同源異型盒蛋白2B在外周神經(jīng)母細(xì)胞性腫瘤中表達(dá)及臨床意義

李靜羽，高吉照.徐州醫(yī)科大學(xué)附屬徐州兒童醫(yī)院 病理科，江蘇 徐州 000；

2.徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 兒童血液腫瘤?？疲K 徐州 221000

外周神經(jīng)母細(xì)胞性腫瘤(peripheral neuroblastic tumors，pNT)是小兒顱外最常見的惡性實(shí)體腫瘤之一[1]。國際神經(jīng)母細(xì)胞瘤病理分類系統(tǒng)根據(jù)年齡、有絲分裂—核碎裂指數(shù)、施萬間質(zhì)數(shù)量和神經(jīng)母細(xì)胞瘤分化程度，將pNT分為神經(jīng)母細(xì)胞瘤、節(jié)細(xì)胞性神經(jīng)母細(xì)胞瘤、節(jié)細(xì)胞性神經(jīng)母細(xì)胞瘤結(jié)節(jié)型與節(jié)細(xì)胞性神經(jīng)瘤[2-5]。pNT起病隱匿，難以發(fā)現(xiàn)，且惡性程度高，進(jìn)展迅速，常早期發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，且病死率高[6]。因此，對(duì)pNT進(jìn)行早期明確診斷具有重要意義。同源異型盒蛋白2B(paired-like homebox 2B，PHOX2B)作為一種自主神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子，表達(dá)于神經(jīng)嵴起源的自主神經(jīng)節(jié)(交感神經(jīng)節(jié)、副交感神經(jīng)節(jié)、腸神經(jīng)節(jié))、腎上腺髓質(zhì)及頸動(dòng)脈體，影響神經(jīng)細(xì)胞的分化與干細(xì)胞的維持[7-8]。本研究通過免疫組化法檢測pNT組織中PHOX2B的表達(dá)情況，旨在探討其對(duì)pNT的發(fā)病年齡、組織分化及預(yù)后的意義?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)資料 收集2013—2019年徐州醫(yī)科大學(xué)附屬徐州兒童醫(yī)院收治的30例經(jīng)病理診斷明確、治療規(guī)律、隨訪資料完整的pNT患者的病理組織。排除標(biāo)準(zhǔn)：在外院診斷后來院治療者；無隨訪記錄者。其中，男性12例，女性18例；年齡10 d至6歲，中位年齡2歲。另選取同期收治的27例非pNT的小圓細(xì)胞性腫瘤患者的病理組織作為對(duì)照。

1.2 主要試劑 一抗兔單克隆抗體PHOX2B購于上海Abcam公司，克隆號(hào)14 423，稀釋濃度1∶1 000；二抗山羊抗小鼠/兔IgG復(fù)合物購于上?；蚩萍脊煞萦邢薰?。光學(xué)顯微鏡型號(hào)Olympus BX43購于日本Olympus公司。

1.3 免疫組織化學(xué)染色 將組織常規(guī)包埋、切片、烤片、脫蠟、水化；內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑，室溫孵育10 min；檸檬酸鹽緩沖液抗原修復(fù)；滴加PHOX2B一抗，于4℃下孵育16 h。室溫復(fù)溫后，滴加酶標(biāo)山羊抗小鼠/兔IgG復(fù)合物；二氨基聯(lián)苯胺顯色；蘇木素復(fù)染、鹽酸酒精返紅、氨水返藍(lán)；脫水、透明、封片。

1.4 染色判定標(biāo)準(zhǔn) PHOX2B陽性結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：至少5%細(xì)胞存在核染色，PHOX2B染色主要定位于細(xì)胞核，陽性表達(dá)細(xì)胞判斷為鏡下組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞質(zhì)和/或細(xì)胞核有黃色顆粒沉著，且染色明顯高于背景。陰性表達(dá)的細(xì)胞中細(xì)胞質(zhì)被蘇木素藍(lán)染，棕黃色顆粒少見或缺如染色。在染色強(qiáng)度和同樣物鏡視野下的陽性細(xì)胞數(shù)乘積作為評(píng)分。染色強(qiáng)度分級(jí)：無著色為0分；淺黃色為1分；棕黃色為2分；3棕褐色為3分。按陽性細(xì)胞比例進(jìn)行評(píng)分：陽性占比<5%為1分；陽性占比5%～50%為2分；陽性占比51%～75%為3分；陽性占比76%～100%為4分。取兩項(xiàng)評(píng)分乘積判定結(jié)果：評(píng)分≤4分為低表達(dá)，評(píng)分>4分為高表達(dá)；12分為強(qiáng)陽性，中陽性為4～11分，分?jǐn)?shù)<4分為弱陽性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。計(jì)數(shù)資料用例(百分率)表示,組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

