痰熱清注射液對(duì)阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征大鼠外周血T 淋巴細(xì)胞亞群的影響

薛 靜, 劉志明, 吳永鋒，董凱峰，王慶豐，祖金美，張海靜，駱 彬,孔祥苓

（河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，河北 石家莊 050031）

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征（obstructive sleep apnea-hypopnea syndrome，OSAHS）是一種常伴有睡眠結(jié)構(gòu)紊亂、打鼾、頻繁發(fā)生血氧飽和度下降和白天嗜睡等癥狀的疾病，由睡眠上氣道塌陷阻塞引起呼吸暫停和通氣不足［1］。OSAHS 容易引起組織器官缺血和缺氧，甚至導(dǎo)致多器官和系統(tǒng)功能不全或障礙，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，至今尚未完全明確［2-3］。研究［4-5］表明：特征性的慢性間歇性低氧（chronic intermittent hypoxia，CIH）引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)和機(jī)體炎癥反應(yīng)是OSAHS 的重要致病機(jī)制之一。OSAHS 屬于中醫(yī)學(xué)“嗜臥”范疇，證見脾虛濕困，常以燥濕化痰、開竅醒神為治療原則［6］。痰熱清注射液由黃芩、熊膽粉、山羊角、金銀花和連翹組成，具有化痰、清熱和扶正功效，目前臨床常用于心肺疾病的治療［7-8］。 目前國(guó)內(nèi)外尚無痰熱清注射液對(duì)OSAHS 患者T 淋巴細(xì)胞亞群影響方面的研究。本研究采用間歇低氧方法建立OSAHS 大鼠模型，觀察痰熱清注射液對(duì)OSAHS 模型大鼠T 淋巴細(xì)胞亞群和細(xì)胞炎癥因子的影響，為闡明痰熱清注射液治療OSAHS 的作用機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器SPF 級(jí)雄性SD大鼠40 只，3 月齡，體質(zhì)量（230±30）g，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（冀）2013-0023。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，飼養(yǎng)條件：室溫26 ℃±2 ℃，相對(duì)濕度45%～55%，自由進(jìn)水和攝食。 小鼠抗大鼠CD3+FITC、CD4+R-PE 和CD8+R-PE（美國(guó)Caltag 公司）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白細(xì)胞介素6（interleukin- 6，IL-6）酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)試劑盒（美國(guó)TPI 公司）。痰熱清注射液由上海凱寶藥業(yè)股份有限公司提供，主要成分為黃芩、熊膽粉、山羊角、金銀花和連翹，規(guī) 格 10 mL/支 ，國(guó) 藥 準(zhǔn) 字 Z20030054。FACSCanto Ⅱ流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD 公司，MR-96A 全自動(dòng)酶標(biāo)儀購(gòu)自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司。

1.2 OSAHS 動(dòng)物模型的建立［9］造模大鼠置于間歇性低氧艙，循環(huán)給予氮?dú)夂脱鯕?，每循環(huán)120 s充入氮?dú)馐古搩?nèi)最低氧濃度為6%～8%，維持40 s（OSAHS 呼吸暫停所規(guī)定為10 s），緩慢充入氧氣至21%，維持80 s，每天8 h。實(shí)驗(yàn)過程中艙內(nèi)溫度為19 ℃～22 ℃，濕度為38%～52%，產(chǎn)生的CO2和H2O 分別用鈉石灰和無水氯化鈣吸收。對(duì)照組大鼠同時(shí)置于相同規(guī)格的有機(jī)玻璃倉(cāng)內(nèi)，無缺氧處理過程。采集大鼠動(dòng)脈血進(jìn)行血?dú)夥治?，作為模型建立成功的判斷?biāo)準(zhǔn)，模型大鼠最低血氧分壓為37.5 mmHg，血氧飽和度為59.3%，符合人類OSAHS 的診斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥50 只雄性SD 大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組，模型組，低、中和高劑量痰熱清注射液組，每組10 只。模型組，低、中和高劑量痰熱清注射液組大鼠進(jìn)行造模處理，造模第1 天開始，低、中和高劑量痰熱清注射液組大鼠分別靜脈注射給予0.9、1.8 和3.6 mL·kg－1痰熱清注射液，大鼠給藥劑量根據(jù)成人給藥劑量按體表面積換算，大鼠每日等效劑量（g·kg－1） =6.3×成人每日劑量（g·kg－1）。對(duì)照組和模型組大鼠給予等量生理鹽水灌胃。連續(xù)給藥14 d。

