茶多酚-羧甲基殼聚糖水凝膠促進(jìn)大鼠創(chuàng)面修復(fù)研究

陳 凱，柳云恩，佟昌慈，叢培芳，馬瑞珩

1.上饒師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院 上饒農(nóng)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新研究院，江西 上饒 334000；2.北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 急診醫(yī)學(xué)部，遼寧 沈陽(yáng) 110016

皮膚撕裂傷是老年人和嬰兒常見的急性創(chuàng)傷[1]。急性創(chuàng)傷可發(fā)展為慢性復(fù)雜創(chuàng)傷，增加患者的經(jīng)濟(jì)和心理負(fù)擔(dān)，降低生活質(zhì)量。生長(zhǎng)因子是治療皮膚創(chuàng)傷的主要藥物，但會(huì)增加瘢痕組織形成和癌癥風(fēng)險(xiǎn)[2]。因此，需要開發(fā)其他促進(jìn)皮膚創(chuàng)面修復(fù)和再生的有效藥物或生物活性材料。羧甲基殼聚糖(carboxymethyl chitosan，CMCS)是由殼聚糖經(jīng)甲基化制得，含有陽(yáng)離子(-NH3+)和陰離子(-COO-)基團(tuán)。CMCS水凝膠具有抗菌活性，可防止傷口感染，促進(jìn)細(xì)胞增殖，加速膠原沉積，并刺激傷口愈合過(guò)程[3-4]。有研究表明，CMCS水凝膠是一種良好的生物相容性材料，可作為創(chuàng)面修復(fù)的候選敷料[5]。茶多酚(epigallocatechin gallate，EGCG)具有顯著的抗炎、抗衰老、抗菌、抗癌、抗肥胖、調(diào)節(jié)腸道菌群等功效[6]，還可以降低創(chuàng)面的炎癥反應(yīng)，加速創(chuàng)傷修復(fù)，促進(jìn)創(chuàng)面表皮再生，是一種具有良好生物安全性的、能夠加速創(chuàng)面修復(fù)的天然原材料[7]。本研究旨在制備一款新型的EGCG-CMCS水凝膠，并探討其對(duì)大鼠創(chuàng)面的保護(hù)和修復(fù)作用?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 EGCG購(gòu)自麥克林公司，CMCS由中國(guó)科學(xué)院金屬研究所提供(平均分子量為6.2×104,脫乙酰度為84%)。實(shí)驗(yàn)用水為實(shí)驗(yàn)室制備的雙次蒸餾去離子水，其余藥品均購(gòu)自國(guó)藥。45只SPF級(jí)健康雄性SD大鼠購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司，許可證號(hào)SCXK(遼)2015-0001，體質(zhì)量180～220 g，單籠飼養(yǎng)，自由飲水和飲食，適應(yīng)環(huán)境7 d。大鼠飼養(yǎng)條件：室溫條件下，濕度50%～60%，燈光-黑暗12 h晝夜循環(huán)。

1.2 CMCS和EGCG-CMCS水凝膠制備 CMCS水凝膠：15.0 ml離心管中稱取0.2 g殼聚糖，置于無(wú)菌操作臺(tái)，經(jīng)紫外照射1.0 h滅菌后，加入10.0 ml滅菌去離子水，充分溶解后，形成0.2% CMCS水凝膠，4.0℃避光保存。EGCG-CMCS水凝膠：15.0 ml離心管中稱取0.2 g殼聚糖+0.3 g茶多酚，置于無(wú)菌操作臺(tái)，經(jīng)紫外照射1.0 h滅菌后，加入10.0 ml滅菌去離子水，充分溶解后，形成EGCG(0.3%)-CMCS(0.2%)水凝膠，4.0℃避光保存。

1.3 大鼠皮膚全缺損模型建立 大鼠腹腔注射10.0%水合氯醛(4.0 ml/kg)進(jìn)行麻醉，用剃須刀剃掉大鼠背部約1 600.0 mm2的毛，用脫毛膏脫掉短毛，用75.0%酒精消毒，用滅菌后的打孔器在大鼠脊背中心劃出直徑為1.5 cm的圓形印，用滅菌后手術(shù)剪刀剪去圓形中結(jié)締組織層上的全層皮膚，完成皮膚全層缺損模型。

