Müller細胞與視網(wǎng)膜神經(jīng)再生研究進展

賈茜鈺，藍詩翰，單 亭，葉河江，陳 婕

0引言

視網(wǎng)膜退行性病變(retinal degenerative，RD)是我國及發(fā)達國家嚴重影響視力甚至導致失明的一類疾病，如青光眼、視網(wǎng)膜色素變性、視網(wǎng)膜脫離、年齡相關性黃斑變性等，其主要病理過程為視網(wǎng)膜神經(jīng)元凋亡。視網(wǎng)膜病變過程中會出現(xiàn)一系列神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞的重塑改變[1]，Müller細胞(Müller glial cells，MGCs)是貫穿視網(wǎng)膜全層的主要神經(jīng)膠質(zhì)細胞，Müller細胞的神經(jīng)源潛能可通過其靶向特異性激活相應信號通路，啟動膠質(zhì)反應去分化為神經(jīng)元，目前RD研究更注重減緩神經(jīng)元凋亡進程，而忽視了Müller細胞對神經(jīng)再生的調(diào)控作用，故本文以Müller細胞與神經(jīng)再生研究進行綜述。

1 Müller細胞簡介

Müller細胞是一種特殊的膠質(zhì)細胞，其功能多樣性和獨特的徑向形態(tài)使其成為視網(wǎng)膜神經(jīng)元再生治療的靶點。Müller細胞穿過所有的視網(wǎng)膜層長度(Lc)約為250μm，其胞體耦合神經(jīng)細胞突觸，監(jiān)測視網(wǎng)膜穩(wěn)態(tài)[2]。Müller細胞具有一系列重要功能：(1)負責視網(wǎng)膜光傳導：Müller細胞作為視網(wǎng)膜上活光纖來收集入射光，引導光線穿過視網(wǎng)膜組織走向最外層的光感受器；(2)參與視網(wǎng)膜發(fā)色團再循環(huán)：Müller細胞轉化11順式視黃醛后，發(fā)色團返至視錐細胞上，重新開始視覺周期[3]；(3)參與建立血-視網(wǎng)膜屏障(BRB)：Müller細胞可通過分泌相關因子增加內(nèi)皮屏障致密性從而增強視網(wǎng)膜內(nèi)外屏障功能，對視網(wǎng)膜免疫至關重要；(4)保護視網(wǎng)膜神經(jīng)元免受興奮性毒性影響：當氧化應激發(fā)生時，Müller細胞釋放谷胱甘肽，使谷氨酸轉化為無毒的谷氨酰胺，中和活性氧(ROS)以防神經(jīng)元受興奮性毒性影響[4-6]；(5)離子緩沖及水通道調(diào)節(jié)：Müller細胞表達多種電壓門控離子通道和多種神經(jīng)遞質(zhì)受體[7]。神經(jīng)元活動期間，神經(jīng)元釋放鉀離子(K+)，Müller細胞通過主動或被動轉運吸收K+，并且將多余的K+重新分配到神經(jīng)視網(wǎng)膜外—玻璃體液、視網(wǎng)膜下腔及血液中，緩沖K+不平衡[8]，鉀離子通道和Müller細胞水通道蛋白4共同調(diào)控來保持視網(wǎng)膜水穩(wěn)態(tài)；(6)Müller細胞向神經(jīng)元提供葡萄糖：Müller細胞為視網(wǎng)膜神經(jīng)元節(jié)省氧氣，通過厭氧降解自身葡萄糖，產(chǎn)生大量乳酸，而被光感受器優(yōu)先吸收[9]。此外，Müller細胞可以產(chǎn)生神經(jīng)營養(yǎng)因子和保護因子，如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、膠質(zhì)細胞神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)、色素上皮衍生因子(PEDF)、胰島素樣生長因子1(IGF-1)等，以上因子通過自分泌和旁分泌方式激活相應靶向信號通路，誘導Müller細胞重編程、增殖，與視網(wǎng)膜微循環(huán)、神經(jīng)再生關聯(lián)緊密[3]。