1.4 大鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的測(cè)定大鼠取血后頸椎脫臼處死，無菌條件下取胸腺和脾臟，洗滌后用濾紙吸干，稱質(zhì)量，計(jì)算臟器指數(shù)：臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）。

1.5 MTT 法檢測(cè)大鼠脾臟T 淋巴細(xì)胞增殖活性取大鼠脾臟，制備脾細(xì)胞懸液，用含10%胎牛血清的RPMI 1640 完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×108L－1的單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞接種于24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，加入經(jīng)RPMI 1640 完全培養(yǎng)液配制的ConA（終濃度為5 mg·L－1），每個(gè)樣品設(shè)3 復(fù)孔，5%CO2、37 ℃培養(yǎng)72 h，加入MTT，培養(yǎng)結(jié)束時(shí)棄上清加入二甲基亞砜（DMSO），振蕩10 min，490 nm 處測(cè)定吸光度（A）值，以A 值表示大鼠脾臟T 淋巴細(xì)胞增殖活性。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)大鼠外周血中不同T淋巴細(xì)胞亞群百分率各組大鼠于實(shí)驗(yàn)第15 天經(jīng)腹主動(dòng)脈收集肝素抗凝血液，4℃、3 000 r·min－1離心15 min 分離淋巴細(xì)胞，制備成密度為1×107mL－1的細(xì)胞懸液，分別取細(xì)胞懸液100 μL（含1×106個(gè)細(xì)胞），分別加入CD3、CD4 和CD8 抗體，4 ℃避光孵育15 min，加入PBS 緩沖液1 mL 洗滌5 min，置于2 500 r·min－1離心5 min，棄去上清液，于沉淀細(xì)胞內(nèi)加入100 μL PBS 緩沖液，混勻，1 h 內(nèi)采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同T 淋巴細(xì)胞亞群百分率。

1.7 ELISA 法 檢 測(cè) 大 鼠 血 清 中TNF-α 和IL-6 水平大鼠腹主動(dòng)脈采血后，分離血清，采用ELISA 法檢測(cè)大鼠血清中TNF-α 和IL-6 水平，操作方法按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組大鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)，脾臟T 淋巴細(xì)胞增殖活性，外周血中CD4+T 淋巴細(xì)胞百分率、 CD8+T 淋巴細(xì)胞百分率和 CD4+/CD8+T 淋 巴 細(xì) 胞 比 值，血 清 中TNF-α 和IL-6 水平，均符合正態(tài)分布，均以表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD 檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)與對(duì)照組比較，模型組大鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，低、中和高劑量痰熱清注射液組大鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)明顯升高（P＜0.05）；低、中和高劑量痰熱清注射液組大鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

2.2 各組大鼠脾臟T 淋巴細(xì)胞增殖活性與對(duì)照組比較，模型組大鼠脾臟T 淋巴細(xì)胞增殖活性明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，低、中和高劑量痰熱清注射液組大鼠脾臟T 淋巴細(xì)胞增殖活性明顯升高（P＜0.05）；與低劑量痰熱清注射液組比較，高劑量痰熱清注射液組大鼠脾臟T 淋巴細(xì)胞增殖活性明顯升高（P＜0.05）。見表2。

表1 各組大鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)Tab. 1 Spleen indexes and thymus indexes of rats in various groups (n=10,)

表1 各組大鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)Tab. 1 Spleen indexes and thymus indexes of rats in various groups (n=10,)

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with model group.

