人早幼粒細(xì)胞cDNA 文庫中與GINS2 發(fā)生相互作用靶蛋白的篩選和鑒定

張 曦, 潘玉卿, 余 鑫, 鄭亞婷, 郭成斌, 徐 娜, 王良曉, 何 亮, 楊 麗

（1. 云南省腫瘤醫(yī)院 昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，云南 昆明 650118；2. 昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科 云南省實(shí)驗(yàn)診斷研究所 云南省檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650032）

白血病是骨髓造血干細(xì)胞惡性克隆所形成的血液系統(tǒng)腫瘤。在全球范圍內(nèi)，每年白血病的發(fā)病率和病死率約占所有病例的2.4%和3.2%［1］。在中國，白血病新發(fā)病例約為每年75.3/10 萬［2］。伴15 號(hào)染色體早幼粒細(xì)胞基因（ promyelocytic leukemia，PML） 和17 號(hào)染色體維甲酸受體基因（retinoic acid receptor alpha，RARα） 易位的急性早 幼 粒 細(xì) 胞 白 血 病 （acute promyelocytic leukemia，APL） 是急性髓細(xì)胞性白血?。╝cute myelocytic leukemia，AML）的一個(gè)特殊亞型，臨床上常見發(fā)熱、感染、貧血和細(xì)胞浸潤等急性白血病癥狀。在APL 形成過程中，融合蛋白PMLRARα 并非一成不變地始終作為一個(gè)整體來發(fā)揮致癌作用，其致白血病的分子機(jī)制仍不清楚。前期研究［3］表 明：GINS2 基 因 能 與 缺 失 核 定 位 信 號(hào)（nuclear localization signal，NLS） 的 變 異 蛋 白PML （NLS-） 在全細(xì)胞內(nèi)共定位表達(dá)，提示GINS2 在單個(gè)細(xì)胞水平干擾了野生型PML 的正常功能并參與了APL 的發(fā)生發(fā)展。GINS2 基因作為GINS（go-ichi-ni-san2）家族成員之一，與真核細(xì)胞的DNA 復(fù)制及損傷有密切關(guān)聯(lián)，參與細(xì)胞周期的調(diào)控，并對(duì)細(xì)胞的增殖和凋亡起到關(guān)鍵作用［4］。目前國內(nèi)外尚無關(guān)于GINS2 編碼蛋白與人早幼粒細(xì)胞cDNA 文庫互作蛋白篩選和鑒定的報(bào)道，為此本文作者使用前期構(gòu)建成功的人早幼粒細(xì)胞cDNA文庫［5］和誘餌質(zhì)粒pGBKT7-GINS2［6］，篩選出文庫內(nèi)與GINS2 發(fā)生相互作用的靶蛋白，為進(jìn)一步闡釋APL 發(fā)生的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器酵母雙雜交系統(tǒng)購自美國Clontech 公司，誘餌質(zhì)粒pGBKT7-GINS2 和人早幼粒細(xì)胞cDNA 文庫由本實(shí)驗(yàn)室前期成功構(gòu)建，大腸桿菌Top10 由本室凍存。酵母菌小量提取試劑盒購自美國Solarbio 公司；質(zhì)粒小抽試劑盒購自日本TaKaRa 公司；酵母營養(yǎng)缺陷型篩選培養(yǎng)基（包括SD/-Trp、SD/-TrP/-Leu、SD/-Trp/-Leu/-His和SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade 培養(yǎng)基），酵母完全培養(yǎng)基（YPDA），大腸桿菌LB 培養(yǎng)基，氨芐青霉素（100 mg·L－1）和卡那霉素（50 mg·L－1）均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。PCR 熱循環(huán)儀（美國Biorad 公司），臺(tái)式超高速低溫離心機(jī)和移液器（德國Eppendorf 公司），電轉(zhuǎn)化儀（美國Bio-Rad 公司）。