2 Müller細胞調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜神經(jīng)再生的因素

2.1視網(wǎng)膜神經(jīng)再生過程視網(wǎng)膜損傷和疾病導致神經(jīng)元變性凋亡時，受損區(qū)域丟失的神經(jīng)元不會自發(fā)替換，細胞凋亡最終導致視力喪失。斑馬魚的Müller細胞對視網(wǎng)膜損傷的反應是啟動膠質(zhì)反應去分化，其特征是細胞肥大和增加膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)表達，使駐留在內(nèi)核層的Müller細胞在損傷后增殖，進行運動間核遷移，不對稱分裂致多能祖細胞形成，隨后遷移到丟失的光感受器神經(jīng)元空白處，迅速增殖，表明Müller細胞是再生神經(jīng)元祖細胞的替代來源，具有視網(wǎng)膜內(nèi)源性干細胞的特性[10](圖1[3])。近年來研究證明，除魚類外，鳥類、脊椎動物及人類的Müller細胞也會采取干細胞樣狀態(tài)，產(chǎn)生視網(wǎng)膜神經(jīng)元[11-13]。研究表明，Müller細胞可定向分化為視桿細胞[14]，影響視網(wǎng)膜光感受器功能進而調(diào)控神經(jīng)元重塑[15]，并且Müller細胞中的免疫球蛋白樣受體B影響視網(wǎng)膜神經(jīng)再生[16]，表明Müller細胞作為視網(wǎng)膜神經(jīng)元替代治療的內(nèi)源性種子細胞，在視網(wǎng)膜神經(jīng)再生過程中起到重要作用[17-18]。

2.2 Müller細胞特異性靶向Müller細胞是與各級神經(jīng)元保持功能緊密聯(lián)系的重要膠質(zhì)細胞，為神經(jīng)元靶向提供營養(yǎng)支持。裴雪婷等[19]研究表明直接作用于Müller細胞的中腦星形膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(MANF)通過調(diào)控p44/42MAPK信號通路對神經(jīng)元具有保護作用。李宗義等[20]通過構建Müller細胞結合人源促紅細胞生成素穩(wěn)轉株可減慢神經(jīng)元損傷進程，說明Müller細胞可作為治療視網(wǎng)膜神經(jīng)變性的靶向細胞。研究發(fā)現(xiàn)在視黃醛結合蛋白1基因的部分調(diào)控區(qū)域進行條件性Müller細胞消融的轉基因模型小鼠中，調(diào)控Müller細胞的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)可減少光感受器細胞凋亡[21]。Müller細胞作為CNTF反應性細胞類型在視網(wǎng)膜退行性病變神經(jīng)元保護中占重要地位[22]。除此之外，在神經(jīng)再生基因治療及病毒轉染治療中Müller細胞特異性靶向可有效降低視網(wǎng)膜其他類型細胞對載體或藥物的無效攝取，間接對神經(jīng)元細胞起到支撐作用[23]。視網(wǎng)膜下通過轉導作用于Müller細胞慢病毒載體更易于轉染光感受器細胞和色素上皮細胞[24]，有效的Müller細胞轉基因表達可以通過神經(jīng)膠質(zhì)特異性啟動子來驅(qū)動，如GFAP、波形蛋白、分化簇44(CD44)，研究表明含有膠質(zhì)細胞特異性啟動子的慢病毒載體可在Müller細胞中有效轉導并指導持續(xù)的轉基因表達。外源性干細胞移植促進Müller細胞增殖重編程可用于視網(wǎng)膜神經(jīng)再生的實驗治療[25]。

