CDCA7、Vimentin、E-cadherin、cyclin D1和cyclin E1蛋白的表達(dá)水平，其中一抗分別為兔抗人CDCA7多克隆抗體、兔抗人Vimentin單克隆抗體、小鼠抗人E-cadherin單克隆抗體、兔抗人cyclin D1單克隆抗體、小鼠抗人cyclin E1單克隆抗體和鼠抗人GAPDH單克隆抗體（內(nèi)參照）（體積稀釋比例均為1∶1 000）；檢測流程參閱1.5節(jié)。

1.12 免疫共沉淀實驗

在PANC-1細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染pFlag-CDCA7和p-MCM3重組慢病毒，將生長狀態(tài)良好的PANC-1細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，裂解細(xì)胞抽提細(xì)胞總蛋白；加入20 μL充分重懸的Protein A＋G瓊脂糖，4 ℃搖床2 h，加入2 μL兔抗人CDCA7多克隆抗體，4 ℃搖床上處理過夜；加入20 μL充分重懸的Protein A＋G瓊脂糖，離心去除上清液，加入40 μL 2×上樣緩沖液，將瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合物重懸沉淀，瞬時離心把樣品離心至管底；95 ℃煮沸5 min，取部分或者全部樣品用于SDS-PAGE，電泳結(jié)束后分別用兔抗人CDCA7多克隆抗體和兔抗人MCM3多克隆抗體檢測CDCA7和MCM3蛋白的表達(dá)水平，檢測流程參閱1.5節(jié)。

1.13 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 人胰腺癌組織中CDCA7高表達(dá)

對TCGA和GEPIA數(shù)據(jù)庫中的腫瘤相關(guān)數(shù)據(jù)分析結(jié)果（圖1A）顯示，CDCA7在各種類型的癌組織和正常組織中的表達(dá)水平均不同。進(jìn)一步分析CDCA7在胰腺癌組織和正常胰腺組織中的表達(dá)情況，結(jié)果（圖1B）顯示胰腺癌組織中CDCA7的表達(dá)水平明顯提高（P＜0.05）。

2.2 人胰腺癌細(xì)胞系中CDCA7的表達(dá)情況

分別采用實時熒光定量PCR和蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果胰腺癌細(xì)胞系中CDCA7 mRNA和蛋白的表達(dá)水平。實時熒光定量PCR法檢測結(jié)果（圖2A）顯示，胰腺癌PANC-1、MIA PaCa-2和SW1990細(xì)胞的CDCA7 mRNA的表達(dá)水平均高于人正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞HPDE中CDCA7 mRNA的表達(dá)水平（P值均＜0.05），而胰腺癌Bxpc-3、CFPAC-1和Capan2細(xì) 胞 中CDCA7 mRNA的表達(dá)水平則均低于人正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞HPDE（P值均＜0.05）。蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果（圖2B）同樣顯示，胰腺癌PANC-1、SW1990和MIA PaCa-2細(xì)胞中CDCA7蛋白的表達(dá)水平高于HPDE細(xì)胞，并以在PANC-1細(xì)胞中的表達(dá)水平最高。因此，選擇PANC-1細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

2.3 重組慢病毒感染后PANC-1細(xì)胞中CDCA7 mRNA和蛋白表達(dá)水平的變化

實時熒光定量PCR法檢測結(jié)果（圖3A）顯示，與空白對照組和NC-shRNA組相比，CDCA7-shRNA1組PANC-1細(xì)胞中CDCA7 mRNA的表達(dá)水平無明顯變化，CDCA7-shRNA2和CDCA7-shRNA3組中CDCA7 mRNA的表達(dá)水平均明顯下調(diào)（P值均＜0.05）。

蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果（圖3B）同樣顯示，與空白對照組和NC-shRNA組相比，CDCA7-shRNA1組PANC-1細(xì)胞中CDCA7蛋白的表達(dá)水平無明顯變化，CDCA7-shRNA2和CDCA7-shRNA3組中CDCA7 mRNA的表達(dá)水平均明顯下調(diào)（P值均＜0.05）。

因此，選擇CDCA7-shRNA2和CDCA7-shRNA3組用于后續(xù)CDCA7干擾后的細(xì)胞功能研究。

2.4 干擾CDCA7表達(dá)后PANC-1細(xì)胞增殖能力變化

CCK-8法檢測結(jié)果（圖4A）顯示，48和72 h時，與NC-shRNA組相比，CDCA7-shRNA2和CDCA7-shRNA3組PANC-1細(xì)胞的增殖能力明顯降低（P＜0.05和P＜0.01）。

