葛屬植物-根瘤菌共生體的研究進展

胡書娟，詹慶才，劉 璐

（1.湖南大學研究生院隆平分院，湖南 長沙 410125；2.湖南省農業(yè)生物技術研究所， 湖南 長沙 410125）

葛屬（Pueraria）是豆科蝶形花亞科下的一個屬，為蔓生性、多年生落葉藤本植物[1]。目前該屬約35種植物，包括野葛[Pueraria lobata（Willd.）Ohwi]、粉葛[Pueraria thomsonii（Benth.）]、三裂葉野葛[Pueraria phaseoloides（Roxb.）Benth.]、黃毛萼葛（Pueraria calycina Franch.）、密花葛（Pueraria alopecuroides Craib）、小花 野葛（Pueraria stricta Kurz）等[2]。我國葛屬植物有12種，廣泛分布于除新疆、青海及西藏外的其他地區(qū)，具有適應性廣、生長快、抗逆性強、耐瘠薄等特性[3]。葛藤萌芽及生長能力強，枝葉繁茂，根系發(fā)達，是優(yōu)良的水土保持植物和畜禽飼料[4]。其肥大塊根稱為葛根，富含優(yōu)質淀粉和黃酮類物質，具有很好的保健功能，被列入藥食同源的天然植物名單，是世界上重要的糧食替代作物之一[5]。

葛屬植物能夠與根瘤菌建立共生關系，通過生物固氮作用改善土壤結構、提高土壤肥力[6]，適于作為先鋒植物應用于重金屬污染土壤的修復和退化生態(tài)系統的植被恢復[7-8]。近年來，葛根在中藥材提取和食品加工領域的應用比例大幅度上升，其栽培面積隨之增加[2]。然而，目前對于葛屬植物共生根瘤菌的認識遠遠不夠。深入開展葛屬植物-根瘤菌共生體的研究，挖掘優(yōu)良的根瘤菌種質資源，對于充分發(fā)揮葛屬植物的經濟價值和生態(tài)功能具有重要意義。因此，筆者梳理了國內外葛屬植物-根瘤菌共生體的研究進展，并結合個人的研究工作展望了未來該領域的發(fā)展方向。

1 葛屬植物根瘤菌的資源調查

根瘤菌資源調查是開展根瘤菌分類及遺傳多樣性、生物地理分布格局等研究的重要基礎，同時能夠發(fā)掘新的根瘤菌資源應用于農業(yè)、林業(yè)和牧業(yè)中。近30 a 來，陳文新院士及其團隊等對我國30 多個省市不同生態(tài)環(huán)境下的豆科植物進行全面地資源調查及系統地分類分析，獲得上萬份豆科植物根瘤標本，其中以大豆根瘤菌的資源調查及研究最為全面、系統[9-10]。雖然葛屬植物廣泛分布于我國各地，但對其根瘤菌資源的調查和研究還遠遠不夠。從已有的文獻看，以野葛根瘤菌的調查和研究較多，資源調查范圍涵蓋重慶、四川、貴州和廣西等地，包括了黃壤、紫色土和石灰 土等土壤類型（表1）。

表1 葛屬根瘤菌及其根瘤內生菌的遺傳多樣性

根瘤一般長在側根上，須根多的植株根瘤數量也較多[12,15,18-19]。根瘤直徑常在1～5 mm 之間，其大小與土壤的疏松度、濕度等密切相關；根瘤顏色多為淺褐色和淡黃色，根瘤形狀以球形最為常見，偶見珊瑚狀、姜狀和柱形[12]。葛藤須根系發(fā)達，其結瘤數量很多，且固氮效率較高，因此固氮總量非常可觀[20]。粉葛、三裂葉野葛的根瘤菌資源調查較少，其結瘤特征與野葛基本一致[21-22]；密花葛、小花野葛等其他種的根瘤菌資源調查暫未見報道。

