氯化兩面針堿通過JAK2/STAT3 信號通路對膠質(zhì)瘤細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的抑制作用

賈茗博, 孫 瑩, 王 瑩, 宋燕珂, 趙麗艷

（吉林大學(xué)第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，吉林 長春130041）

膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤。盡管近年來采取外科切除、術(shù)后放療和化療等綜合性治療手段，但由于膠質(zhì)瘤的高度侵襲性生長，患者術(shù)后腫瘤極易復(fù)發(fā)，預(yù)后較差，而上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT） 被認(rèn)為是膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲性生長的重要機(jī)制之一［1-2］。因此，探索靶向干預(yù)膠質(zhì)瘤細(xì)胞EMT 是當(dāng)前膠質(zhì)瘤治療的重要策略。 氯化兩面針堿（nitidine chloride，NC）是一種天然植物活性生物堿，主要來源于蕓香科植物兩面針的根，具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗瘧疾、抗真菌和抗血管生成等多種生物活性［3］。研究［4-5］顯示：NC 可以通過調(diào)控多種信號通路在人類惡性腫瘤中發(fā)揮作用，其中對兩面神激酶2/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子3 （Janus kinase signal transducers 2/signal transducer and activator of transcription 3，JAK2/STAT3） 信號通路的抑制作用比較突出。JAK2/STAT3 信號通路在惡性腫瘤的進(jìn)展中起重要作用。NC 在多種腫瘤中均有抑制腫瘤細(xì)胞增殖和細(xì)胞發(fā)生EMT 的作用，但其對膠質(zhì)瘤細(xì)胞EMT 的抑制作用及其機(jī)制目前尚未闡明。本研究探討NC 對人膠質(zhì)瘤細(xì)胞EMT 過程的抑制作用及其可能的信號機(jī)制，為膠質(zhì)瘤的臨床治療提供新的線索。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器人膠質(zhì)瘤U87 和LN18 細(xì)胞（美國ATCC 細(xì)胞庫）。NC （美國Apexbio 公 司），轉(zhuǎn) 化 生 長 因 子β1 （transforming growth factor-β1，TGF-β1）（美 國Peprotech 公司），DMEM 培養(yǎng)基（美國Gibco 公司），胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）（以色列Bioind 公司），二甲基亞砜（DMSO）、青霉素和鏈霉素（美國Sigma 公司），E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白、波形蛋白、β-連環(huán)蛋白和轉(zhuǎn)錄因子Snail、Slug、Twist1 以及STAT3、磷酸化STAT3（p-STAT3）、JAK2、磷酸化JAK2（p-JAK2）一抗（美國Cell Signaling Technology 公司），CCK-8 試劑盒（日本Dojindo 公司）。Transwell 小室（美國Corning 公司），細(xì)胞超凈工作臺和細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱（美國Thermo 公司），電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀（北京龍方科技公司），酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad 公司），倒置顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)人膠質(zhì)瘤U87 和LN18 細(xì)胞采用添加10% FBS、青霉素（100 U·mL－1）和鏈霉素（100 mg·L－1） 的DMEM 培 養(yǎng) 基，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2 d 更換1 次培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞達(dá)80%～90%融合時(shí)采用胰酶-EDTA 消化液消化，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 CCK-8 法檢測細(xì)胞存活率準(zhǔn)備好實(shí)驗(yàn)所需試劑，向96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板里加200 μL 培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞密度，保證每孔約8 000 個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁后，向膠質(zhì)瘤U87 和LN18 細(xì)胞加入NC，使每孔NC 濃度分別為2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0、17.5 和20.0 μmol·L－1，對照組加入等體積的培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱。次日取出96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入CCK-8 試劑20 μL，放入培養(yǎng)箱，繼續(xù)培養(yǎng)0.5 h。用酶標(biāo)儀在波長450 nm 處測定每個(gè)孔的吸光度（A）值，細(xì)胞存活率=處理組A 值/對照組A 值×100%。

1.4 細(xì)胞分組U87 細(xì)胞分為對照組（不做處理）、EMT 組（加入10 μg·L－1TGF-β1 誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤U87 和LN18 細(xì)胞EMT）和不同濃度NC 組（分別采用2.5、5.0、7.5 和10.0 μmol·L－1NC 處理）。在采用STAT3 抑制劑WP1066 阻斷JAK2/STAT3通路實(shí)驗(yàn)中，將U87 細(xì)胞分為對照組（不做處理）、EMT 組（加 入10 μ g·L－1TGF-β1 誘 導(dǎo) 膠 質(zhì) 瘤細(xì)胞EMT） 和EMT+WP1066 處理組（加入10 μ g·L－1TGF-β1 和8 μmol·L－1WP1066）。