1.2 文庫質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化及篩選從SD/-Trp 平板挑取單克隆菌落接種于50 mL 液體SD/-Trp 培養(yǎng)基中，30 ℃、225 r·min－1振蕩培養(yǎng)18 h 后，將菌液轉(zhuǎn)接至500 mL YDPA 培養(yǎng)基中，使初始600 nm 波長處吸光 度［A（600）］值 為 0.2。 繼 續(xù)30 ℃、225 r·min－1振蕩培養(yǎng)5 h 使A（600）為0.6。待菌液 恢 復(fù) 至 室 溫 后，4 000 r·min－1離 心5 min 回 收 菌體。然后迅速用30 mL 無菌水重懸菌體并混勻，4 000 r·min－1離心5 min后棄上清。再用0.1 mol·L－1醋酸鋰20 mL 重懸菌體，4 000 r·min－1離心5 min 后棄上清。 向離心管中依次加入50% 聚乙二醇PEG3350、1 mol·L－1醋 酸 鋰、30 μg pGBKT7-GINS2 和25 μg 文庫質(zhì)粒。劇烈振蕩1 min 至完全混勻后，42 ℃水浴熱激25 min，然后轉(zhuǎn)入30 ℃水浴復(fù)蘇1 h。最終4 000 r·min－1離心5 min 回收菌體后，用8 mL 無菌水重懸菌體，吸取20 μ L 培 養(yǎng)物 經(jīng) 梯 度 稀 釋（10、 100 和1 000 倍） 后 涂布SD/-Trp/-Leu 平板3 塊，用于檢測(cè)文庫轉(zhuǎn)化效率。其余涂SD/-Trp/-Leu/-His/+5 mmol·L－13-氨基-1，2，4-三氮唑（3-aminotriazole，3-AT） 平板50 塊。30 ℃培養(yǎng)4 d，觀察文庫質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化結(jié)果并記錄轉(zhuǎn)化效率。

1.3 陽性克隆報(bào)告基因的檢測(cè)行報(bào)告基因腺苷酸琥珀酸合成酶2（ADE2）和組氨醇氨基鹽轉(zhuǎn)移酶3（HIS3）檢測(cè)時(shí)，從篩庫平板中共挑取到15 個(gè)初始陽性克隆并接種至SD/-Trp/-Leu 平板中繼續(xù)培養(yǎng)3 d。將上述初始陽性克隆分別用無菌水稀釋后點(diǎn)種 至SD/-Trp/-Leu 和SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade 平板，30 ℃培養(yǎng)4 d 后記錄平板的顯色結(jié)果。行報(bào)告基因β-半乳糖苷酶（LacZ）檢測(cè)時(shí)，另取一份無菌水重懸后的陽性克隆點(diǎn)于濾紙片上，然后將其徹底浸入液氮中，90 s 后取出室溫放置備用。將5 mL Z-buffer、70 μL X-gal 和24 μL β-巰基乙醇加入培養(yǎng)皿并混勻作為顯色液，將上述濾紙放入其中反應(yīng)5 h 后記錄培養(yǎng)皿的顯色結(jié)果。

1.4陽性克隆的測(cè)序比對(duì)挑選通過報(bào)告基因檢測(cè)的10 個(gè)陽性克隆，將其分別轉(zhuǎn)入SD/-Trp/-Leu 液體培養(yǎng)基，振蕩過夜培養(yǎng)后采用酵母抽提試劑盒提取酵母質(zhì)粒。將其轉(zhuǎn)化入大腸桿菌Top10 新鮮感受態(tài)進(jìn)行擴(kuò)增。最后將含有陽性克隆的Top10 轉(zhuǎn)化子放入含氨芐青霉素的LB 液體培養(yǎng)基擴(kuò)增后提取質(zhì)粒，并對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序和基本局部比對(duì)搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）比對(duì)。

