妊娠期糖尿病對(duì)新生子代大鼠膈肌功能的影響

張瑞麗, 楊筱青, 張曉鴿, 郭華峰, 朱繼紅

（1. 河南省鄭州市婦幼保健院產(chǎn)科，河南 鄭州 450012；2. 鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院產(chǎn)科，河南 鄭州450000；3. 吉林大學(xué)第一醫(yī)院生殖中心，吉林 長(zhǎng)春 130021）

妊娠期糖尿?。╣estational diabetes mellitus，GDM）是指妊娠期首次出現(xiàn)糖耐量受損或糖尿病，是臨床上常見(jiàn)的產(chǎn)科疾?。?］。GDM 對(duì)母嬰均可造成危害，尤其是在妊娠中晚期，母體內(nèi)分泌系統(tǒng)的變化引起體內(nèi)各種激素的過(guò)多分泌。因此對(duì)于GDM 患者，若妊娠期高血糖長(zhǎng)期得不到有效控制，母體內(nèi)的高血糖可以通過(guò)胎盤(pán)進(jìn)入胎兒體內(nèi)，導(dǎo)致胎兒體內(nèi)也出現(xiàn)高血糖和高胰島素血癥［2］。胎兒體內(nèi)血糖和胰島素水平升高，導(dǎo)致胎兒對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)需求增加，進(jìn)而引起胎兒過(guò)度或者異常生長(zhǎng)，增加母體的剖腹產(chǎn)率和流產(chǎn)率［3］。已有證據(jù)［4-5］表明：高血糖和高胰島素血癥可引起胎兒心臟超微結(jié)構(gòu)和功能的改變，或誘導(dǎo)骨骼肌出現(xiàn)胰島素抵抗。膈肌是一種特殊的骨骼肌，是人體的主要呼吸肌，貢獻(xiàn)人體70%～85%的呼吸做功。與成年人不同，新生兒的呼吸模式以小潮氣量高呼吸頻率為特點(diǎn)［6］。正常的膈肌功能對(duì)新生兒的呼吸過(guò)程至關(guān)重要；反之，膈肌功能異常會(huì)導(dǎo)致呼吸功能不全，潛在性地影響新生兒的呼吸功能。而GDM 對(duì)新生子代大鼠膈肌功能的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)構(gòu)建大鼠GDM 模型，觀察新生子代大鼠膈肌收縮力、纖維橫截面積和超微結(jié)構(gòu)的變化，并檢測(cè)膈肌組織中氧化應(yīng)激標(biāo)志物水平，為研究GDM 對(duì)新生子代大鼠膈肌功能的影響提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器8 周齡SPF 級(jí)SD 大鼠，雌性50 只，雄性25 只，購(gòu)自鄭州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK （豫）2017-0001。飼養(yǎng)于溫度約25 ℃、濕度約50%、12 h 晝夜交替的動(dòng)物房里，自由進(jìn)食水。鏈脲佐菌素（STZ） 購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司，一抗（MY-32、NOQ7.5.4D 和 ab11575） 及 丙 二 醛（malondialdehyde，MDA）、羰基化蛋白、超氧化物歧化酶（superoxidase dismutase，SOD）和過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT） 檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自Abcam（上海）公司，二抗（Alexa Fluor 546 標(biāo)記的驢抗鼠和Alexa Fluor 488 標(biāo)記的驢抗山羊抗體）和DAPI 購(gòu)自賽默飛（上海）公司，K-H 液購(gòu)自麥凱吉（北京） 公司。血糖儀和試紙購(gòu)自羅氏診斷（上海）公司，體外肌肉收縮力檢測(cè)系統(tǒng)購(gòu)自?shī)W爾科特（上海）公司。

1.2 大鼠GDM 模型構(gòu)建大鼠GDM 模型構(gòu)建方法參照文獻(xiàn)［7］。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前3 d，每天記錄大鼠的體質(zhì)量并測(cè)量血糖。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前將體質(zhì)量差異較大和血糖水平異常（7 mmol·L－1以上）大鼠剔除。剩余大鼠按雌雄2∶1 比例進(jìn)行合籠交配，次日清晨觀察到陰栓即認(rèn)定交配成功，并標(biāo)記為妊娠第0 天。將妊娠成功的44 只母鼠隨機(jī)分為GDM 組和正常對(duì)照組，每組22 只。GDM 組孕鼠于妊娠成功后的12 h 后，單次腹腔注射1% STZ 溶液（35 mg·kg－1），正常對(duì)照組孕鼠單次腹腔注射相同劑量的0.1 mmol·L－1檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。大鼠妊娠第4 天，經(jīng)眼眶取血，測(cè)量空腹血糖水平在11.1 mmol·L－1以 上，隨機(jī)血糖 在17.9 mmol·L－1以上，尿糖＞，表明GDM 造模成功。共有18 只大鼠成功構(gòu)建GDM 模型。