Group Control Model Tanreqing Injection Low dose Medium dose High dose Spleen index 2.81±0.57 1.48±0.35*Thymus index 1.06±0.15 0.32±0.08*0.44±0.09△0.51±0.08△0.53±0.11△1.77±0.45△1.82±0.37△2.06±0.52△

表2 各組大鼠脾臟T 淋巴細(xì)胞增殖活性Tab. 2 Proliferation activities of T lymphocytes of rats in various groups (n=10,)

表2 各組大鼠脾臟T 淋巴細(xì)胞增殖活性Tab. 2 Proliferation activities of T lymphocytes of rats in various groups (n=10,)

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with model group；#P＜0.05 compared with low dose of Tanreqing Injection group.

Group Control Model Tanreqing Injection Low dose Medium dose High dose A value 0.32±0.04 0.20±0.02*0.24±0.03△0.27±0.04△0.29±0.03△#

2.3 各組大鼠外周血中不同T 淋巴細(xì)胞亞群百分率與對(duì)照組比較，模型組大鼠外周血中CD4+T 淋巴細(xì)胞百分率和CD4+/CD8+T 淋巴細(xì)胞比值明顯降低（P＜0.05），CD8+T 淋巴細(xì)胞百分率明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，低、中和高劑量痰熱清注射液組大鼠外周血中CD4+T 淋巴細(xì)胞百分率和CD4+/CD8+T 淋巴細(xì)胞比值明顯升高（P＜0.05），CD8+T 淋巴細(xì)胞百分率明顯降低（P＜0.05）；低、中和高劑量痰熱清注射液組大鼠外周血中不同T 淋巴細(xì)胞亞群百分率和CD4+/CD8+T 淋巴細(xì)胞比值組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1 和表3。

2.4 各組大鼠血清中TNF-α 和IL-6 水平與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清中TNF-α 和IL-6 水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，低、中和高劑量痰熱清注射液組大鼠血清中TNF-α 和IL-6 水平明顯降低（P＜0.05）；與低劑量痰熱清注射液組比較，中和高劑量痰熱清注射液組大鼠血清中TNF-α 和IL-6 水平明顯降低（P＜0.05）。見表4。

圖1 各組大鼠不同T 淋巴細(xì)胞亞群流式散點(diǎn)圖Fig.1 Flow scatter diagram of T lymphocyte subsets of rats in various groups

表3 各組大鼠外周血中不同T 淋巴細(xì)胞亞群百分率和CD4+/CD8+T 淋巴細(xì)胞比值Tab. 3 Percentages of different T lymphocyte subsets in peripheral blood and CD4+/CD8+T lymphocyte ratios of rats in various groups （n=10，x±s）

表4 各組大鼠血清中TNF-α 和IL-6 水平Tab.4 Levels of TNF-α and IL-6 in serum of rats in various groups [n=10，，ρB/（ng·L-1）］

表4 各組大鼠血清中TNF-α 和IL-6 水平Tab.4 Levels of TNF-α and IL-6 in serum of rats in various groups [n=10，，ρB/（ng·L-1）］

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with model group；#P＜0.05 compared with low dose of Tanreqing Injection group.

Group Control Model Tanreqing Injection Low dose Medium dose High dose TNF-α 75.31±5.62 138.06±27.81*IL-6 44.59±6.85 144.05±32.46*87.32±11.83△70.34±9.20△#64.89±7.09△#107.72±15.80△93.41±11.36△#89.57±10.31△#