圖1 Müller細胞與視網(wǎng)膜神經(jīng)再生示意圖。

2.3 Müller細胞神經(jīng)源潛能—視網(wǎng)膜神經(jīng)再生關鍵因素Müller細胞可作為神經(jīng)元再生潛能靶細胞主要是由于Müller細胞與祖細胞存在重疊的再生基因。Yu等[26]研究證明電刺激通過調(diào)控bFGF途徑觸發(fā)遺傳性視網(wǎng)膜色素變性小鼠模型Müller細胞重新進入細胞周期動員內(nèi)源性祖細胞逆轉光感受器細胞，產(chǎn)生新的光感受器細胞。Conedera等[27]實驗運用局灶性二極管激光器損傷斑馬魚視網(wǎng)膜，造模后Müller細胞表達GFAP，磷酸化p44/42MAPK(Erk1/2)和增殖細胞核抗原(PCNA)上調(diào)。王芳等[28]建立N-甲基-N-亞硝脲(MNU)感光細胞凋亡模型發(fā)現(xiàn)造模2d后Müller細胞開始分泌神經(jīng)干細胞相關因子，繼而增殖去分化展現(xiàn)干細胞特征。董曉飛等[29]將N-甲基-d-天門冬氨酸(NMDA)神經(jīng)毒素混合液注射于實驗大鼠玻璃體腔，分離Müller細胞進行體外培養(yǎng)后移植入自發(fā)性遺傳性視網(wǎng)膜變性大鼠視網(wǎng)膜下腔，結果顯示神經(jīng)干細胞占總細胞量比重過半，誘導產(chǎn)生神經(jīng)干細胞特性，Müller細胞可以有效延緩模型大鼠視網(wǎng)膜光感受器細胞變性。Ooto等[30]研究發(fā)現(xiàn)NMDA誘導視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(RGCs)損傷可引起Müller細胞增殖，并產(chǎn)生具有神經(jīng)元細胞分化標志物的新細胞。外源性晶狀體伴視神經(jīng)損傷，可誘導Müller細胞活化，對視神經(jīng)損傷后RGCs具有保護作用[31]。

3調(diào)控Müller細胞增殖分化相關通路及因子

Müller細胞是視網(wǎng)膜受損后神經(jīng)細胞再生的主要來源，其可通過信號級聯(lián)重新編程獲得視網(wǎng)膜干細胞特性，去分化增殖為視網(wǎng)膜前體細胞。參與Müller細胞增殖和分化的信號通路主要有Wnt/Gsk3β/β-catenin信號通路、MAPK-Erk信號通路、JAK/STAT3信號通路、Notch信號通路等。

3.1 Wnt/Gsk3β/β-catenin信號通路β-連環(huán)蛋白(β-catenin)是一種多功能蛋白，與T細胞因子、淋巴蛋白增強因子家族成員協(xié)作，將細胞表面Wnt和鈣黏蛋白與基因表達聯(lián)系起來，Wnt蛋白分泌脂質(zhì)修飾糖蛋白，結合Frizzed家族受體調(diào)節(jié)β-catenin穩(wěn)定，糖原合酶激酶3β(Gsk3β)則通過磷酸化調(diào)節(jié)β-catenin穩(wěn)定。研究表明，抑制Wnt表達可抑制損傷視網(wǎng)膜的祖細胞形成，此外Gsk3β抑制劑在斑馬魚視網(wǎng)膜再生研究中通過β-catenin信號通路激活Müller細胞重編程和祖細胞形成[32-33]。Yao等[34]實驗表明β-catenin的基因轉移可刺激Müller細胞增殖，繼β-catenin基因轉移后，細胞周期激活Müller細胞重新編程產(chǎn)生光感受器細胞。

3.2 MAPK-Erk信號通路在視網(wǎng)膜損傷研究中，Müller細胞衍生祖細胞的產(chǎn)生是由表皮生長因子(EGF)和MAPK-Erk信號通路所介導，作用可能是EGF和成纖維細胞生長因子(FGF)受體通過絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)和細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(Erk)調(diào)節(jié)衍生祖細胞功能[35]。

3.3 JAK/STAT3信號通路JAK非受體酪氨酸激酶，通過介導細胞因子磷酸化STAT3，誘導Müller細胞重編程和視網(wǎng)膜再生；JAK/STAT3信號通路在膠質(zhì)細胞的發(fā)育和神經(jīng)損傷后胚胎干細胞自我更新能力的維持過程中作用明顯。近年研究發(fā)現(xiàn)Müller細胞中STAT3的表達在視網(wǎng)膜損傷后增強，激活的Müller細胞以及增殖的前體細胞高表達，使用JAK/STAT3信號通路抑制劑可抑制hbegfa、Ascl1a、lin-28等再生相關基因表達，并減弱視網(wǎng)膜再生，由此可見JAK/STAT3信號通路在Müller細胞重編程和視網(wǎng)膜再生中起著關鍵作用[36-37]。