PHOX2B表達(dá)結(jié)果：pNT陽性表達(dá)率93.3%(28/30)。其中，強(qiáng)陽性22例(73.3%)、中陽性4例(13.3%)、弱陽性2例(6.7%)；陽性細(xì)胞比例評(píng)分4分22例(73.3%)、2～3分4例(13.3%)、1分2例(6.7%)；高表達(dá)23例(76.7%)，低表達(dá)5例(16.7%)。對(duì)照組27例全部為陰性。見圖1。PHOX2B蛋白主要定位于細(xì)胞核內(nèi)，并且其表達(dá)與pNT發(fā)病年齡、分化程度及預(yù)后均具有相關(guān)性(P<0.05)。見表1。

圖1 PHOX2B在pNT不同分型及對(duì)照組中表達(dá)[a.pNT中神經(jīng)母細(xì)胞瘤未分化型(200倍)；b.pNT中神經(jīng)母細(xì)胞瘤未分化型(400倍)；c.節(jié)細(xì)胞神經(jīng)母細(xì)胞瘤混合型中分化的腫瘤細(xì)胞PHOX2B表達(dá)(200倍)；d.原始神經(jīng)外胚層腫瘤細(xì)胞PHOX2B染色陰性(200倍)；e.淋巴母細(xì)胞性淋巴瘤腫瘤細(xì)胞PHOX2B染色陰性(200倍)；f.髓母細(xì)胞瘤腫瘤細(xì)胞PHOX2B染色陰性(200倍)]

表1 PHOX2B表達(dá)與pNT患者臨床病理特征關(guān)系/例(百分率/%)

3 討論

pNT作為常見的兒科顱外實(shí)體腫瘤，主要發(fā)生在18個(gè)月左右的兒童時(shí)期[9]，最常見于腎上腺髓質(zhì)，其次為腹部、胸部或頭部和頸部。pNT臨床表現(xiàn)多樣，部分表現(xiàn)為腫瘤播散、轉(zhuǎn)移，不給予治療導(dǎo)致死亡，部分發(fā)展成熟為良性的節(jié)細(xì)胞神經(jīng)瘤，甚至自發(fā)消退[10]。pNT屬于小圓藍(lán)細(xì)胞性腫瘤，存在未分化小圓細(xì)胞的組織形態(tài)，診斷困難，鑒別需生物學(xué)標(biāo)記。常用神經(jīng)源性標(biāo)記物有Syn、CgA，但是這些標(biāo)志物特異性不高，通常在其他小圓細(xì)胞腫瘤中也有表達(dá)[11-13]。此外，pNT的診斷在非典型病史或發(fā)生部位、有限的標(biāo)本或壓碎的標(biāo)本、未分化或差分化型的形態(tài)學(xué)方面具有挑戰(zhàn)性。所以尋找一種具有敏感性及特異性強(qiáng)的標(biāo)記物至關(guān)重要。

在周圍神經(jīng)系統(tǒng)中，神經(jīng)嵴細(xì)胞的維持以及神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞譜系是由 Delta-Notch通路介導(dǎo)的側(cè)向抑制決定的[13]。PHOX2B是調(diào)節(jié) Delta-Notch 通路的關(guān)鍵因子，編碼基因位于染色體 4p12，跨度4 888 bp，有一個(gè)3.0 kb 的轉(zhuǎn)錄本,編碼314個(gè)氨基酸，包括一個(gè)同源結(jié)構(gòu)域和兩個(gè)同源異型片段，分別為9個(gè)和20個(gè)丙氨酸殘基[14]。PHOX2B作為轉(zhuǎn)錄因子，與性別決定區(qū)盒子(the sex-determining region Y box10，SOX10)相互協(xié)調(diào)對(duì)神經(jīng)嵴細(xì)胞的分化起引導(dǎo)作用[15-16]。本研究通過免疫組化的方法檢測pNT中PHOX2B蛋白表達(dá)，表明PHOX2B表達(dá)強(qiáng)度與pNT腫瘤細(xì)胞的分化程度有關(guān)，分化程度越低，表達(dá)越強(qiáng)。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，PHOX2B的表達(dá)與年齡有關(guān)，年齡≤18個(gè)月患者的高表達(dá)率為93.7%，明顯高于年齡>18個(gè)月患者的57.1%。Bachetti等[17]對(duì)不同分化階段的神經(jīng)母細(xì)胞瘤進(jìn)行PHOX2B基因檢測發(fā)現(xiàn)，PHOX2B的低表達(dá)與良好的總體生存率有關(guān)。

綜上所述，PHOX2B對(duì)pNT的診斷具有高度敏感性及特異性，可作為pNT可靠的診斷標(biāo)記物；PHOX2B表達(dá)高低與發(fā)病年齡、腫瘤細(xì)胞分化程度及病理預(yù)后均相關(guān)，動(dòng)態(tài)檢測PHOX2B變化，有望成為判斷pNT病情進(jìn)展與否的重要指標(biāo)。