3 討 論

OSAHS 最主要的3 個(gè)病理特征為間歇性低氧血癥或高碳酸血癥、上氣道阻塞引起的胸腹式反常呼吸及缺氧時(shí)睡眠覺醒引起的睡眠結(jié)構(gòu)的紊亂［10］。目前OSAHS 動(dòng)物模型主要以上述特征為依據(jù)構(gòu)建。本研究主要通過給予大鼠間歇低氧模擬OSAHS 睡眠中發(fā)生慢性低氧病理生理過程。本研究結(jié)果顯示：模型組大鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)降低，CD4+/CD8+比值降低，血清中TNF-α 和IL-6水平升高，說明間歇低氧可影響大鼠外周血T 淋巴細(xì)胞亞群，導(dǎo)致免疫功能異常，促進(jìn)細(xì)胞炎性因子大量釋放，嚴(yán)重?fù)p傷內(nèi)皮細(xì)胞功能，與有關(guān)研究報(bào)道［11］結(jié)果一致。另有研究［12］表明：低氧低壓處理14 d 對(duì)大鼠免疫功能的影響最為明顯，同時(shí)14 d為痰熱清注射液1 個(gè)療程，因此本次實(shí)驗(yàn)采用連續(xù)14 d 給藥。

胸腺是機(jī)體的中樞免疫器官，是淋巴細(xì)胞增殖的重要場(chǎng)所，而脾臟是機(jī)體的外周免疫器官，是T 淋巴細(xì)胞發(fā)揮免疫作用的場(chǎng)所。本研究結(jié)果顯示：間歇性低氧處理導(dǎo)致大鼠胸腺和脾臟指數(shù)明顯降低，表明其對(duì)機(jī)體造成免疫損傷；低、中和高劑量痰熱清注射液組大鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)升高，表明痰熱清注射液對(duì)低氧所致的大鼠免疫功能異常有一定保護(hù)作用。T 淋巴細(xì)胞維持機(jī)體免疫功能，CD3 為T 淋巴細(xì)胞的標(biāo)志，分為CD4+T 淋巴細(xì)胞亞群和CD8+T 淋巴細(xì)胞亞群，二者間互相協(xié)調(diào)［13-14］，CD4+/CD8+T 淋 巴 細(xì) 胞 比 值 通 常 作 為 機(jī)體 免 疫 平 衡 的 評(píng) 價(jià) 指 標(biāo)［15］。研 究［16-17］表 明：OSAHS 患者體內(nèi)存在系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)，與健康人比較，OSAHS 患者血清中TNF-α 和IL-6 水平明顯升高。另有研究［18］顯示：TNF-α 和IL-6 是介導(dǎo)患者白天嗜睡的細(xì)胞炎性因子。TNF-α 和IL-6 由單核-巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生，在炎癥、宿主防御和組織損傷中有著廣泛的體液和細(xì)胞免疫作用，兩者均有促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化、引發(fā)胰島素抵抗的作用，進(jìn)而導(dǎo)致OSAHS患者機(jī)體各器官組織功能損害，發(fā)生OSAHS 相關(guān)性全身疾?。?9-20］。

痰熱清注射液是一種具有清熱祛痰、驅(qū)邪扶正作用的中藥制劑，目前臨床上主要用于呼吸道疾病的治療。研究［21］表明：痰熱清注射液具有改善缺氧及二氧化碳潴留、降低慢性阻塞性肺疾病患者外周血炎癥因子的作用。本研究結(jié)果顯示：低、中和高劑量痰熱清注射液組大鼠外周血中CD4+T 細(xì)胞百分率和CD4+/CD8+T 淋巴細(xì)胞比值升高，CD8+T 細(xì) 胞 百 分 率 降 低，血 清 中TNF-α 和IL-6 水平降低，表明痰熱清注射液能夠有效調(diào)節(jié)T 淋巴細(xì)胞亞群平衡，抑制細(xì)胞炎性因子分泌，與有關(guān)研究報(bào)道［22］一致。

綜上所述，痰熱清注射液治療OSAHS 具有一定療效，可通過調(diào)節(jié)T 淋巴細(xì)胞亞群平衡、抑制細(xì)胞炎性因子，進(jìn)而改善大鼠的免疫功能。