耐砷真菌與蘆葦聯(lián)合對砷污染土壤修復(fù)作用的研究

楊金紅

(新疆應(yīng)用職業(yè)技術(shù)學(xué)院 園林園藝系，新疆 奎屯 833200)

土壤污染的植物修復(fù)技術(shù)具有成本低、污染少、操作簡單以及不破壞土壤結(jié)構(gòu)等優(yōu)點(diǎn)，近年來受到了人們的廣泛關(guān)注,其主要被應(yīng)用于受重金屬污染物污染的土壤修復(fù)。植物修復(fù)主要依靠污染土壤中重金屬的可利用性進(jìn)行土壤污染修復(fù),然而對于植物來講,重金屬的可利用性經(jīng)常受土壤與金屬絡(luò)合的影響。土壤微生物被公認(rèn)為微生物螯合劑,因其具有活性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),可通過自身或產(chǎn)生代謝產(chǎn)物促進(jìn)植物根系發(fā)育并增加生物量,從而提高植物對不同環(huán)境壓力的耐受力,改變土壤中重金屬形態(tài),增加重金屬的生物可利用性,強(qiáng)化植物的修復(fù)效率[1][2]。因此微生物與植物聯(lián)合修復(fù)具有廣泛的應(yīng)用前景。

土壤砷(As)污染是全球關(guān)注的環(huán)境問題之一,國內(nèi)受As污染的農(nóng)田及場地土壤面積較大。植物修復(fù)是受廣泛關(guān)注的重要方法之一,借用微生物,進(jìn)一步提升修復(fù)植物富集砷的能力是近期國內(nèi)外研究的重點(diǎn)。趙根成等研究發(fā)現(xiàn),施用放線菌PSQ、shf2和細(xì)菌Ts37、C13處理能明顯促進(jìn)蜈蚣草的生長,放線菌PSQ、shf2和細(xì)菌Ts37、C13處理在45 d內(nèi)植物修復(fù)效率為8.9%～11.3%；施用微生物可明顯提高蜈蚣草累積砷的能力[3]。文一等也報(bào)道了鏈霉菌Streptomycessp.具有較強(qiáng)的抗砷毒害能力,能促進(jìn)根際土壤中 As(Ⅴ)還原成As(Ⅲ),大幅度降低根際土壤殘?jiān)鼞B(tài)砷含量,增加砷的生物可利用性,且能促進(jìn)植物對砷的吸收[4]。白建峰等篩選出2株細(xì)菌和2株真菌,這4個(gè)菌種均能顯著增加土壤中非專性和專性吸附態(tài)As的含量,顯著增加土壤中活性態(tài)可遷移性As含量,且都能產(chǎn)生IAA,有利于植物修復(fù)As污染土壤,可被應(yīng)用于微生物-植物聯(lián)合修復(fù)As污染土壤工程[5]。

新疆奎屯墾區(qū)是我國首次發(fā)現(xiàn)的地方砷中毒病區(qū)[6]。據(jù)有關(guān)報(bào)道，奎屯墾區(qū)土壤砷含量平均值為19.3 mg/kg[7]。蘆葦(Phragmitesaustralis)對Pb、Zn、As、Hg具有較好的耐性及富集能力[8，9]。蘆葦對土壤pH值適應(yīng)范圍較廣,對鹽堿土有較強(qiáng)的耐受能力,植株生長迅速且生物量大,因此在重金屬污染區(qū)域的生態(tài)修復(fù)中有著較好的應(yīng)用前景[10]。為了提高蘆葦?shù)男迯?fù)效率,筆者將耐砷真菌接種到蘆葦根際,研究了耐砷真菌聯(lián)合蘆葦對土壤砷的吸收累積效果,分析了土壤中砷的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)規(guī)律,以期為微生物聯(lián)合植物修復(fù)土壤中的砷污染提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 供試盆栽土 土壤取自新疆應(yīng)用職業(yè)技術(shù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)基地。將所取土壤去除雜物并風(fēng)干,用孔徑為2 mm的尼龍篩過篩,再用4%福爾馬林熏蒸消毒,放置兩周后待用。土壤類型為鹽化潮土,全氮含量為0.56 g/kg,全磷含量為0.68 g/kg,全鉀含量為19 g/kg,有機(jī)質(zhì)含量為10.5 g/kg,砷含量為21.35 mg/kg, pH 8.3。

1.1.2 供試蘆葦 從新疆奎屯墾區(qū)無砷污染土壤中取野生蘆葦,將較大植株分成長勢及大小基本一致的帶根的植物體；剪除地上部分莖葉,將這些帶根的植物體分別栽種在口徑為18 cm的小盆缽(裝有機(jī)土1 kg)中,每盆4株,澆水保持盆土濕潤,在生長箱(25 ℃，每天光照16 h)中育苗2周。