1.5 陽性克隆的回轉(zhuǎn)驗(yàn)證將含有誘餌質(zhì)粒pGBKT7-GINS2 的AH109 酵母菌作為受體菌制備感受態(tài)，分別將測(cè)序成功的8 個(gè)陽性克隆轉(zhuǎn)化其中并涂布SD/-Trp/-Leu 平板。挑取平板上長出的轉(zhuǎn)化子分別用無菌水稀釋后點(diǎn)種至SD/-Trp/-Leu 和SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade 平板，30 ℃培養(yǎng)5 d 后對(duì)陽性克隆回轉(zhuǎn)驗(yàn)證的ADE2 和HIS3 報(bào)告基因進(jìn)行檢測(cè)并記錄平板顏色。另取一份用無菌水重懸后待驗(yàn)證的8 個(gè)陽性克隆點(diǎn)于濾紙片上進(jìn)行LacZ 報(bào)告基因的檢測(cè)并記錄平板顏色。

2 結(jié) 果

2.1 篩選文庫的轉(zhuǎn)化效率進(jìn)行10、100和1 000倍梯度稀釋的SD/-Trp/-Leu 平板上分別生長1 672、208 和19 個(gè)菌落，總的文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)化個(gè)數(shù)為 （1 672/20+208/2+19/0.2） ×1/3×8 000=7.53×105個(gè)，轉(zhuǎn) 化 效 率 為7.53×105/25 μg =3.01×104μg－1，完全滿足篩選要求（圖1）。

圖1 cDNA 文庫的轉(zhuǎn)化效率檢測(cè)Fig.1 Detection of transformation efficiency of cDNA library

2.2 陽性克隆ADE2、HIS3 和LacZ 報(bào)告基因的檢測(cè)ADE2 和HIS3 報(bào)告基因的檢測(cè)結(jié)果中，陽性對(duì)照在SD/-Trp/-Leu 和SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade平板上均能正常生長，而陰性對(duì)照由于不能激活A(yù)DE2 和HIS3 報(bào)告基因，故在SD/-Trp/-Leu 平板上可以正常生長，但在缺乏組氨酸和腺嘌呤的SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade 平板上不能生長。在挑取到的15 個(gè)初始陽性克隆中，1、2、5、6、7、8、9、11、14 和15 等10 個(gè) 克 隆 能 在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade 平板上生長，表明激活了HIS3 和ADE2報(bào)告基因，而3、4、10、12 和13 等5 個(gè)克隆則不能激活A(yù)DE2 和HIS3 報(bào)告基因（圖2A 和B）。此外，檢測(cè)報(bào)告基因LacZ 時(shí)，1、2、3、5、6、7、8、9、11、12、13、14 和15 等13 個(gè)克隆的由黃色變?yōu)榫G色，表明其能激活LacZ 報(bào)告基因（圖2C）。

圖2 陽性克隆的ADE2、HIS3 和LacZ 報(bào)告基因檢測(cè)Fig.2 Detection of reporter genes of ADE2, HIS3 and LacZ of positive clones

2.3 陽性克隆的測(cè)序和比對(duì)將通過3 個(gè)報(bào)告基因檢測(cè)的10 個(gè)陽性克隆質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，除8 和9 號(hào)克隆測(cè)序失敗，將其余8 個(gè)陽性克隆的測(cè)序結(jié)果通過美國國家生物信息中心的BALST 網(wǎng)站（https：//blast. ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi） 進(jìn) 行 比 對(duì)，得到8 個(gè)陽性克隆分別屬于8 種不同的蛋白編碼基因，分別是：RNA 結(jié)合基序蛋白39 （RNA binding motif protein 39，RBM39），作為類固醇激素受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄和選擇性剪接；泛素樣修飾因子激活 酶1（ubiquitin-like modifier activating enzyme 1，UBA1），催化泛素偶聯(lián)的第一步且標(biāo)記細(xì)胞蛋白降解；金屬硫蛋白2 （metallothionein-2，MT2A），主要控制細(xì)胞內(nèi)鋅水平，影響凋亡和自噬途徑；線粒體鈣離子攝入蛋白1 （mitochondrial calcium uptake 1，MICU1），防止線粒體Ca2+超載而導(dǎo)致的細(xì)胞損傷及應(yīng)激；N-乙基馬來酰亞胺敏感性融合蛋白輔因子（NSFL1 cofactor p47 isoform x3，NSFL1C），介導(dǎo)高爾基體片段再生所必需的蛋白；脂肪酰基輔酶A 還原酶1（fattyacyl-CoAreductase1，F(xiàn)AR1），主要作為脂肪酸轉(zhuǎn)化為脂肪醇所必需的蛋 白； 雙 特 異 性 磷 酸 酶 1 （dual specificity phosphatase 1，DUSP1），在絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK2） 信號(hào)途徑中發(fā)揮重要的生理功能；白細(xì)胞分化抗原14 （cluster of differentiation antigen 14，CD14），主要表達(dá)于單核/巨噬細(xì)胞表面且介導(dǎo)免疫反應(yīng)。

