姜黃素對高膽固醇血癥模型大鼠腦微循環(huán)障礙的改善作用及其機制

李紅芳, 楊 紹, 曹莫寒, 袁麗麗, 李曉琎, 史才興, 王茁椏, 亞白柳

（1. 濟寧醫(yī)學院附屬醫(yī)院神經內科，山東 濟寧 272029；2. 濟寧醫(yī)學院中西醫(yī)結合學院，山東 濟寧272067；3. 濟寧醫(yī)學院基礎醫(yī)學院，山東 濟寧 272067；4. 濟寧醫(yī)學院基礎醫(yī)學院組織學與胚胎學教研室，山東 濟寧 272067；5. 濟寧醫(yī)學院基礎醫(yī)學院生理學教研室，山東 濟寧 272067）

高膽固醇血癥與缺血性腦血管病的發(fā)生發(fā)展及其預后有密切關聯(lián)，是缺血性腦血管病發(fā)生的危險因素之一［1-2］。血漿膽固醇升高與冠狀動脈及外周血管疾病的發(fā)病率升高有關聯(lián)，而動脈粥樣硬化病變的發(fā)生也增加了組織發(fā)生缺血的可能性。同時，早在動脈粥樣硬化病變出現(xiàn)之前，高膽固醇血癥就會導致微血管功能障礙。研究［3-4］顯示：高膽固醇飲食引起的血脂紊亂導致腦微血管發(fā)生氧化應激損傷，并促使微血管出現(xiàn)炎性表現(xiàn)以及有利于血栓形成的表型，表現(xiàn)為微血管內皮細胞黏附分子表達增加，白細胞與內皮細胞黏附增強。本課題組前期研究［5］結果也表明：血漿膽固醇水平升高時，腦微血管抗氧化能力明顯降低，進而引起微循環(huán)功能障礙。高膽固醇血癥造成的腦微循環(huán)障礙，使腦組織更易發(fā)生缺血損傷，并且當腦缺血發(fā)生時，損傷會更加嚴重。

姜黃素是從姜黃根部提取的一種天然活性酚類化合物，具有降低膽固醇、抗氧化和抗炎等多種藥理作用［6-8］。作為一種有潛在治療意義的特效前體藥物，姜黃素一直是藥物研發(fā)領域關注的熱點。但是姜黃素是否能夠基于降低血漿膽固醇而改善高膽固醇血癥模型大鼠腦部微循環(huán)障礙目前尚不清楚。為了探索姜黃素對腦部微循環(huán)的保護作用，本研究以高膽固醇飼料喂飼大鼠制備高膽固醇血癥大鼠模型，同時灌胃給予姜黃素，觀察姜黃素對大鼠血脂水平的影響以及對腦部微血管氧化應激損傷及細胞黏附分子表達的調節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑及儀器雄性Sprague Dawley（SD） 大鼠30 只，體質量（180±20） g，SPF 級，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物使用許可證號：SYXK11-00-0008。飼養(yǎng)條件：室溫（22±1）℃，相對濕度60%，光線自動控制12 h 明暗交替變換。大鼠自由攝取水和食物。

姜黃素（含量95.5%） 購自河北食品添加劑有限公司（生產批號：090630），葡聚糖T-40（Dextran T-40，17-0270-01） 購自美國Pharmacia公司，羧甲基纖維素鈉購自北京鳳禮精求商貿有限責任公司（批號：1812250），丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD） 檢測試劑盒購自南京建成科技有限公司，細胞間黏附因子1 （intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）羊抗大鼠多克隆一抗、血管細胞黏附因子1 （vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1） 兔抗大鼠多克隆一抗和E-選擇素（E-selectin） 羊抗大鼠多克隆一抗購自美國Santa Cruz 公司，總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白 膽 固 醇（high density lipoprotein- cholesterol，HDL-C） 和低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein-cholesterol，LDL-C） 試 劑 盒 由 首 都 醫(yī)科大學臨床科技中心提供。全自動生化分析儀（Beckman Coulter CX4 Pro，美國Beckman 公司），全自動酶標儀（LP4000 型，法國巴德斯公司），PowerPac200 電泳儀和電泳濕轉儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 高膽固醇血癥大鼠模型的構建30 只SD 大鼠適應性喂養(yǎng)7 d 后，隨機分為對照組、模型組和姜黃素組，每組10 只。對照組大鼠每日給予普通飼料，其余2 組大鼠每日給予高膽固醇飼料，各組大鼠自由飲水，連續(xù)喂飼28 d。姜黃素用1%羧甲基纖維素鈉配成混懸液。造模同時各組大鼠灌胃給藥，每日1 次，對照組和模型組大鼠給予等量1%羧甲基纖維素鈉溶液灌胃，姜黃素組大鼠給予姜黃素200 mg·kg－1灌胃。高膽固醇飼料由2%膽固醇、0.2%膽酸、10%豬油、15%蛋黃粉和72.8%基礎飼料組成，購自中國醫(yī)學科學院實驗動物中心。