平板克隆實驗結(jié)果（圖4B）顯示NCshRNA組中細(xì)胞集落數(shù)為（309.2±10.0）個，CDCA7-shRNA2組為（165.3±7.0）個，CDCA7-shRNA3組為（160.7±6.0）個，提示干擾CDCA7表達(dá)后PANC-1細(xì)胞的增殖能力明顯減弱（P值均＜0.05）。

上述結(jié)果提示，干擾CDCA7表達(dá)能顯著抑制PANC-1細(xì)胞的增殖能力。

2.5 干擾CDCA7表達(dá)對PANC-1細(xì)胞侵襲及遷移能力的影響

細(xì)胞劃痕愈合實驗結(jié)果（圖5A）顯示，在相同的時間內(nèi)，與NC-shRNA組相比，CDCA7-shRNA2和CDCA7-shRNA3組PANC-1細(xì)胞的遷移距離變短，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P值均＜0.05）。

Transwell小室遷移及侵襲檢測結(jié)果（圖5B）顯示，NC-shRNA組發(fā)生遷移的細(xì)胞數(shù)為（606±6）個，發(fā)生侵襲的細(xì)胞數(shù)為（417±10）個，CDCA7-shRNA2組發(fā)生遷移的細(xì)胞數(shù)為（346±6）個，發(fā)生侵襲的細(xì)胞數(shù)為（268.5±8.5）個，CDCA7-shRNA3組發(fā)生遷移的細(xì)胞數(shù)為（352±9）個，發(fā)生侵襲的細(xì)胞數(shù)為（275±6）個，與NC-shRNA組相比，CDCA7-shRNA2和CDCA7-shRNA3組PANC-1細(xì)胞的發(fā)生遷移和侵襲的細(xì)胞數(shù)均明顯減少（P值均＜0.05）。

Fig.1 The expression of cell division cycle-associated protein 7 (CDCA7) in different tumors and normal tissues (A),and the expression of CDCA7 in pancreatic cancer and normal pancreatic tissues (B) were analyzed by The Cancer Genome Atlas (TCGA) and Gene Expression Profiling Interactive Analysis(GEPIA) databases.ACC:Adrenal cortical carcinoma;BLCA:Bladder urothelial carcinoma;BRCA:Breast invasive carcinoma;CESC:Cervical squamous cell carcinoma and endocervical adenocarcinoma;CHOL:Cholangiocarcinoma;COAD:Colon adenocarcinoma;DLBC:Lymphoid neoplasm diffuse large B-cell lymphoma;ESCA:Esophageal carcinoma;GBM:Glioblastoma multiforme;HNSC:Head and neck squamous cell carcinoma;KICH:Kidney chromophobe;KIRC:Kidney renal clear cell carcinoma;KIRP:Kidney renal papillary cell carcinoma;LAML:Acute myeloid leukemia;LGG:Brain lower grade flioma;LIHC:Liver hepatocellular carcinoma;LUAD:Lung adenocarcinoma;LUSC:Lung squamous cell carcinoma;OV:Ovarian serous cystadenocarcinoma;PAAD:Pancreatic adenocarcinoma;PCPG:Pheochromocytoma and paraganglioma;PRAD:Prostate adenocarcinoma;READ:Rectum adenocarcinoma;SARC:Sarcoma;SKCM:Skin cutaneous melanoma;STAD:Stomach adenocarcinoma;TGCT:Testicular germ cell tumors;THCA:Thyroid carcinoma;THYM:Thymoma;UCEC:Uterine corpus endometrial carcinoma;UCS:Uterine carcinosarcoma;TPM:Transcript per million.圖1 采用TCGA數(shù)據(jù)庫分析CDCA7在不同腫瘤（A）及胰腺癌及其癌旁組織（B）中的表達(dá)情況

Fig.2 The expression levels of cell division cycle-associated protein 7 (CDCA7) mRNA (A) and protein(B) in human normal pancreatic ductal epithelial HPDE cells and pancreatic cancer PANC-1,MIA PaCa-2,SW1990,CFPAC-1,Capan 2 and Bxpc-3 cells were detected by real-time fluorescent quantitative PCR and Western blotting,respectively.*P＜0.05, vs HPDE cells (n=3).圖2 分別采用實時熒光定量PCR法（A）和蛋白質(zhì)印跡法（B）檢測人正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞和胰腺癌細(xì)胞中CDCA7 mRNA和蛋白的表達(dá)水平

上述結(jié)果提示，干擾CDCA7表達(dá)后能明顯抑制PANC-1細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