2.4 陽性克隆的回轉(zhuǎn)驗(yàn)證陽性克隆回轉(zhuǎn)驗(yàn)證ADE2和HIS3報(bào)告基因時(shí)，菌液涂布SD/-Trp/-Leu和SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade 平板后，生長狀況良好且符合實(shí)驗(yàn)要求。8 個(gè)陽性克隆中除6 號(hào)外，其余均能激活A(yù)DE2 和HIS3 報(bào)告基因（圖3A 和B）。而回轉(zhuǎn)驗(yàn)證LacZ 報(bào)告基因時(shí)，8 種陽性克隆中除6 號(hào)外，其余均能激活LacZ 報(bào)告基因（圖3C）。

3 討 論

探尋白血病發(fā)病過程中的相關(guān)致病基因，對(duì)于減少放化療導(dǎo)致的基因突變具有重要意義，并可為白血病的臨床診治提供實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)。在APL 發(fā)生發(fā)展過程中，盡管此類白細(xì)胞可被全反式維甲酸（all trans acid，ATRA）或砷劑誘導(dǎo)分化成熟，加之對(duì)白血病支持治療的改進(jìn)，患者的生存率已有了明顯提高，但治療前不明原因發(fā)熱及完全緩解后因感染所致的高死亡率時(shí)有發(fā)生［7-10］。即使在發(fā)達(dá)國家，對(duì)復(fù)發(fā)難治性小兒白血病的治療效果仍不樂觀［11］。

由于變異蛋白PML（NLS-）在致APL 發(fā)病中與GINS2 基因存在關(guān)聯(lián)，本課題組前期研究［12］通過PCR 法檢測(cè)了GINS2 在白血病HL60、THP-1和U937 細(xì)胞株中的表達(dá)水平，結(jié)果顯示：GINS2在白血病細(xì)胞株中普遍高表達(dá)。本課題組在前期研究［13］中 構(gòu) 建 了 針 對(duì)GINS2 基 因 蛋 白 編 碼 區(qū)（coding sequence，CDS） 的干擾序列，并靶向下調(diào)其在APL 細(xì)胞株HL60 中的表達(dá)，結(jié)果顯示：白血病細(xì)胞的增殖能力明顯受抑制且生長被阻滯在G2/M 期，相關(guān)的周期蛋白依賴性激酶1（cyclindependent kinases 1，CDK1） 和細(xì)胞周期蛋白B1（CyclinB1） 表達(dá)受到明顯抑制。本文作者推測(cè)：GINS2 可能通過上調(diào)人共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管突變基因（ataxia telangiectasia mutated，ATM）、細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)激酶2 （cell cycle checkpoint kinase 2，CHK2） 及抑癌基因p53 的表達(dá)水平而發(fā)揮作用［14］。一系列的研究［12-14］表明：GINS2 作為促癌因子在APL 的發(fā)生發(fā)展中起到關(guān)鍵作用。為此，本文作者將構(gòu)建成功的誘餌質(zhì)粒pGBKT7-GINS2與人早幼粒細(xì)胞cDNA 文庫質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)化至酵母AH109 感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)過對(duì)篩選到的陽性克隆進(jìn)行測(cè)序、比對(duì)和回轉(zhuǎn)驗(yàn)證，成功在細(xì)胞中篩選到了8 個(gè)能與GINS2 發(fā)生相互作用的靶蛋白，進(jìn)一步通過研究相互作用蛋白的生物學(xué)功能闡釋APL 的分子發(fā)生機(jī)制。