1.1.3 供試菌株及菌液的制備 從新疆奎屯墾區(qū)123團(tuán)附近采集土壤及植物樣品,采用富集培養(yǎng)的方法進(jìn)行菌株的分離,得到4株耐砷真菌,將這些菌株保存在新疆應(yīng)用職業(yè)技術(shù)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室。供試菌株為：KT-1，屬于青霉屬Penicillium(菌種特征:培養(yǎng)3 d時(shí)菌落直徑33 mm,菌落圓形,黃綠色,邊緣顏色變淺；分生孢子梗短,頂端膨大,分生孢子近球形。)；KT-2，屬于青霉屬Penicillium(菌種特征:培養(yǎng)3 d時(shí)菌落直徑15 mm,菌落邊緣白色,中央藍(lán)綠色,有較多的淡黃色滲出液；分生孢子梗光滑,分生孢子橢圓形。)；KT-3，屬于木霉屬Trichoderm(菌種特征:培養(yǎng)3 d時(shí)菌落直徑90 mm；菌絲絮狀,初期白色,逐漸形成密實(shí)產(chǎn)孢叢束,排成同心輪紋,深綠色；厚垣孢子球形，多生于基底菌絲中,分生孢子多球形。)；KT-5，屬于芽枝霉屬Ladosporium(菌種特征:培養(yǎng)3 d時(shí)菌落直徑10 mm,菌落圓形,褐綠色,絨狀,中央有堅(jiān)硬凸起,菌落背面藍(lán)黑色；分生孢子暗色,橢圓形。)[11]。以上菌株分別簡稱為K1、K2、K3、K5。取4種菌株各1株,接種在PDA的液體培養(yǎng)基上[12],在25 ℃搖瓶中培養(yǎng)6 d。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

砷以As2O3的形式加入,在前期實(shí)驗(yàn)中,設(shè)置6個(gè)土壤砷濃度處理,當(dāng)土壤砷濃度為50 mg/kg時(shí),蘆葦?shù)母甚r重在各濃度處理中最大[13],故本次實(shí)驗(yàn)設(shè)置土壤砷含量為50 mg/kg；將添加外源砷的土壤裝入直徑20 cm、高18 cm的小盆缽(裝有機(jī)土2 kg)中,加水使土壤含水量飽和并充分混勻,平衡2周待用。

盆栽實(shí)驗(yàn)共設(shè)6個(gè)處理,分別是不添加菌且無植物的空白對照組(CK)、不添加菌但種植蘆葦?shù)闹参飳φ战M(CK+P)、K1菌液且種植蘆葦?shù)奶幚斫M(K1)、K2菌液且種植蘆葦?shù)奶幚斫M(K2)、K3菌液且種植蘆葦?shù)奶幚斫M(K3)、K5菌液且種植蘆葦?shù)奶幚斫M(K5)；每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。選取長勢一致的蘆葦苗移栽至裝好土且添加外源砷50 mg/kg的塑料盆中,移栽14 d確保存活后,在CK、CK+P對照組中施入30 mL無菌的真菌培養(yǎng)液,在K1、K2、K3和K5處理組中各施入30 mL活性菌液。在生長90 d后收獲蘆葦及盆內(nèi)土壤,晃動(dòng)蘆葦根部,使不粘附根的土壤掉落,作為非根際土；用軟毛刷刷下粘附在根際的土壤，作為根際土。

1.3 測定方法

蘆葦植株培養(yǎng)90 d后從盆中移除,將蘆葦全株用自來水洗凈,并用吸水紙吸干水分,將蘆葦全株分為地上部分和地下部分,將地上、地下部分分別放入烘箱,在105 ℃下殺青30 min,再在70 ℃條件下烘干8 h至恒重,分別稱量地上、地下部分干重。

將土壤樣品自然風(fēng)干,將較大塊土壤用木棍碾磨,再用研缽研碎,過100目篩。將植株葉、根、地上莖、地下莖樣品，以及非根際土壤、根際土壤樣品均送至譜尼測試集團(tuán)北京實(shí)驗(yàn)室，進(jìn)行總砷含量的檢測,采用的測定方法參照GB/T 5009和GB/T 515618。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Excel和Spss 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)及作圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐砷真菌對蘆葦干重的影響

在添加外源砷50 mg/kg的條件下,土壤接種耐砷真菌后,與對照(CK+P)相比,添加微生物處理的蘆葦?shù)厣喜考暗叵虏糠指芍鼐兴岣?圖1)。接種K2的蘆葦?shù)厣喜糠值母芍赜酗@著增加(P<0.05),為13.0 g,比對照CK+P(9.19 g)增加了3.81 g;接種K3的蘆葦?shù)叵虏糠值母芍赜酗@著增加(P<0.05),為12.2 g,比對照CK+P(8.54 g)增加了3.66 g。