在根瘤菌資源研究中，主要采用2 種方式進行采樣調查及研究。一種方法是廣泛采集某地理區(qū)域或生態(tài)區(qū)內來自不同宿主植物的根瘤樣品，以了解該研究區(qū)域根瘤菌多樣性等[12,15-16]；另一種方法是采集來自不同地域的來源于同一植物的根瘤樣品，以用于根瘤菌生物地理學研究、根瘤菌與宿主之間的協同進化 等[23-25]。由于葛屬植物根瘤菌資源調查難度遠大于栽培豆科作物根瘤菌資源調查，現有的葛屬根瘤菌資源調查多局限于單一地理區(qū)域，缺乏不同地理區(qū)域或生境內葛屬根瘤菌的比較研究。另外，在栽培種與野生種之間，與葛屬植物共生的根瘤菌是否存在差異，也有必要開展更多的調查研究。

2 葛屬植物-根瘤菌共生體的遺傳多樣性

根瘤菌物種的準確鑒定是進行根瘤菌遺傳多樣性研究的基礎，根瘤菌分類方法從以宿主植物為中心的“互接種族”的傳統分類逐步發(fā)展到研究“系統發(fā)育關系”的現代系統分類[9]。根瘤菌多屬于α-和β-變形菌綱，包括Rhizobium（根瘤菌屬）、Sinorhizobium（中華根瘤菌屬）、Mesorhizobium（中慢生根瘤菌屬）、Bradyrhizobium（慢生根瘤菌屬）和Burkholderia（伯克氏菌屬）等[26]。根瘤菌的遺傳分群主要采用多相分類方法，廣泛使用的技術手段有基因組指紋圖譜分析、特定基因序列分析、DNA-DNA 雜交、G+C mol%及多位點序列分析（MLSA）等[27]。Konstantindis 等[28]提出以基因組平均核苷酸一致性（ANI）作為新的細菌種分類標準，Zhang 等[29]發(fā)現依據3 個核心基因（SMc00019，thrA，truA）計算的ANI 值在95%或96%水平上可以將根瘤菌鑒定到種。

國內外對根瘤菌的分類與系統發(fā)育研究取得了較大的進展，但葛屬植物根瘤菌的系統發(fā)育研究仍處于起步階段[27-30]。從已有的文獻來看，葛屬植物能與多個屬種的根瘤菌建立共生關系，如Rhizobium、Bradyrhizobium 和Mesorhizobium。野葛能與這3 個屬的多個種共生，而采集自四川的粉葛與Mesorhizobium 共生，采集自喀麥隆東部的三裂葉野葛與Bradyrhizobium 共生。由此可見，葛屬根瘤菌具有豐富的遺傳多樣性（表1）。來源于不同區(qū)域、不同土壤條件的葛藤共生根瘤菌種群存在差異，表明葛藤根瘤菌可能存在顯著的生物地理學分布格局[11,13-14,17]。課題組前期對采集于桂西北喀斯特區(qū)（堿性石灰土）和湖南紅壤丘陵區(qū)（酸性土）的野葛根瘤進行研究，發(fā)現與野葛共生的根瘤菌均屬于慢生根瘤菌屬的多個種[15]。但是，分離自相近地點的野葛根瘤菌的親緣關系也較近，表明根瘤菌種群分布可能受地理距離的影響。目前，葛屬根瘤菌的系統發(fā)育研究多通過16S rDNA 基因序列來確定其屬的分類地位，無法準確鑒定到種。在今后的研究中，有必要通過多基因序列分析、全基因組序列比較來確定葛屬根瘤菌種的分類地位。另外，共生基因的水平轉移是根瘤菌物種多樣性形成的主要原因[31]，需要加強葛屬根瘤菌的核心基因與共生基因（nodC、nifH 等）的研究，以揭示葛屬根瘤菌的進化歷史，為建立葛屬植物-根瘤菌的高效共生體提供理論依據。