1.3 子代大鼠膈肌收縮力測(cè)量體外膈肌收縮力的測(cè)量參考既往研究［8］。分娩后，從每只母鼠的子代中隨機(jī)挑選1 只新生子代大鼠（正常對(duì)照組22 只，GDM 組18 只），置于天平上稱(chēng)質(zhì)量后處死，取出完整膈肌組織并測(cè)量濕質(zhì)量。 剪取左側(cè)肋弓下膈肌組織，修剪成5 mm×3 mm 的肌條。固定夾固定肌條兩端，垂直放置于27 ℃、95%O2和5%CO2混合氣體持續(xù)氧合的K-H 液中平衡30 min。在刺激電壓為10 V、波長(zhǎng)2 ms 和刺激間隔2 min 條件下不斷調(diào)整肌條的長(zhǎng)度，從而獲取肌條的最佳初長(zhǎng)度。膈肌的最佳初長(zhǎng)度為膈肌在以上刺激條件下達(dá)到最大緊張收縮力時(shí)的長(zhǎng)度。最大緊張收縮力即為最佳初長(zhǎng)度下的膈肌收縮力，測(cè)量3 次取平均值。將刺激電壓設(shè)為15 V，其他條件不變，在最佳初長(zhǎng)度下獲取最大強(qiáng)直收縮力，取3 次測(cè)量平均值。在其他條件不變的情況下，改變刺激頻率，依次獲取膈肌在20、40、60、80、100 和120 Hz 時(shí)的收縮力。在刺激電壓10 V、刺激間隔2 min、波長(zhǎng)2 ms、刺激頻率60 Hz、串?dāng)?shù)120、串間隔670 ms、刺激時(shí)間330 ms 和串長(zhǎng)16.5 的條件下行疲勞檢測(cè)，獲取第1個(gè)和第120個(gè)波形的收縮力，2 個(gè)波形收縮力減少的百分比即為疲勞指數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，測(cè)定肌條在最佳初長(zhǎng)度下的物理長(zhǎng)度（cm）和肌條的濕質(zhì)量（g），按照肌肉密度為1.06 g·cm－3，每個(gè)肌條在最佳初長(zhǎng)度下的橫截面積（cm2）=濕質(zhì)量/密度/肌條長(zhǎng)度。

1.4 子代大鼠膈肌纖維橫截面積測(cè)量將取材的子代大鼠左側(cè)肋弓下膈肌組織用OCT 包埋，冰凍切片機(jī)切成8 μm 厚的切片，冰甲醇固定30 s，PBS洗 滌。 MY-32 一 抗、 NOQ7.5.4D 一 抗 和 抗Laminin 抗體按1∶300 比例雙色免疫熒光標(biāo)記，濕盒中4℃避光過(guò)夜。PBS 洗滌，二抗室溫下孵育1 h后，洗滌，加入DAPI，封片。熒光顯微鏡下拍照，隨機(jī)選取5 個(gè)不同視野，采用ImageJ 軟件計(jì)算Ⅰ型和Ⅱ型膈肌纖維的橫截面積，每只大鼠至少統(tǒng)計(jì)200 條Ⅰ型和Ⅱ型膈肌纖維。

1.5 子代大鼠膈肌組織形態(tài)表現(xiàn)和超微結(jié)構(gòu)觀察取子代大鼠左側(cè)肋弓下膈肌組織，部分膈肌沿肌纖維橫切面修剪后用4%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水、透明、浸蠟包埋后行HE 染色，在普通光學(xué)顯微鏡下觀察膈肌組織形態(tài)表現(xiàn)。部分膈肌用2.5%戊二醛固定處理后，行超薄切片，3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，透射電鏡下觀察膈肌超微結(jié)構(gòu)。