Fig.3 The expression levels of cell division cycle-associated protein 7 (CDCA7) mRNA (A) and protein(B) in PANC-1 cells transfected with CDCA7-shRNA were detected by real-time fluorescence quantitative PCR and Western blotting,respectively.Blank:PANC-1 cells were infected with the empty vector lentivirus;NC-shRNA:PANC-1 cells were infected with the recombinant lentivirus carrying negative control (NC)-shRNA;CDCA7-shRNA1,CDCA7-shRNA2 and CDCA7-shRNA3:PANC-1 cells were infected with the recombinant lentivirus carrying CDCA7-shRNA1,CDCA7-shRNA2 and CDCA7-shRNA3.*P＜0.05,***P＜0.001 (n=3).圖3 分別采用實時熒光定量PCR法（A）和蛋白質(zhì)印跡法（B）檢測轉(zhuǎn)入CDCA7-shRNA后對PANC-1細(xì)胞中CDCA7 mRNA和蛋白的表達(dá)水平的影響

Fig.4 After cell division cycle-associated protein 7 (CDCA7) gene interfering,the proliferation of PANC-1 cells was detected by CCK-8 (A) and colony formation assay (B),respectively.NC-shRNA:PANC-1 cells were infected with the recombinant lentivirus carrying negative control (NC)-shRNA;CDCA7-shRNA2 and CDCA7-shRNA3:PANC-1 cells were infected with the recombinant lentivirus carrying CDCA7-shRNA2 and CDCA7-shRNA3.*P＜0.05,**P＜0.01,vs NC-shRNA (n=3).圖4 分別采用CCK-8（A）和平板克隆實驗（B）檢測干擾CDCA7表達(dá)對胰腺癌細(xì)胞增殖能力的影響

Fig.5 After cell division cycle-associated protein 7 (CDCA7) gene interfering,the invasion and migration abilities of PANC-1 cells were detected by wound healing assay (A) and Transwell chamber assay (B).NCshRNA:PANC-1 cells were infected with the recombinant lentivirus carrying negative control (NC)-shRNA;CDCA7-shRNA2 and CDCA7-shRNA3:PANC-1 cells were infected with the recombinant lentivirus carrying CDCA7-shRNA2 and CDCA7-shRNA3.*P＜0.05,vs NC-shRNA (n=3).圖5 分別采用細(xì)胞劃痕愈合實驗（A）和Transwell小室遷移和侵襲實驗（B）檢測干擾CDCA7表達(dá)對胰腺癌PANC-1細(xì)胞遷移（A）及侵襲（B）能力的影響

2.6 干擾CDCA7表達(dá)后對EMT相關(guān)蛋白和細(xì)胞周期蛋白表達(dá)水平的影響

蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果（圖6）顯示：與NC-shRNA組比較，2個CDCA7-shRNA組（CDCA7-shRNA2和CDCA7-shRNA3）PANC-1細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白Vimentin和細(xì)胞周期蛋白cyclin D1和cyclin E1的表達(dá)水平均明顯下調(diào)，但E-cadherin蛋白表達(dá)水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P值均＜0.05）。

2.7 CDCA7與MCM3存在相互作用

通過STRING和GEPIA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行CDCA7與其他蛋白相關(guān)性的分析，結(jié)果（圖7A和7B）顯示，CDCA7與MCM2～7復(fù)合物顯著相關(guān)（P＜0.05），提示CDCA7與MCM蛋白可能存在密切聯(lián)系。進(jìn)一步在PANC-1細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染攜帶有pFlag-CDCA7和p-MCM3的慢病毒，通過免疫共沉淀實驗檢測CDCA7與MCM3之間的相互作用情況。免疫共沉淀法檢測結(jié)果（圖7C）顯示，CDCA7與MCM3存在相互作用關(guān)系；蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果（圖7D）顯示，干擾CDCA7表達(dá)后MCM3蛋白的表達(dá)水平明顯下調(diào)。

Fig.6 The expression levels of epithelial-mesenchymal transition (EMT)-related protein Vimentin and E-cadherin proteins,as well as cell cycle protein cyclin D1 and cyclin E1 after cell division cycle-associated protein 7 (CDCA7) gene interfering were detected by Western blotting.NC-shRNA:PANC-1 cells were infected with the recombinant lentivirus carrying negative control (NC)-shRNA;CDCA7-shRNA2 and CDCA7-shRNA3:PANC-1 cells were infected with the recombinant lentivirus carrying CDCA7-shRNA2 and CDCA7-shRNA3.*P＜0.05,vs NC-shRNA (n=3).圖6 干擾CDCA7表達(dá)后對PANC-1細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白Vimentin和E-cadherin以及細(xì)胞周期蛋白cyclin D1和cyclin E1表達(dá)水平的影響