1.5 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移率U87 細(xì)胞以每孔1.5×105個(gè)細(xì)胞的密度接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。用1 mL的槍尖劃出3 條橫線，再劃出3 條垂直線。用PBS緩沖液洗去細(xì)胞碎片后換成無血清培養(yǎng)基，細(xì)胞分組及處理見“1.4”，每孔中隨機(jī)選出3 個(gè)視野，拍攝0 h 劃痕照片。繼續(xù)培養(yǎng)，于48 h 拍照記錄，測量不同時(shí)間劃痕寬度，計(jì)算細(xì)胞遷移率表示細(xì)胞遷移能力。細(xì)胞遷移率=（0 h 劃痕寬度－48 h 劃痕寬度）/0 h 劃痕寬度×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.6 Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲率將實(shí)驗(yàn)所需槍尖和離心管放在冰盒中預(yù)冷處理，稀釋Matrigel 基質(zhì)膠至工作濃度，每個(gè)Transwell 小室加60 μL，室溫放置8 h，固化培養(yǎng)基。接種細(xì)胞前水化基底膜。U87 細(xì)胞以5×104個(gè)/孔的密度接種到小室內(nèi)，每孔加200 μL 無血清培養(yǎng)基，細(xì)胞分組及處理見“1.4”。聚甲醛固定，30 min 后用0.1%結(jié)晶紫染色15 min，PBS 緩沖液清洗染料，晾干。每個(gè)樣本隨機(jī)選取5 個(gè)視野，顯微鏡拍照記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。計(jì)數(shù)每個(gè)視野的穿膜細(xì)胞數(shù)，以細(xì)胞侵襲率表示細(xì)胞的侵襲能力。細(xì)胞侵襲率=實(shí)驗(yàn)組穿膜細(xì)胞數(shù)/對照組穿膜細(xì)胞數(shù)×100%。

1.7 Western blotting 法檢測各組細(xì)胞中EMT 相關(guān)蛋白和JAK2/STAT3 通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平U87 細(xì)胞分組及處理見“1.4”，收集細(xì)胞提取蛋白。每孔30 μg 蛋白樣品上樣，SDS-PAGE 凝膠電泳分離。將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF 膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，PBS 緩沖液漂洗，加入相應(yīng)一抗稀釋液4 ℃孵育過夜。隔天加入對應(yīng)的二抗，室溫孵育2 h，取出后再次漂洗，配制ECL 顯色液，避光待用。將PVDF 膜置于凝膠成像分析儀中采集圖像加以分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。利用Image J 軟件對蛋白條帶灰度值進(jìn)行分析，以目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值比值表示目的蛋白表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用GraphPad Prism 7.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組細(xì)胞遷移率、細(xì)胞侵襲率以及細(xì)胞中各種相關(guān)蛋白表達(dá)水平均以表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組膠質(zhì)瘤U87 和LN18 細(xì)胞存活率不同濃度NC 處理U87 和LN18 細(xì)胞后各組細(xì)胞存活率均明顯降低，且隨著濃度的增加，其細(xì)胞存活率逐漸降低，見圖1。NC 處理U87 和LN18 細(xì)胞24 和48 h 后細(xì)胞存活率均明顯降低，處理48 h 后細(xì)胞存活率變化更明顯，此時(shí)的半數(shù)抑制濃度（IC50）為5.0～7.5 μmol·L－1。NC 濃度小于2.5 μmol·L－1時(shí)對細(xì)胞存活率無明顯影響，24 和48 h 時(shí)細(xì)胞存活率均在80%以上。因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇2.5、5.0、7.5 和10.0 μmol·L－1NC 為作用濃度，作用時(shí)間為48 h。NC 對U87 和LN18 細(xì)胞的抑制程度基本相同，故選擇U87 作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞。

圖1 不同濃度NC 處理后各組膠質(zhì)瘤U87 和LN18 細(xì)胞存活率Fig.1 Survival rates of glioma U87 and LN18 cell in various groups after treated with different concentrations of NC

2.2 各組膠質(zhì)瘤U87 細(xì)胞遷移率與對照組比較，EMT 組U87 細(xì)胞劃痕距離明顯縮小，細(xì)胞遷移率明顯增加（P＜0.01）。與EMT 組比較，不同濃度NC組細(xì)胞遷移率明顯降低（P＜0.01）。見表1和圖2。

表1 各組膠質(zhì)瘤U87 細(xì)胞遷移率和侵襲率Tab.1 Migration rates and invasion rates of glioma U87 cells in various groups (n=3,,η/%)

表1 各組膠質(zhì)瘤U87 細(xì)胞遷移率和侵襲率Tab.1 Migration rates and invasion rates of glioma U87 cells in various groups (n=3,,η/%)

*P＜0.01 vs control group ；△P＜0.01 vs EMT group.