1.3 取材及樣品制備實驗結束后，各組大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，采用頸總動脈插管取血（取血前10 h 禁食水），待血液自凝后，取血清，－20 ℃保存，檢測血清中TC、TG、LDL-C和HDL-C 水平。斷頭處死大鼠，迅速取大鼠大腦皮層，稱質量，切成1 mm×1 mm×1 mm 小塊，放于杜恩斯玻璃勻漿器中，加入3 倍體積PBS（0.01 mol·L－1，pH 值 為7.4），勻 漿，取 出 勻 漿液，4 ℃、1 000 g 離心10 min，取沉淀，在3 倍體積的PBS 緩沖液中重懸，放入15%葡聚糖溶液，4 ℃、4 500 g 離心20 min，取出沉淀，放于50 μm的尼龍網篩，用冰PBS 緩沖液沖洗過濾，收集腦血管組織，－80 ℃條件下凍存，用于檢測腦微血管組織中SOD 活性和MDA 水平以及微血管內皮細胞 中ICAM-1、 VCAM-1 和E-selectin 蛋 白 表 達水平。

1.4 大鼠血清中血脂水平檢測采用全自動生化儀用酶法檢測各組大鼠血清中TC、TG、LDL-C和HDL-C 水平。

1.5 大鼠腦微血管組織中SOD 活性和MDA 水平檢測按照試劑盒說明書中的檢測程序嚴格操作。采用黃嘌呤氧化酶法檢測大鼠腦微血管組織中SOD 活性，采用硫代巴比妥酸法（TBA 法）檢測大鼠腦微血管組織中MDA 水平。

1.6Western blotting 法檢測大鼠腦微血管內皮細胞中ICAM-1、VCAM-1 和E-selectin 蛋 白 表 達 水平提取腦微血管總蛋白，用BCA 法調定各組蛋白濃度，溶解于10 g·L－1十二烷基硫酸鈉（SDS）中，沸水浴變性后，每組樣品取等量進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕法轉移至硝酸纖維素膜上，將膜置于5%脫脂奶粉封閉液中，室溫下封閉2 h。加入一抗和β-actin，4 ℃過夜。洗膜后，加入相應二抗（1∶1 000） 中，室溫反應2 h，再次洗膜，加入ECL 化學發(fā)光液。使用Image J 凝膠成像分析系統(tǒng)檢測各蛋白條帶，對各條帶整合灰度進行分析，實驗重復3 次，取平均值。目的蛋白表達水平＝目的蛋白條帶灰度值／β-actin 條帶灰度值。

1.7 統(tǒng)計學分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。各組大鼠血脂水平，大鼠腦微血管組織中SOD 活性和MDA 水平，大鼠腦微血管內皮細胞中ICAM-1、VCAM-1 和E-selectin 蛋白表達水平，經正態(tài)性檢驗符合正態(tài)分布，均以表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠血脂水平與對照組比較，模型組大鼠血清中TC、 TG 和LDL-C 水平明顯升高（P＜0.01），HDL-C 水平明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，姜黃素組大鼠血清中TC、TG 和LDL-C 水平明顯降低（P＜0.05），HDL-C 水平明顯升高（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠血脂水平Tab.1 Levels of blood lipids of rats in various groups