豆科植物根瘤內存在許多非共生細菌，包括土壤桿菌、假單胞菌和芽孢桿菌等[10,32]。葛屬植物根瘤內除了有能共生的根瘤菌外，還包括一些不具有結瘤能力的非共生根瘤菌和其他根瘤內生菌[14,17]。非共生與共生根瘤菌之間存在競爭關系，而且在植物根際共生基因橫向轉移過程中存在基因受體與供體的關系。Boonsnongcheep 等[14]從Pueraria candollei 根瘤中分離到一株非共生根瘤菌，經鑒定為根瘤菌屬的一個新種，該菌株在回接試驗中無法讓宿主結瘤，且根瘤DNA 擴增不出nifH 基因和nodC 基因。另外，已發(fā)現的葛屬植物根瘤內生菌包括Pseudomonas koreensis、Herbaspirillum huttiense 和Bacillus thuringiensis 等，其中部分內生菌對宿主植物具有促生作用[12,17]。已有研究表明，在豆科植物根瘤內，可能存在共生固氮基因從共生菌向內生菌水平橫向轉移的現象[31]。通過對內生菌-根瘤菌-葛屬植物相互作用的研究，有助于人們理解葛屬植物根瘤菌的起源和進化，也為科學利用這些內生菌的生態(tài)作用提供理論依據和應用基礎。

3 葛屬植物-根瘤菌共生體的固氮效率

根瘤菌-豆科植物共生固氮作用受根瘤菌、宿主植物和土壤環(huán)境的共同影響。耕作方式（如免耕）通過影響土壤養(yǎng)分、物理性質等間接影響豆科植物-根瘤菌共生體的固氮作用[33]。宿主植物的根際分泌物會影響根瘤菌的侵染和土壤養(yǎng)分的有效性等[34]；土壤環(huán)境主要包括土壤pH 值、水分、質地和營養(yǎng)元素等，影響根瘤形成、發(fā)育及固氮酶活性等[35-36]。土壤過酸（pH 值＜5.0）或過堿（pH 值＞8.5）均會嚴重抑制根瘤菌結瘤和固氮[37]；水分是限制根瘤菌侵染、結瘤和固氮的主要因子，在干旱脅迫條件下根瘤菌中參與氧化應激反應的基因表達上調[38]；鹽脅迫使豆科植物根毛變形，從而降低根瘤菌的侵染率及固氮效率[39]；在氮素水平高的土壤中存在著“氮阻遏”現象，氮作為信號分子影響共生固氮基因的功能從而抑制共生固氮過程[40]。另外，鐵元素影響血紅蛋白、固氮酶等與共生固氮密切相關功能蛋白的合成，進而影響共生固氮效率[41]。

共生固氮的測定方法主要有氮累積法、乙炔還原法、15N整合法、同位素稀釋法和15N自然豐度法5種[42]。乙炔還原法是最常用的方法，原理是利用固氮酶能將空氣中的N2還原為NH3，也能將乙炔還原為乙烯的特點，通過測定乙烯產生速率計算固氮效率。該法特點是操作簡單、成本低、靈敏度高[43]。15N 自然豐度法利用固氮與非固氮植物氮同位素特征的自然差異估算固氮速率[44]。該法優(yōu)點是不需收集根瘤，僅需收集葉片材料；缺點是固氮植物和非固氮參考植物間15N豐度的差異很小，測量誤差等導致結果具有高度的不確定性，較適用于農業(yè)或草地生態(tài)系統。目前，關于葛屬植物-根瘤菌共生固氮作用的研究基本處于空白，課題組前期通過15N 自然豐度法粗略比較了喀斯特區(qū)域多種豆科植物（野葛、深紫木藍、香合歡、中南魚藤等）的共生固氮效率，結果發(fā)現野葛-根瘤菌共生體的固氮效率高于深紫木藍、香合歡等多種植物，僅次于中南魚藤-根瘤菌共生體[20]?？紤]到野葛須根系特別發(fā)達，結瘤數量巨大，因此野葛-根瘤菌共生體的固氮總量極其可觀，其對于退化土壤的修復具有重要意義。今后，需要進一步加強葛屬植物-根瘤菌共生固氮效率的定量研究以及影響葛屬植物-根瘤菌共生固氮效率的環(huán)境因素的研究，以期為充分發(fā)揮葛屬植物-根瘤菌共生體的固氮作用提供理論依據和科學參考。