1.6 子代大鼠膈肌組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè)稱(chēng)取取材的子代大鼠左側(cè)肋弓下膈肌組織50 mg，加入800 μL RIPA 裂解液，冰上勻漿后，采用低溫離心機(jī)1 500 r·min－1離心5 min 后提取上清液。根據(jù)檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明，采用比色法檢測(cè)上清液中的MDA 和羰基化蛋白水平及SOD 和CAT 活性。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用Shapiro-Wilk 檢驗(yàn)驗(yàn)證各組數(shù)據(jù)的正態(tài)分布情況。子代大鼠體質(zhì)量，膈肌濕質(zhì)量，膈肌收縮力，膈肌疲勞指數(shù)，膈肌纖維橫截面積，膈肌組織中MDA 和羰基化蛋白水平及SOD 和CAT 活性均符合正態(tài)分布，以表示，2 組間樣本均數(shù)比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 2 組子代大鼠體質(zhì)量、膈肌濕質(zhì)量和收縮力GDM 組子代大鼠體質(zhì)量［（8.44±0.11） g］ 和膈肌濕質(zhì)量［（0.45±0.01） g］ 與正常對(duì)照組［（8.39±0.10）和（0.44±0.01）g］比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與正常對(duì)照組比較，GDM 組子代大鼠膈肌最大緊張收縮力、最大強(qiáng)直收縮力和不同刺激頻率下的膈肌收縮力均明顯降低（P＜0.05），膈肌疲勞指數(shù)明顯升高（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 2 組子代大鼠膈肌收縮力和膈肌疲勞指數(shù)Tab.1 Diaphragmatic contractile forces and fatigue indexes of offspring rats in two groups （x±s）

2.2 2組子代大鼠膈肌纖維橫截面積GDM 組子代大鼠Ⅰ型和Ⅱ型膈肌纖維橫截面積［（613±85） 和 （1 406±159） μm2］ 較 正 常 對(duì) 照 組［（859±107）和（1 748±183）μm2］明顯縮小，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 2 組子代大鼠膈肌纖維免疫熒光檢測(cè)結(jié)果（×400）Fig.1 Results of immunofluorescence detection of diaphragm fibers of offspring rats in two groups（×400）

2.3 2 組子代大鼠膈肌組織形態(tài)表現(xiàn)和超微結(jié)構(gòu)HE 染色結(jié)果顯示：2 組子代大鼠膈肌纖維結(jié)構(gòu)完整，排列整齊、致密，膈肌細(xì)胞無(wú)明顯腫脹，細(xì)胞核染色清晰。見(jiàn)圖2。

透射電鏡下觀察，正常對(duì)照組子代大鼠膈肌纖維排列整齊，明暗帶及“Z”線(xiàn)清晰；線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)完整，嵴成隔板狀，清晰可見(jiàn)，排列規(guī)則。GDM 組子代大鼠膈肌纖維排列紊亂，明暗帶及“Z”線(xiàn)模糊或斷裂；線(xiàn)粒體外膜模糊，形態(tài)不規(guī)則，嵴消失呈空泡化，出現(xiàn)凋亡表現(xiàn)。見(jiàn)圖3。

2.4 2 組子代大鼠膈肌組織中MDA 和羥基化蛋白水平及SOD 和CAT 活性與正常對(duì)照組比較，GDM 組子代大鼠膈肌組織中MDA 和羰基化蛋白水平均明顯升高（P＜0.05），SOD 和CAT 活性均明顯降低（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

圖2 2 組子代大鼠膈肌組織形態(tài)表現(xiàn)(HE,×400)Fig.2 Morphology of diaphragm tissue of offspring rats in two groups(HE, ×400)

圖3 2 組子代大鼠膈肌組織超微結(jié)構(gòu)Fig.3 Ultrastructures of diaphragm tissue of offspring rats in two groups

表2 2 組子代大鼠膈肌組織中MDA 和羥基化蛋白水平及SOD 和CAT 活性Tab.2 Levels of MDA and carbonylated protein and activities of SOD and CAT in diaphragm tissue of offspring rats in two groups (x±s）