2.2 各組大鼠腦微血管組織中SOD活性和MDA水平與對照組比較，模型組大鼠腦微血管組織中SOD 活性明顯降低（P＜0.01），MDA 水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，姜黃素組大鼠腦微血管組織中SOD 活性明顯升高（P＜0.05），MDA 水平明顯降低（P＜0.05）。見表2。

2.3 各組大鼠腦微血管內皮細胞中ICAM-1、VCAM-1 和E-selectin 蛋白表達水平與對照組比較，模型組大鼠腦微血管內皮細胞中ICAM-1、VCAM-1 和E-selectin 蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05 或P＜0.01）；與模型組比較，姜黃素組大鼠腦微血管內皮 細 胞 中 ICAM-1 、 VCAM-1 和E-selectin 蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05）。見圖1 和表3。

表2 各組大鼠腦微血管組織中SOD 活性和MDA 水平Tab. 2 Activities of SOD and levels of MDA in cerebral microvessel tissue of rats in various groups (n=10，）

表2 各組大鼠腦微血管組織中SOD 活性和MDA 水平Tab. 2 Activities of SOD and levels of MDA in cerebral microvessel tissue of rats in various groups (n=10，）

*P＜0.05，**P＜0.01 compared with control group；△P＜0.05 compared with model group.

Group Control Model Curcumin SOD[λB/（U·mg－1）]93.04±8.41 129.88±9.47**99.82±7.96△MDA[mB/（μmol·g－1）]9.09±0.98 12.69±1.12*9.58±1.07△

圖1 各組大鼠腦微血管內皮細胞中ICAM-1、VCAM-1和E-selectin 蛋白表達電泳圖Fig.1 Electrophoregram of ICAM-1，VCAM-1 and E-selectin proteins in cerebral microvessel endothelial cells of rats in various groups

表3 各組大鼠腦微血管內皮細胞中ICAM-1、VCAM-1 和E-selectin 蛋白表達水平Tab. 3 Expression levels of ICAM-1 ，VCAM-1 and E-selectin in cerebral microvessel endothelial cells of rats in various groups

表3 各組大鼠腦微血管內皮細胞中ICAM-1、VCAM-1 和E-selectin 蛋白表達水平Tab. 3 Expression levels of ICAM-1 ，VCAM-1 and E-selectin in cerebral microvessel endothelial cells of rats in various groups

*P＜0.05，**P＜0.01 compared with control group；△P＜0.05 compared with model group.

Group Control Model Curcumin ICAM-1 0.10±0.02 0.41±0.04**0.23±0.02Δ VCAM-1 0.30±0.04 0.70±0.08*0.50±0.07△E-selectin 0.67±0.03 0.93±0.05**0.78±0.04△

3 討 論

本研究結果顯示：高膽固醇飲食大鼠可出現(xiàn)高膽固醇血癥，血漿膽固醇水平升高使腦微血管抗氧化應激能力減弱，脂質過氧化物生成增多，內皮細胞表面的黏附因子表達水平升高；姜黃素可以明顯降低高膽固醇血癥大鼠血脂水平，提高大鼠腦微血管組織中SOD 活性并降低MDA 水平，同時降低大鼠腦微血管內皮細胞中ICAM-1、 VCAM-1 和E-selectin 表達水平。本研究結果提示：姜黃素對高膽固醇飲食造成的早期大鼠腦微循環(huán)氧化應激及炎性改變具有保護作用。