Group Control EMT NC（μmol·L－1）2.5 5.0 7.5 10.0 Migration rate 53.384±0.993 71.588±1.005*Invasion rate 100.000±0.000 150.594±7.209*86.002±7.534△72.584±8.697△30.461±2.387△9.419±1.381△19.951±2.086△18.122±1.505△12.722±1.528△13.265±0.617△

2.3 各組膠質(zhì)瘤U87 細(xì)胞侵襲率與對照組比較，EMT 組細(xì)胞侵襲率明顯升高（P＜0.01）；與EMT 組比較，不同濃度NC 組細(xì)胞侵襲率明顯降低（P＜0.01），且呈濃度依賴性。見表1 和圖3。

2.4 各組膠質(zhì)瘤U87 細(xì)胞中EMT 相關(guān)蛋白表達(dá)水平與對照組比較，EMT 組細(xì)胞中的上皮標(biāo)志物E-鈣黏蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01），而間質(zhì)標(biāo)志物N-鈣黏蛋白、波形蛋白和β-連環(huán)蛋白及誘導(dǎo)EMT 的轉(zhuǎn)錄因子Snail 和Twist1 蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05 或P＜0.01）；與EMT 組比較，7.5 和10.0 μmol·L－1NC 組細(xì)胞中E-鈣黏蛋白明顯升高（P＜0.05 或P＜0.01），N-鈣黏蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01），5.0、7.5 和10.0 μmol·L－1NC 組細(xì)胞中β-連環(huán)蛋白、波形蛋白及2.5、5.0、7.5 和10.0 μmol·L－1NC 組細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子Slug、Snail 和Twist1 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01），NC 對誘導(dǎo)EMT 后的膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞中EMT 相關(guān)蛋白的抑制作用程度呈濃度依賴性。見圖4 和表2。

2.5 各組膠質(zhì)瘤U87 細(xì)胞中JAK2/STAT3 信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平與對照組比較，EMT 組細(xì)胞中JAK2 和p-JAK2 蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），STAT3 和p-STAT3 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）；與EMT 組比較，5.0、7.5 和10 μmol·L－1NC 組細(xì)胞中JAK2、p-JAK2 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01），2.5、 5.0、7.5 和10 μ mol·L－1NC 組 細(xì) 胞 中STAT3 和p-STAT3 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01），且呈濃度依賴性。見圖5 和表3。

圖2 各組膠質(zhì)瘤U87 細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果(×200)Fig.2 Results of scratch assay of glioma U87 cells in various groups (×200)

圖3 各組膠質(zhì)瘤U87 細(xì)胞Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果(×200)Fig.3 Results of Transwell invasion test of glioma U87 cells in various groups(×200)

2.6 STAT3 抑制劑WP1066 阻斷JAK2/STAT3通路實(shí)驗(yàn)中各組膠質(zhì)瘤U87 細(xì)胞中EMT 相關(guān)蛋白表達(dá)水平與對照組比較，EMT 組細(xì)胞中E-鈣黏蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01），N-鈣黏蛋白、波形蛋白、β-連環(huán)蛋白及轉(zhuǎn)錄因子Twist1、Slug 和Snail 蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01）；與EMT組比較，EMT+WP1066 組細(xì)胞中E-鈣黏蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01），N-鈣黏蛋白、波形蛋白、β-連環(huán)蛋白及轉(zhuǎn)錄因子Slug、Snail 和Twist1 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01），提示阻斷JAK2/STAT3 信號通路可以抑制膠質(zhì)瘤EMT。見圖6 和表4。

圖4 各組膠質(zhì)瘤U87 細(xì)胞中EMT 相關(guān)蛋白表達(dá)電泳圖Fig.4 Electrophoregram of expressions of EMTrelated proteins in glioma U87 cells in various groups

圖5 各組膠質(zhì)瘤U87 細(xì)胞中JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3 蛋白表達(dá)電泳圖Fig.5 Electrophoregram of expressions of JAK2,p-JAK2, STAT3 and p-STAT3 proteins in glioma U87 cells in various groups

表2 各組膠質(zhì)瘤U87 細(xì)胞中EMT 相關(guān)蛋白表達(dá)水平Tab.2 Expression levels of EMT-related proteins in glioma U87 cells in various groups （n=3，）

表2 各組膠質(zhì)瘤U87 細(xì)胞中EMT 相關(guān)蛋白表達(dá)水平Tab.2 Expression levels of EMT-related proteins in glioma U87 cells in various groups （n=3，）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs EMT group.