3.4 Notch信號通路Notch信號可調(diào)節(jié)神經(jīng)元生長，與神經(jīng)元受損后的修復及再生密切相關[38]。研究發(fā)現(xiàn)Notch信號通路在斑馬魚視網(wǎng)膜再生過程中起抑制作用，在視網(wǎng)膜受損魚類中Müller細胞數(shù)量減少；在雞視網(wǎng)膜病變中Notch信號起促增殖作用，表明Notch信號通路與反應的Müller細胞數(shù)量和視網(wǎng)膜損傷的程度相關，Notch通路既可以抑制又可以促進Müller細胞增殖，且對于抑制干細胞的分化發(fā)揮了重要作用[39]。

3.5其他相關因子斑馬魚視網(wǎng)膜再生相關轉錄組分析表明視網(wǎng)膜損傷后斑馬魚快速誘導轉錄因子和生長因子，如hbegfa和腫瘤壞死因子α(TNFα)[40]，它們由Müller細胞表達，以自分泌、旁分泌的方式刺激祖細胞形成和增殖，損傷誘導Ascl1a基因表達導致細胞分化，激活促增殖程序。Ascl1a刺激lin-28基因表達，通過調(diào)節(jié)Wnt信號影響Müller細胞重編程和增殖。Ascl1a亦可調(diào)節(jié)胰島素樣相關因子表達，影響Müller細胞重編程和祖細胞周期退出，在輕度損傷的斑馬魚視網(wǎng)膜中，STAT3基因的表達可能先于Ascl1a[41]，而損傷依賴性Ascl1a的表達僅限于重編程的Müller細胞衍生的祖細胞[42]。近期實驗研究表明，在NMDA小鼠模型中Ascl1強表達可誘導Müller細胞的神經(jīng)源性狀態(tài)，但在出生后第16d，Ascl1過表達，Müller細胞失去神經(jīng)源性能力，成熟Müller細胞神經(jīng)源性能力的喪失伴隨著染色質(zhì)可及性的降低，說明表觀遺傳因素限制了再生[43]。但運用組蛋白脫乙?；敢种苿┛烧T導成年小鼠視網(wǎng)膜損傷后Müller細胞產(chǎn)生神經(jīng)元。離體Müller細胞研究表明Müller細胞在48h內(nèi)上調(diào)細胞周期調(diào)節(jié)因子，表達神經(jīng)源性因子Ascl1、Pax6和Vsx2，且高達60%的細胞重新進入細胞周期，Müller細胞后代亞群開始表達轉錄因子和神經(jīng)元標志物，而不是神經(jīng)膠質(zhì)標志物，此過程表明神經(jīng)再生[44]。除此之外，表皮細胞生長因子(HB-EGF)、成纖維細胞生長因子2(FGF2)、谷氨酸鹽及其擬似物α-Aminadipate等因子與Müller細胞轉化為視網(wǎng)膜神經(jīng)元相關[39]。MicroRNA驅(qū)動基因調(diào)控機制可促進發(fā)育過程中從視網(wǎng)膜祖細胞獲取Müller細胞譜系過程，誘導其對視網(wǎng)膜變性的響應以及Müller細胞增殖分化[45]。另有研究表明，ARS2-FLASH介導的組蛋白mRNA可調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜祖細胞周期和神經(jīng)膠質(zhì)細胞命運，影響Müller細胞和感光細胞分化改變[46]。

4總結和展望

視網(wǎng)膜神經(jīng)再生是復雜的過程，基于Müller細胞特性研究神經(jīng)保護機制及對神經(jīng)元再生的調(diào)控作用，對實現(xiàn)神經(jīng)再生和視覺重建精準靶向治療具有重要指導意義。近年視網(wǎng)膜神經(jīng)再生研究具有顯著進步，已證明Müller細胞可作為視網(wǎng)膜神經(jīng)再生關鍵靶點，但仍有些問題亟待研究。人類視網(wǎng)膜神經(jīng)再生機制如何？免疫性方面Müller細胞的異質(zhì)性如何？如何有效激活Müller細胞神經(jīng)源啟動膠質(zhì)反應去分化為神經(jīng)元？有待進一步研究，理清這些問題，將為視網(wǎng)膜退行性病變的治療提供新思路。