3 討 論

本研究結(jié)果表明：GDM 母鼠高血糖狀態(tài)會(huì)影響新生子代大鼠的膈肌收縮功能，并引起明顯的形態(tài)學(xué)改變。GDM 是產(chǎn)科的常見(jiàn)疾病之一，在我國(guó)，GDM 的發(fā)病率為1%～5%。近年來(lái)，隨著生活水平的提高和生活習(xí)慣的改變，我國(guó)GDM 發(fā)病率一直呈上升趨勢(shì)［9］。對(duì)于孕婦，妊娠期間持續(xù)的高血糖狀態(tài)可能導(dǎo)致母體出現(xiàn)妊高癥、胎膜早破、羊水過(guò)多及早產(chǎn)等并發(fā)癥。此外，母體內(nèi)的高血糖可以通過(guò)胎盤(pán)進(jìn)入胎兒體內(nèi)，導(dǎo)致胎兒出現(xiàn)高血糖和繼發(fā)性的高胰島素血癥。胰島素作為胎兒的主要生長(zhǎng)激素，過(guò)多的胰島素會(huì)導(dǎo)致胎兒過(guò)度生長(zhǎng)［10］。已有證據(jù)［4］表明：高血糖和高胰島素血癥引起胎兒心臟超微結(jié)構(gòu)和功能的改變。膈肌是人體的主要呼吸肌，貢獻(xiàn)人體70%～85%的呼吸做功。新生兒的呼吸頻率為40～60 min－1，遠(yuǎn)高于成年人的呼吸頻率（16～24 min－1），因此新生兒在完成通氣性氣體交換的過(guò)程中對(duì)膈肌的依賴(lài)程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于成年人。一旦胎兒期間膈肌功能發(fā)育異常，會(huì)導(dǎo)致新生兒期出現(xiàn)呼吸功能不全，可能進(jìn)一步引起缺氧、呼吸衰竭甚至死亡［11］。本研究首次揭示了GDM 對(duì)新生子代大鼠的膈肌功能的影響，結(jié)果顯示：妊娠期高血糖狀態(tài)會(huì)導(dǎo)致新生子代大鼠的膈肌收縮力降低和膈肌抗疲勞能力下降。肌肉的收縮力與肌纖維的直徑有關(guān)［12］。本研究結(jié)果顯示：伴隨膈肌收縮力的降低，妊娠期高血糖狀態(tài)也會(huì)導(dǎo)致新生子代大鼠膈肌的Ⅰ型和Ⅱ型膈肌纖維橫截面積縮小，說(shuō)明高血糖狀態(tài)會(huì)影響胎兒期間膈肌纖維的發(fā)育，導(dǎo)致新生子代膈肌纖維的直徑相對(duì)較小，進(jìn)而影響膈肌的收縮力。肌肉的收縮力與肌小結(jié)的結(jié)構(gòu)有關(guān)［13］。本研究進(jìn)一步觀察子代大鼠膈肌組織形態(tài)表現(xiàn)和超微結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示：妊娠期高血糖不影響膈肌纖維的大體形態(tài)，但可造成膈肌纖維排列紊亂，明暗帶及“Z”線(xiàn)模糊或斷裂，線(xiàn)粒體嵴消失呈空泡化，出現(xiàn)凋亡改變，說(shuō)明高血糖可直接影響膈肌纖維肌小結(jié)的改變，從而造成膈肌收縮力降低。

目前，臨床研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果［14-15］均表明：氧化應(yīng)激水平升高是引起膈肌功能異常的關(guān)鍵因素。本研究通過(guò)檢測(cè)子代大鼠膈肌組織中MDA 和羰基化蛋白水平的變化來(lái)反映氧化應(yīng)激水平的高低，結(jié)果顯示：GDM 組子代大鼠膈肌組織中MDA 和羰基化蛋白水平明顯高于正常對(duì)照組，說(shuō)明妊娠期的高血糖狀態(tài)會(huì)導(dǎo)致新生子代大鼠膈肌組織高氧化應(yīng)激水平。而氧化應(yīng)激引起膈肌收縮力降低的機(jī)制，目前普遍認(rèn)為膈肌中的氧化應(yīng)激水平的升高通過(guò)激活膈肌中一系列蛋白水解酶體系，如蛋白酶（calpain）系統(tǒng)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（caspase-3）系統(tǒng)、溶酶體系統(tǒng)以及泛素-蛋白酶體系統(tǒng)，共同引起蛋白水解是其主要機(jī)制［16-18］。在蛋白水解加強(qiáng)的同時(shí)，膈肌的蛋白合成受到部分抑制，導(dǎo)致肌纖維出現(xiàn)萎縮，進(jìn)而導(dǎo)致膈肌收縮力降低。而正常體內(nèi)活性氧類(lèi)物質(zhì)的生成和清除處于動(dòng)態(tài)平衡。氧化應(yīng)激是指體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡的一種狀態(tài)，氧化權(quán)重加大，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞炎性浸潤(rùn)，蛋白酶分泌增加，產(chǎn)生大量氧化中間產(chǎn)物。在氧化權(quán)重加大的同時(shí)，抗氧化酶體系，如SOD 和CAT，可以分解活性氧類(lèi)物質(zhì)以減少氧化應(yīng)激損傷［19-20］。本研究結(jié)果表明：GDM 組子代大鼠膈肌組織中SOD 和CAT 活性明顯低于正常對(duì)照組，說(shuō)明妊娠期高血糖狀態(tài)會(huì)抑制抗氧化酶的活性或?qū)е驴寡趸阁w系的過(guò)度消耗。本研究結(jié)果反映了妊娠期母體高血糖狀態(tài)會(huì)導(dǎo)致胎兒或新生子代膈肌持續(xù)的氧化氧化應(yīng)激損傷，而氧化應(yīng)激損傷可能是導(dǎo)致新生子代膈肌功能異常的原因之一。

綜上所述，GDM 可引起新生子代大鼠膈肌收縮力降低、纖維橫截面積減小和膈肌超微結(jié)構(gòu)的改變，而氧化應(yīng)激水平升高可能是膈肌功能發(fā)生異常的原因之一。