Group Control EMT NC（μmol·L－1）2.5 5.0 7.5 10.0 E-cadherin 1.00±0.00 0.78±0.04**N-cadherin 1.00±0.00 1.37±0.17*β-catenin 1.00±0.00 1.11±0.01**Vimentin 1.00±0.00 1.37±0.09**Slug 1.00±0.00 1.01±0.08 Snail 1.00±0.00 1.97±0.20**Twist1 1.00±0.00 2.04±0.19**1.38±0.14△△0.70±0.06△△0.59±0.03△△0.59±0.03△△0.68±0.07 0.83±0.03 0.93±0.06△1.21±0.10△△1.38±0.11 1.12±0.16 0.52±0.14△△0.34±0.09△△1.13±0.11 0.84±0.08△△0.43±0.04△△0.24±0.06△△1.17±0.11 0.93±0.07△△0.68±0.07△△0.67±0.08△△0.63±0.04△△0.49±0.08△△0.17±0.03△△0.14±0.04△△0.62±0.07△△0.62±0.04△△0.57±0.08△△0.52±0.06△△

表3 各組膠質(zhì)瘤U87 細(xì)胞中JAK2、p-JAK2、STAT3 和p-STAT3 蛋白表達(dá)水平Tab.3 Expression levels of JAK2, p-JAK2, STAT3 and p-STAT3 proteins in glioma U87 cells in various groups

圖6 WP1066 處理后各組膠質(zhì)瘤U87 細(xì)胞中EMT 相關(guān)蛋白表達(dá)電泳圖Fig.6 Electrophorgram of expressions of EMT-related proteins in glioma U87 cells after treated with WP1066

3 討 論

已有研究［6-9］證明：NC 對肝癌、前列腺癌、卵巢癌和食管癌等多種腫瘤均有抑制作用。本研究首先檢測了NC 對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖活性的影響，結(jié)果顯示：NC 在體外可明顯降低膠質(zhì)瘤U87 和LN18 細(xì)胞存活率，且呈濃度依賴性。

膠質(zhì)瘤的重要特征是高度侵襲性生長，從而使腫瘤不斷生長并侵犯周圍的正常腦組織，造成膠質(zhì)瘤手術(shù)治療難以徹底切除和易復(fù)發(fā)性［10］。最近的研究［11-12］表明：膠質(zhì)瘤的高度侵襲性生長可能與細(xì)胞的EMT 過程有關(guān)，遏制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的EMT有望成為治愈腫瘤的有效手段。EMT 是一個(gè)復(fù)雜的生物過程，通過此過程，上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞黏附，獲得間質(zhì)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性和侵襲性，與腫瘤的進(jìn)展、侵襲及轉(zhuǎn)移有關(guān)［13］。同時(shí)，EMT 與腫瘤的復(fù)發(fā)和化療耐藥性有密切關(guān)聯(lián)［14-15］。EMT 的最主要特征是上皮標(biāo)志物E-鈣黏蛋白表達(dá)下調(diào)，間質(zhì)標(biāo)志物N-鈣黏蛋白、波形蛋白和β-連環(huán)蛋白以及 轉(zhuǎn) 錄 因 子Snail、Slug 和Twist1 表 達(dá) 上 調(diào)［13］。EMT 的調(diào)控涉及很多因素，包括轉(zhuǎn)化生長因子、表皮生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子、Wnt 信號通路和Notch 信號通路等［13］。研究［16-17］表明：NC 可以通過調(diào)控不同的信號通路抑制多種腫瘤的EMT過程。但NC 對膠質(zhì)瘤細(xì)胞EMT 的抑制作用及其機(jī)制目前尚未闡明。本研究結(jié)果表明：在膠質(zhì)瘤細(xì)胞EMT 時(shí)，NC 以濃度依賴的方式增加上皮標(biāo)志物E-鈣黏蛋白的表達(dá)，并降低間質(zhì)標(biāo)志物N-鈣黏蛋白、波形蛋白和β-連環(huán)蛋白以及轉(zhuǎn)錄因子Slug、Snail 和Twist1 的表達(dá)；通過劃痕愈合實(shí)驗(yàn)和Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)，證明NC 能有效抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和侵襲，揭示了NC 的抗轉(zhuǎn)移活性。說明NC 能夠抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的EMT 及其引起的細(xì)胞遷移和侵襲能力增強(qiáng)，從而延緩膠質(zhì)瘤的進(jìn)展。