Fig.7 The expression correlation between cell division cycle-associated protein 7 (CDCA7) and minichromosome maintenance protein 3 (MCM3) was analyzed by STRING database (A) and Gene Expression Profiling Interactive Analysis (GEPIA) databases (B).The interaction between CDCA7 and MCM3 in PANC-1 cells was detected by coimmunoprecipitation assay (C);The MCM3 protein expression level after (CDCA7) gene interfering was detected by Western blotting.NC-shRNA:PANC-1 cells were infected with the recombinant lentivirus carrying negative control (NC)-shRNA;CDCA7-shRNA2 and CDCA7-shRNA3:PANC-1 cells were infected with the recombinant lentivirus carrying CDCA7-shRNA2 and CDCA7-shRNA3;TPM:Transcript per million.圖7 CDCA7與MCM3之間的相關(guān)性

3 討論

CDCA7定位于染色體2q31，其突變會導(dǎo)致免疫缺陷-著絲粒不穩(wěn)定性-面部異常綜合征[12]。CDCA7在食管癌[13]、結(jié)直腸癌[14]、乳腺癌[10]、肺腺癌[15]等腫瘤中高表達(dá)，參與調(diào)節(jié)腫瘤的增殖、侵襲及遷移過程，且與患者預(yù)后密切相關(guān)。本研究通過GEPIA數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，CDCA7在胰腺癌中高表達(dá)。進(jìn)一步通過實時熒光定量PCR法和蛋白質(zhì)印跡法檢測發(fā)現(xiàn)，與人正常胰腺上皮細(xì)胞HPDE相比，CDCA7在部分胰腺癌細(xì)胞中高表達(dá)，提示CDCA7可能參與了胰腺癌的惡性生物學(xué)過程。

有研究報道，CDCA7可通過上調(diào)組蛋白-賴氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2（histone-lysine N-methyltransferase）蛋白的表達(dá)水平，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲及遷移[10]。當(dāng)前，有關(guān)CDCA7對胰腺癌細(xì)胞腫瘤生物學(xué)行為的影響尚未有較多報道。因此，本項研究通過利用PANC-1細(xì)胞來構(gòu)建干擾CDCA7表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞株，進(jìn)一步采用CCK-8法、平板克隆實驗、細(xì)胞劃痕實驗和Transwell小室遷移和侵襲實驗檢測沉默CDCA7表達(dá)對PANC-1細(xì)胞增殖、遷移及侵襲等生物學(xué)行為的影響。本研究結(jié)果顯示，在沉默CDCA7表達(dá)后，PANC-1細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移能力明顯受到抑制。

已有研究結(jié)果顯示，MCM3是一種DNA復(fù)制許可因子，由MCM2～7復(fù)合物組；MCM2～7復(fù)合物是在真核細(xì)胞中DNA復(fù)制起始和延伸所必需的復(fù)制解旋酶[16]。在DNA復(fù)制許可的過程中，MCM通過結(jié)合細(xì)胞周期的M晚期到G1早期的DNA復(fù)制起點，誘發(fā)染色質(zhì)進(jìn)行DNA復(fù)制，通過S期促進(jìn)蛋白激酶激活，與原點結(jié)合的MCM復(fù)合物在原點解開雙鏈DNA，募集DNA聚合酶并啟動DNA合成[17]。由于MCM在增殖細(xì)胞的基因組復(fù)制中起著至關(guān)重要的作用，MCM功能失調(diào)可能導(dǎo)致染色體缺陷，從而誘發(fā)腫瘤。MCM蛋白在經(jīng)歷惡性轉(zhuǎn)化的人類癌細(xì)胞和癌前細(xì)胞中高表達(dá)[17]。MCM在DNA復(fù)制和細(xì)胞周期進(jìn)程中起著關(guān)鍵作用[18]。本研究進(jìn)一步通過免疫共沉淀和蛋白質(zhì)印跡法驗證發(fā)現(xiàn)，CDCA7和MCM3存在相互作用，沉默CDCA7基因表達(dá)后MCM3蛋白的表達(dá)水平也隨之下調(diào)存在，提示二者存在相關(guān)性

綜上所述，本研究在體外初步驗證了沉默CDCA7基因表達(dá)后胰腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移能力受到抑制，并且可能通過與MCM2～7復(fù)合物的結(jié)合來調(diào)控胰腺癌的惡性生物學(xué)過程，有望為尋求治療胰腺癌的新的分子靶點提供思路。然而，CDCA7的具體作用途徑及分子生物學(xué)機制尚未明確，還要進(jìn)一步的實驗探索來闡明。