1.4 分組與給藥 45只大鼠被隨機(jī)分入空白組、CMCS水凝膠組、EGCG-CMCS水凝膠組，每組各15只。建模成功后，每天給予CMCS水凝膠組和EGCG-CMCS水凝膠組大鼠創(chuàng)面CMCS水凝膠和EGCG-CMCS水凝膠，連續(xù)3 d。給藥前，用生理鹽水沖洗創(chuàng)面及創(chuàng)面周圍，然后拍照，給藥后單籠飼養(yǎng)。大鼠皮膚組織分別在術(shù)后7、10、15 d取材。

1.5 創(chuàng)傷面積測(cè)量 每天對(duì)傷口區(qū)域(新表皮未覆蓋的區(qū)域)進(jìn)行拍照，由兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的研究人員獨(dú)立用Imagej1.48軟件進(jìn)行分析。創(chuàng)傷恢復(fù)百分比用下列公式計(jì)算：

創(chuàng)傷恢復(fù)百分比=(第1天創(chuàng)傷面積-第n天創(chuàng)傷面積)/第1天創(chuàng)傷面積×100%

1.6 組織學(xué)觀察 術(shù)后7、10、15 d采集皮膚標(biāo)本。皮膚組織用10%甲醛固定2～3 d，經(jīng)梯度酒精脫水、包埋、切片、蘇木精-伊紅染色及改良Masson染色。在顯微鏡下觀察組織創(chuàng)面生長(zhǎng)情況和膠原沉積。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠體質(zhì)量變化情況 3組大鼠術(shù)后當(dāng)天飲食均有一定減少，隨后恢復(fù)正常。術(shù)后1 d，3組大鼠體質(zhì)量均下降，EGCG-CMCS水凝膠組大鼠體質(zhì)量降低最少；術(shù)后2 d，3組大鼠體質(zhì)量均顯著增加；術(shù)后3～15 d，3組大鼠體質(zhì)量均逐漸增加。同一時(shí)間點(diǎn)，EGCG-CMCS水凝膠組大鼠體質(zhì)量略高于其他兩組。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，3組大鼠創(chuàng)面及創(chuàng)面附近未發(fā)生腫脹、出血、起泡、局部并發(fā)癥、感染等；另外，大鼠的物理運(yùn)動(dòng)參數(shù)，如探索行為、行動(dòng)、后腿站立等也未出現(xiàn)明顯的疼痛跡象。見圖1。

圖1 3組大鼠體質(zhì)量變化情況

2.2 3組大鼠創(chuàng)面愈合情況 術(shù)后3 d，3組大鼠創(chuàng)面均呈干燥狀態(tài)，創(chuàng)面及周圍皮膚組織未見明顯的紅腫、分泌物及感染狀態(tài)；同時(shí)，創(chuàng)面周圍毛發(fā)開始生長(zhǎng)。術(shù)后7 d，3組大鼠創(chuàng)面明顯縮小，EGCG-CMCS水凝膠組創(chuàng)傷恢復(fù)百分比高于其他兩組(P<0.05)。與空白組創(chuàng)面結(jié)痂呈堅(jiān)硬狀態(tài)不同，EGCG-CMCS水凝膠組創(chuàng)面結(jié)痂完全脫落，出現(xiàn)新生肉芽組織；術(shù)后15 d，3組創(chuàng)傷恢復(fù)百分比接近，但空白組結(jié)痂仍未完全脫落，CMCS水凝膠組和EGCG-CMCS水凝膠組的結(jié)痂均已完全脫落，創(chuàng)面恢復(fù)情況顯著好于空白組(P<0.05)。見圖2。