JAK2/STAT3 信號通路參與細(xì)胞內(nèi)許多重要的生物學(xué)過程，包括細(xì)胞增殖、遷移和侵襲以及免疫調(diào)節(jié)［5，18］。JAK2 激活會導(dǎo)致STAT3 的磷酸化，STAT3 與EMT 相關(guān)標(biāo)志物的關(guān)系密切。在乳腺癌中，STAT3/Twist 通路參與CD146 介導(dǎo)的E-鈣黏蛋白表達(dá)的抑制［19］。在大腸癌中，STAT3 的過表達(dá)可明顯降低E-鈣黏蛋白的表達(dá)并增加N-鈣黏蛋白和波形蛋白的表達(dá)，STAT3 可能直接介導(dǎo)EMT 進(jìn)程［20］。研究［21］表明：JAK2/STAT3 信號通路在腫瘤EMT 過程中發(fā)揮重要作用，上調(diào)JAK2/STAT3 通路活性可調(diào)控細(xì)胞的EMT 過程，在宮頸癌的轉(zhuǎn)移和侵襲中起關(guān)鍵作用。在口腔鱗狀細(xì)胞癌中，CC 趨化因子配體21（CCL21）/CC 趨化因子受體7 （CCR7） 軸可通過激活JAK2/STAT3 信 號 通 路 調(diào) 節(jié)EMT 進(jìn) 程［22］。癌 相 關(guān) 成 纖維細(xì)胞可以通過JAK2/STAT3 信號通路分泌IL-6并促進(jìn)TGF-β 介導(dǎo)的EMT，從而促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖和侵襲［23］。NC 可 影 響JAK2/STAT3 信 號通路，在胃癌中，NC 可以通過抑制STAT3 DNA結(jié)合活性和JAK2/STAT3 信號通路進(jìn)而抑制腫瘤的血管生成和腫瘤生長［24］。

表4 WP1066 處理后各組膠質(zhì)瘤U87 細(xì)胞中EMT 相關(guān)蛋白表達(dá)水平Tab.4 Expression levels of EMT-related proteins in glioma U87 cells in various groups after treated with WP1066（n=3，）

表4 WP1066 處理后各組膠質(zhì)瘤U87 細(xì)胞中EMT 相關(guān)蛋白表達(dá)水平Tab.4 Expression levels of EMT-related proteins in glioma U87 cells in various groups after treated with WP1066（n=3，）

*P＜0.01 vs control group；△P＜0.01 vs EMT group.

Group Control EMT EMT+WP1066 Twist1 1.00±0.00 2.01±0.07*0.87±0.06△E-cadherin 1.00±0.00 0.47±0.05*0.79±0.03△N-cadherin 1.00±0.00 1.57±0.06*1.07±0.16△β-catenin 1.00±0.00 1.29±0.04*0.90±0.05△Vimentin 1.00±0.00 1.25±0.07*0.72±0.04△Slug 1.00±0.00 1.43±0.08*0.57±0.05△Snail 1.00±0.00 2.29±0.10*1.53±0.05Δ

為了進(jìn)一步闡明NC 抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞EMT 的機(jī)制，本研究通過Western blotting 法檢測了膠質(zhì)瘤細(xì)胞中JAK2/STAT3 通路蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示：采用NC 處理后，JAK2、p-JAK2、STAT3 和p-STAT3 蛋白表達(dá)水平降低，且呈濃度依賴性。為了確認(rèn)JAK2/STAT3 信號通路參與NC 抑制的膠質(zhì)瘤細(xì)胞EMT，應(yīng)用STAT3 抑制劑WP1066 抑制STAT3 活性來阻斷JAK2/STAT3 信號通路，結(jié)果表明：阻斷JAK2/STAT3 信號通路可明顯逆轉(zhuǎn)EMT 誘導(dǎo)的重要標(biāo)志物E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白、波形蛋白和β-連環(huán)蛋白以及轉(zhuǎn)錄因子Slug、Snail 和Twist1 的表達(dá)。本研究結(jié)果進(jìn)一步證明：JAK2/STAT3 信號通路對于EMT 是必不可少的，而NC 抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞EMT 的作用可能是通過影響JAK2/STAT3 信號通路實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，NC 通過JAK2/STAT3 信號通路抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的EMT 過程，并減弱細(xì)胞的遷移和侵襲能力。但將NC 應(yīng)用于膠質(zhì)瘤的臨床治療還需進(jìn)行更多和更深入的研究。