同一指標(biāo)不同字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。圖1 耐砷真菌對蘆葦?shù)厣稀⒌叵虏扛芍氐挠绊?/p>

2.2 耐砷真菌對蘆葦吸收與分配砷的影響

表1顯示：在接種K1、K2、K3和K5菌株后,蘆葦?shù)厣锨o、地下莖及根的砷含量均高于不接種耐砷真菌的對照組(CK+P)；特別是接種K3的實(shí)驗(yàn)組的植株地下莖吸收砷量顯著提高,其地下莖的砷含量(6.18 mg/kg)比對照CK+P(3.65 mg/kg)提高了69.3%,差異達(dá)到了顯著水平(P<0.05)；接種K1、K2和K5的蘆葦?shù)叵虑o的砷含量分別為4.20、5.40、3.70 mg/kg(對照為3.65 mg/kg);接種K1、K2、K3和K5的蘆葦?shù)厣锨o的砷含量分別為2.83、3.05、4.98、2.66 mg/kg(對照為2.38 mg/kg);接種K1、K2、K3和K5的蘆葦根的砷含量分別為16.60、22.60、23.50、10.60 mg/kg(對照為10.40 mg/kg)。說明耐砷真菌對蘆葦吸收土壤砷有較強(qiáng)的強(qiáng)化作用,可有效提高蘆葦對砷的富集能力,其中菌株K3被添加到蘆葦?shù)叵虏糠謺r(shí),其強(qiáng)化作用更加顯著。

表1 耐砷真菌對蘆葦各部位砷含量的影響 mg/kg

2.3 耐砷真菌聯(lián)合蘆葦對土壤砷吸收的影響

在接種K1、K2、K3和K5后,根際土和非根際土壤中的砷含量如表2所示,空白對照CK的土壤砷含量為(69.7±5.19)mg/kg；施用耐砷真菌聯(lián)合蘆葦修復(fù)含砷土壤,非根際土中的砷含量大于根際土的砷含量；對照CK+P根際土和非根際土的砷含量均高于施菌聯(lián)合蘆葦處理的土壤砷含量。其中接種K2和K3菌株的非根際土壤砷含量與對照CK+P相比差異顯著(P<0.05),接種K2和K3的蘆葦非根際土的砷含量分別為52.9和52.6 mg/kg,較對照CK+P(68.2 mg/kg)分別降低了22.5%和22.9%;接種K2菌株的蘆葦根際土壤砷含量與對照CK+P相比差異顯著(P<0.05),接種K2的蘆葦根際土砷含量為38.1 mg/kg,較對照CK+P(57.7 mg/kg)下降了33.9%。

表2 不同處理土壤中的砷含量、土壤砷去除效率及富集系數(shù)

微生物聯(lián)合蘆葦修復(fù)90 d后,土壤中砷的去除效率如表2所示,接種耐砷真菌的根際土和非根際土中砷去除效率均比對照CK+P高,對照CK+P對非根際土中砷的去除效率為2.20%,接種K1、K2、K3和K5的蘆葦非根際土的砷去除效率較CK+P分別提高了7.90、22.01、22.40、1.24個(gè)百分點(diǎn)；對照CK+P對根際土中砷的去除效率為17.30%,接種K1、K2、K3和K5的蘆葦根際土的砷去除效率分別較CK+P提高了10.20、28.00、21.90、12.30個(gè)百分點(diǎn)。說明接種耐砷真菌聯(lián)合蘆葦可以提高土壤砷的去除效率,其中接種菌株K2、K3的非根際及根際總砷的去除效果最好。

微生物聯(lián)合蘆葦修復(fù)90 d后,接種K1、K2和K3的蘆葦?shù)纳楦患禂?shù)(根砷含量/土壤砷含量)均高于同期CK+P的,其中K3處理的砷富集系數(shù)最大，達(dá)0.34,為CK+P的2.27倍；K2處理的砷富集系數(shù)次之，為0.32,為CK+P的2.13倍。