4 葛屬植物-根瘤菌共生體的生態(tài)適應性及應用

大量研究表明，與同一豆科植物共生的根瘤菌在不同生態(tài)環(huán)境下存在不同的優(yōu)勢菌種，且不同菌株在生物地理分布、共生匹配性和共生固氮效率方面存在差異，這都是根瘤菌長期適應性分化的結果[9,45-47]。根瘤菌能刺激宿主植物產生誘導系統抗性（Induced systemic resistance）和誘導系統耐受性（Induced systemic tolerance）， 改 變 根 系 結 構（Root system architecture）等，從而提高宿主植物對逆境脅迫的耐受性[48]。葛屬植物作為荒坡上常見的先鋒植物，其與根瘤菌形成的共生體能夠適應多種生態(tài)環(huán)境。前期研究從野葛根瘤中分離出具有較強耐酸能力的根瘤菌，能夠在pH 值=4.6 的強酸環(huán)境中生長，酸脅迫顯著降低葛藤根系活性和根毛變形率，接種根瘤菌后能顯著提高盆栽條件下植株生物量、根瘤鮮重以及植株全氮含量，也能提高根系土壤中微生物數量和土壤酶活 性[49-50]。這表明野葛根瘤菌能在一定程度上協助植物抵抗酸性脅迫，且能影響根際微生物群落，從而提高土壤肥力。另外，葛藤具有一定的富集重金屬Cu 的能力，能在鉛鋅礦廢渣場地上生長，是一種適合重金屬尾礦和工業(yè)污染區(qū)的生態(tài)經濟型建群植物[51-52]。目前，葛屬植物根瘤菌在緩解酸脅迫方面有較好的應用效果，今后可進一步開展葛藤根瘤菌對其他逆境脅迫（如重金屬脅迫）的響應及適應機制的研究。

根際微生物群落在根瘤菌與宿主互作和共生關系形成中發(fā)揮著關鍵作用[53-54]。已有的研究表明，根瘤菌與其他根際細菌存在明顯互作關系，假單胞菌和芽孢桿菌等大豆根際微生物與根瘤中快生、慢生根瘤菌的定殖密切相關[55-57]。因此，在篩選和應用葛屬植物根瘤菌資源時，應充分考慮土著根瘤菌及根際微生物群落與接種根瘤菌之間的相互作用。

5 展 望

目前，學者們對大豆及其他栽培豆科作物的根瘤菌開展了大量的研究和應用，但對與野生豆科植物共生的根瘤菌的研究相對較少，關于根瘤菌耐逆境脅迫的分子遺傳機制知之甚少。葛屬植物作為廣泛分布于我國各地的藤本植物，蘊藏著豐富的根瘤菌資源，加強對葛屬根瘤菌的研究，對于豐富我國根瘤菌種質資源庫、開發(fā)根瘤菌菌劑應用于栽培葛的種植和生產中具有重要意義?；诂F有的研究，提出以下展望。

（1）系統開展葛屬植物根瘤菌資源的調查及分類地位的研究，收集、篩選和保藏一批與葛屬植物共生的根瘤菌資源，尤其應加強栽培葛主產區(qū)根瘤菌資源的篩選。在此基礎上，加強不同生態(tài)區(qū)（地理環(huán)境、土壤類型等因素）葛屬植物-根瘤菌遺傳多樣性以及共生固氮效率的比較研究，明確影響葛屬植物-根瘤菌共生體固氮效率的主要因素，揭示葛屬植物-根瘤菌共生體的生物地理學分布格局及形成機制。

（2）加強葛屬植物-根瘤菌的共生特異性及其與土著根瘤菌競爭作用的研究，并開展葛屬植物-根瘤菌共生體對多種逆境的響應機制和分子遺傳機制的研究。在此基礎上，采用生物技術手段改造或構建優(yōu)良根瘤菌菌株，開發(fā)根瘤菌生物肥料應用于農業(yè)生產。