圖2 3組大鼠創(chuàng)面愈合情況

2.3 3組大鼠創(chuàng)面組織病理學(xué)變化情況 蘇木精-伊紅染色顯示：術(shù)后7 d，空白組大鼠組織中含有少量的新生肉芽組織、新生毛細(xì)血管及膠原蛋白沉積，同時(shí)伴有大量的炎癥細(xì)胞、水腫、壞死細(xì)胞及血塊，而CMCS水凝膠組和EGCG-CMCS水凝膠組均呈現(xiàn)出對(duì)于炎癥細(xì)胞的明顯抑制效果；CMCS水凝膠組創(chuàng)面觀察到大量的新生肉芽組織，伴隨大量的新生毛細(xì)血管、少量炎癥細(xì)胞及大量的膠原蛋白沉積，EGCG-CMCS水凝膠組創(chuàng)面處具有最多的新生肉芽組織和新生毛細(xì)血管，表面細(xì)胞大量增殖，已經(jīng)出現(xiàn)較為致密的膠原纖維，炎癥細(xì)胞基本消失；術(shù)后15 d，CMCS水凝膠組和EGCG-CMCS水凝膠組創(chuàng)面處出現(xiàn)大量的新生血管、肉芽組織及致密的膠原纖維；EGCG-CMCS水凝膠組的上表皮化水平和膠原蛋白纖維致密水平顯著好于其他兩組(P<0.05)。見圖3。Masson染色顯示：各時(shí)間點(diǎn)的EGCG-CMCS水凝膠組的膠原纖維含量均為最高的，空白組的膠原纖維含量均為最低(P<0.05)。見圖4。

圖3 3組大鼠組織病理情況

圖4 3組大鼠創(chuàng)面膠原纖維情況

3 討論

傷口愈合是一個(gè)涉及纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、表皮細(xì)胞等多種細(xì)胞類型的動(dòng)態(tài)過(guò)程[8]。創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵指標(biāo)就是創(chuàng)面處新血管形成。創(chuàng)面處新血管形成和增殖可以為創(chuàng)面帶來(lái)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)細(xì)胞增殖和膠原蛋白沉積[9]。本研究發(fā)現(xiàn),EGCG-CMCS水凝膠組大鼠體質(zhì)量略高于其他兩組，且局部創(chuàng)面未發(fā)現(xiàn)腫脹、出血、感染等癥狀；EGCG-CMCS水凝膠組創(chuàng)傷恢復(fù)百分比高于其他兩組(P<0.05)，且EGCG-CMCS水凝膠組創(chuàng)面結(jié)痂完全脫落，出現(xiàn)新生肉芽組織；EGCG-CMCS水凝膠組可見大量新生肉芽組織和新生毛細(xì)血管，表面細(xì)胞大量增殖，已經(jīng)出現(xiàn)較為致密的膠原纖維，炎癥細(xì)胞基本消失；EGCG-CMCS水凝膠組的上表皮化水平和膠原蛋白纖維致密水平顯著好于其余兩組，膠原纖維含量也顯著高于其余兩組(P<0.05)。這提示，EGCG-CMCS水凝膠增強(qiáng)創(chuàng)傷修復(fù)速度可能是EGCG和CMCS協(xié)同作用的結(jié)果。CMCS水凝膠被廣泛認(rèn)為是理想的傷口敷料，因其具有良好的生物安全性和多種生物活性[10]。有研究報(bào)道，CMCS水凝膠具有隔絕外界細(xì)菌的作用，可為創(chuàng)面愈合提供持續(xù)的濕潤(rùn)環(huán)境，含有促進(jìn)上皮細(xì)胞遷移、生長(zhǎng)等作用及運(yùn)載多種小分子的活性物質(zhì)，是一種很好的藥物載體[11]。Huang等[12]提出，EGCG可通過(guò)靶向 Notch促進(jìn)鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病小鼠創(chuàng)面愈合。EGCG可放大具有適當(dāng)?shù)目箯垙?qiáng)度、孔隙度、吸收傷口滲出物的膨脹性傷口貼片的效力，通過(guò)調(diào)節(jié)生長(zhǎng)因子和炎癥細(xì)胞因子，發(fā)揮收縮創(chuàng)面、促進(jìn)膠原沉積、加強(qiáng)創(chuàng)面血管化的作用，加速愈合[7]。

綜上所述，EGCG-CMCS水凝膠具有良好的促進(jìn)血管生成和表皮再生作用，可促進(jìn)大鼠創(chuàng)面的膠原蛋白沉積和肉芽組織形成，加速創(chuàng)面愈合。