3 討論

由于植物根系分泌物的作用,植物根系含有較多的碳水化合物、氨基酸、生長因子等物質(zhì),可以使其成為微生物旺盛生長的區(qū)域；當(dāng)用植物修復(fù)重金屬污染土壤時(shí),微生物也會(huì)發(fā)揮重要的作用,因此植物根系微生物對植物生長、吸收重金屬及轉(zhuǎn)運(yùn)影響很大。在前期實(shí)驗(yàn)中,我們發(fā)現(xiàn)蘆葦具有較好的耐砷性能,且生長快,適應(yīng)性強(qiáng),但對砷的積累富集能力較低[14]。在本實(shí)驗(yàn)中，接種K2的蘆葦?shù)厣喜糠指芍赜酗@著增加,比對照CK+P增加了3.81 g;接種K3的蘆葦?shù)叵虏糠指芍匾灿酗@著增加,比對照增加了3.66 g,表明耐砷真菌K2、K3可以明顯提高蘆葦?shù)纳锪俊Ｓ醒芯空J(rèn)為微生物在旺盛的生命活動(dòng)代謝過程中,可以分泌出大量的次生代謝產(chǎn)物,分泌的植物激素如細(xì)胞分裂素、赤霉素等可以促進(jìn)植物根系的生長[15]；微生物的活動(dòng)可增加植物生物量,提高植物對不同環(huán)境壓力的耐受力[16]。有關(guān)資料顯示，在植物修復(fù)中,植物生物量的高低對土壤修復(fù)速率及效果也有顯著影響,朱崗輝研究發(fā)現(xiàn)微生物菌劑能顯著提高蜈蚣草的修復(fù)效率,施加菌劑后蜈蚣草地上部生物量提高了16.8%，蜈蚣草地上部砷吸收量比對照提高了41.1%[17]；陳蘇等研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)土壤中污染物種類和含量相同時(shí),加入土霉素降解菌有利于提高紫茉莉和孔雀草的生物量,并可促進(jìn)紫茉莉和孔雀草各部位對鎘的富集并提高其富集系數(shù)[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，通過添加耐砷真菌聯(lián)合蘆葦修復(fù)砷污染土壤,耐砷真菌可提高蘆葦?shù)纳锪?，進(jìn)而提高修復(fù)效果。

多數(shù)研究表明微生物聯(lián)合植物修復(fù)重金屬污染土壤,可有效提高植物吸收轉(zhuǎn)運(yùn)重金屬的能力,提高修復(fù)效率。靳治國[19]研究發(fā)現(xiàn),在復(fù)合污染土壤中,添加淡紫擬青霉菌和綠色木霉菌混合菌液不僅能促進(jìn)龍葵生長,還能提高龍葵對Cd和Pb的富集能力。王立等[20]研究發(fā)現(xiàn),在Cd污染土壤中接種叢枝菌根真菌,有助于提高水稻對Cd的耐受性。李世陽[21]在實(shí)驗(yàn)室對蘆葦接種菌根進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)雖然不同接種時(shí)間和不同接種量對蘆葦?shù)那秩韭视绊懖淮?但是侵染率均較天然狀態(tài)顯著提高,平均侵染率均高于70%,而且生物量也明顯高于空白對照。盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明，有侵染的盆栽對高錳酸鹽的凈化效果高于無侵染盆栽,菌根真菌植物復(fù)合系統(tǒng)應(yīng)用于生態(tài)修復(fù)技術(shù)是完全可行的。李丹[22]研究發(fā)現(xiàn)添加了微生物后蘆葦對Cd、Pb的積累量有所提高,說明微生物能夠促進(jìn)蘆葦對Cd、Pb的富集。本研究結(jié)果顯示：在接種耐砷真菌后,蘆葦?shù)厣锨o、地下莖及根的砷含量均高于不施用耐砷真菌的對照組CK+P；接種K3的地上莖、地下莖吸收砷量均較對照CK+P顯著提高;根際土中的砷含量小于非根際土的砷含量,根際土和非根際土中的砷含量均小于對照CK+P中的含量；接種K2和K3菌株的根際及非根際土壤的砷含量與對照CK+P相比差異顯著。說明耐砷真菌對蘆葦吸收土壤中砷有較強(qiáng)的強(qiáng)化作用,能有效提高植株對砷的富集能力,其中菌株K2和K3的強(qiáng)化作用更加明顯。微生物能促進(jìn)植物吸收及運(yùn)轉(zhuǎn)土壤砷的可能原因有：一是微生物能促進(jìn)植物對土壤中營養(yǎng)元素與重金屬的吸收[23]；二是微生物通過分泌生長調(diào)節(jié)劑和保護(hù)植物的抗生素、抑菌劑和螯合劑等方式增強(qiáng)了植物對污染環(huán)境的適應(yīng)能力[24],從而提升了植物修復(fù)砷的能力。

微生物主要通過促進(jìn)植物在重金屬脅迫環(huán)境下的營養(yǎng)吸收及生長、增強(qiáng)植物抗逆性及提高植物根部重金屬含量的方式提高植物的修復(fù)能力,促進(jìn)植物提取或固定土壤中的重金屬,從而起到強(qiáng)化植物修復(fù)的作用。本研究發(fā)現(xiàn)耐砷真菌和蘆葦聯(lián)合可提高As污染土壤的修復(fù)效率,因此采用農(nóng)藝強(qiáng)化措施提高耐砷菌與蘆葦聯(lián)合對As污染土壤的修復(fù)效率是進(jìn)一步深入研究的重點(diǎn)。