圖3 陽性克隆的回轉(zhuǎn)驗(yàn)證Fig.3 Secondary transfection validation of positive clones

本研究所篩選到的8 個(gè)基因中，RBM39 是RNA 結(jié) 合 蛋 白 家 族 （RNA-binding proteins，RBPs）的成員之一，在真核生物中RBM39 表達(dá)的蛋白可以與大量核心剪切體蛋白共定位表達(dá)，并能在類固醇激素受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄和選擇性剪接中發(fā)揮重要作用［15］。研究［16］表明：RBM39 導(dǎo)致HOXA9靶基因的剪接改變，是AML 致病通路中所必需的一個(gè)重要轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)。RBM39 也能作為磺胺類藥物的作用靶點(diǎn)，為復(fù)發(fā)或難治性剪接體突變的AML患者提供有效的基因治療手段［17］。UBA1 作為催化泛素偶聯(lián)的起始酶標(biāo)記蛋白質(zhì)泛素化調(diào)節(jié)其降解，并參與DNA 的修復(fù)［18］，而且還可作為白血病和多發(fā)性骨髓瘤的治療靶點(diǎn)［19］。MT2A 是人金屬硫蛋白家族（metallothioneins，MTs） 成員之一，是一類低相對(duì)分子質(zhì)量、富含半胱氨酸并可被金屬誘導(dǎo)的特異蛋白［20］。MT2A 的表達(dá)降低可下調(diào)細(xì)胞中鋅水平并影響細(xì)胞凋亡，還可通過下調(diào)B 淋巴細(xì)胞瘤-2 基因相關(guān)蛋白X （Bcl-2 associated X protein，BAX）、半胱氨酸蛋白酶3（caspase-3）、半胱氨酸蛋白酶9（caspase-9）和半胱氨酸蛋白酶12（caspase-12）等凋亡蛋白的表達(dá)而抑制細(xì)胞凋亡［21］。MICU1 作為線粒體鈣離子單項(xiàng)轉(zhuǎn)運(yùn)體（mitochondrial calcium uniporter，MCU）的亞基之一，對(duì)于線粒體基質(zhì)內(nèi)Ca2+的富集起到關(guān)鍵作用，而Ca2+作為細(xì)胞內(nèi)重要信號(hào)分子，維持了細(xì)胞能量代謝、生長及增殖等多種功能［22］。而早幼粒細(xì)胞白血病蛋白PML 的功能失活直接導(dǎo)致了從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)移到線粒體的Ca2+減少，進(jìn)而引起了細(xì)胞凋亡增加和不可控的細(xì)胞增殖乃至持續(xù)的細(xì)胞自噬發(fā)生［23］。NSFL1C 又被稱為P47，是一種三聚體蛋白，能與P97 蛋白結(jié)合并介導(dǎo)高爾基體的有絲分裂和細(xì)胞再生［24］，在PML 敲除后的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中高表達(dá)，且對(duì)細(xì)胞黏附和遷移起到關(guān)鍵作用［25］。FAR1 可以將脂肪酸轉(zhuǎn)化為脂肪醇，這一過程是合成單酯和醚類脂類所必需［26］。DUSP1 所編碼的蛋白是一種具有酪氨酸和蘇氨酸雙重特異性的磷酸酶，可以將MAPKs/ ERK2 脫磷酸化，從而參與 細(xì) 胞 生 理 過 程［27］。DUSP1 在AML 患 者 及 細(xì) 胞系中的表達(dá)與酪氨酸激酶3 串聯(lián)重復(fù)序列有關(guān)聯(lián)［28］。CD14 分子主要在單核/巨噬細(xì)胞膜表面表達(dá)，能與其他蛋白質(zhì)協(xié)同作用并介導(dǎo)對(duì)細(xì)菌脂多糖的先天免疫應(yīng)答［29］。

綜上所述，本研究成功從人早幼粒細(xì)胞cDNA文庫中篩選到8 個(gè)能與GINS2 發(fā)生相互作用的靶蛋白，其有可能成為APL 診療的新靶點(diǎn)。