高膽固醇血癥作為一種病理狀態(tài)，參與諸多與炎癥和血栓形成相關的疾病，是重要的致病機制之一［9-10］。高膽固醇血癥引起的微血管功能障礙表現(xiàn)為微動脈內皮依賴性血管舒張功能受損，毛細血管后微靜脈白細胞和血小板聚集，并且在微動脈和微靜脈均出現(xiàn)氧化應激損傷［10］。研究［11］表明：血漿膽固醇升高導致腦微血管內白細胞和血小板大量募集的機制可能與活性氧簇的產生有關。缺乏還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH） 氧化酶亞單位gp91phox 的高膽固醇血癥小鼠血小板和白細胞募集反應明顯減弱。同時，NADPH 氧化酶激活產生的超氧化物可促進內皮細胞黏附因子表達的增加。在高脂環(huán)境下，細胞黏附依賴性信號通路參與高膽固醇血癥時微血管改變，大量的黏附因子被激活。血管內皮細胞表面表達的ICAM-1、VCAM-1和E-selectin 表達上調，使白細胞在激活的內皮細胞表面滾動速度變慢，并且黏附的更加緊密，參與炎癥早期的黏附瀑布級聯(lián)反應［4］。本研究中，高膽固醇飲食誘導大鼠腦微循環(huán)出現(xiàn)氧化應激損傷及炎性改變，與上述研究結果一致。

姜黃素通過調節(jié)大量分子靶標，對多種慢性疾病起到預防和治療作用，且姜黃素的安全性、有效性和經濟性也是其優(yōu)于其他化合物的顯著特點［12-13］。作為一種前體藥物，姜黃素可以通過在靶點釋放有活性的自由巰基而實現(xiàn)抗氧化和抗炎的作用。結合姜黃素諸多優(yōu)勢，本研究選用姜黃素對缺血性腦卒中的危險因素進行干預，期望通過調控危險因素，預防缺血性腦卒中發(fā)生，與以往實驗研究［14-16］一致，姜黃素能夠起到調節(jié)血脂水平，降低膽固醇的作用。同時，本研究結果顯示：姜黃素可以明顯減輕高膽固醇血癥大鼠腦微循環(huán)氧化應激損傷，抑制腦微循環(huán)內皮細胞黏附因子表達。研究［3］顯示：膽固醇升高到一定閾值，微循環(huán)才會出現(xiàn)諸如黏附因子表達增多和血細胞黏附性增強等血管炎性改變；膽固醇水平一旦低于閾值，血管炎癥反應就會消失。因此推測，姜黃素改善大鼠腦微循環(huán)障礙的作用與其降低膽固醇的作用有關聯(lián)，由于膽固醇水平的降低，大鼠腦微循環(huán)氧化應激反應及黏附因子表達降低。

大量的臨床前研究為評價姜黃素在臨床試驗中的療效奠定了堅實的基礎。目前，100 多個姜黃素臨床試驗正在進行，將有助于更加充分地了解姜黃素的治療潛力及其在人類各種疾病臨床治療中的應用前景［17］。但是作為極有研發(fā)潛力的藥物，姜黃素的臨床應用也受到一定程度的限制，與其吸收不良、代謝迅速、生物半衰期短和口服生物利用度低的性質有關［18］。也有研究［19］表明：姜黃素可上調腸道堿性磷酸酶（腸上皮細胞產生的內源性成分）的表達，進而通過抗氧化和抗炎途徑來發(fā)揮遠端的或間接的保護作用。為了提高姜黃素的生物利用度，許多研究致力于研發(fā)諸如胡椒堿等生物佐劑與姜黃素聯(lián)合應用，或開發(fā)姜黃素結構類似物，或研發(fā)諸如姜黃素納米顆粒等藥物遞送技術。隨著生物利用度的提高，姜黃素會在慢性疾病治療中發(fā)揮巨大作用［20-23］。

綜上所述，姜黃素可以通過下調高膽固醇飲食引起的高膽固醇血癥大鼠血脂水平，提升大鼠腦微血管抗氧化應激能力，減輕氧化應激損傷，減少內皮細胞黏附因子表達，對高膽固醇飲食造成的早期的大鼠腦微循環(huán)氧化應激及炎性改變具有保護作用。針對高膽固醇血癥這種危險因素，姜黃素可以通過其降脂特性，改善血管內皮功能，預防缺血性腦卒中的發(fā)生?；诮S素在高膽固醇血癥大鼠腦微循環(huán)水平表現(xiàn)出的抗氧化抗炎作用，本研究將為動脈粥樣硬化及其相關疾病的預防提供實驗依據。