基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討粉防己堿抗腫瘤的潛在作用機制

劉 偉，張彥忠，白素平，房立真

0 引言

粉防己堿(Tetrandrine，Tet)是從防己科植物粉防己(Stephania tetrandra SMoore)根中提取的一種生物堿，又名漢防己甲素，是粉防己的主要活性成分，其口服或注射劑型在臨床上廣泛用于風(fēng)濕痛、關(guān)節(jié)痛、神經(jīng)痛及硅肺等相關(guān)疾病的治療?，F(xiàn)代藥理研究表明，粉防己堿(圖1)具有消炎、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗多藥耐藥等活性[1]。越來越多的研究顯示，Tet具有較好的抗腫瘤活性[2]，但由于中藥成分的多樣性和作用機制的多靶點、多通路的特點，Tet的抗腫瘤作用機制的實驗研究仍面臨著諸多挑戰(zhàn)，因此，借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對其作用機制進行系統(tǒng)性研究具有重要意義。

圖1 粉防己堿化學(xué)結(jié)構(gòu)

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是在數(shù)據(jù)庫檢索、高通量組學(xué)數(shù)據(jù)分析和計算機模擬等手段基礎(chǔ)上，通過多層次網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析，從而系統(tǒng)地研究藥物、靶點、疾病之間的相互作用，闡明藥物的作用機制，是一門提高藥物發(fā)現(xiàn)效率的新興學(xué)科[3-4]。因此,本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和反向分子對接分析方法，以Tet為研究對象，通過建立“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)，全面系統(tǒng)地預(yù)測和發(fā)現(xiàn)作用靶點，以闡釋其抗腫瘤作用機制，為深入揭示Tet的藥理作用提供支持。

1 材料與方法

1.1 反向分子對接及抗腫瘤相關(guān)靶點的篩選 登錄PubChem服務(wù)器，查詢并下載Tet的3D分子結(jié)構(gòu)式，儲存為*.sdf格式。然后將Tet.sdf文件上傳PharmMapper數(shù)據(jù)庫[5]進行模擬分子-靶蛋白對接，進一步通過UniProt數(shù)據(jù)庫將靶點的Uniprot ID轉(zhuǎn)換為Gene Symbol。利用GeneCards數(shù)據(jù)庫以“anticancer或antitumor”為關(guān)鍵詞，收集與抗腫瘤相關(guān)的基因，將挖掘得到的抗腫瘤相關(guān)基因與藥物靶點基因映射篩選出共同基因，從而得到Tet抗腫瘤作用靶點。

1.2 化合物-抗腫瘤靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將篩選得到的抗腫瘤靶點蛋白在STRING 11.0平臺[6]構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI)，設(shè)置物種為人、最低相互作用評分>0.4，獲取靶點蛋白相互作用關(guān)系，再運用Cytoscape 3.7.0軟件[7]進行繪圖，并對網(wǎng)絡(luò)進行分析，設(shè)置結(jié)點顏色和大小以反映degree的大小，獲得最終的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。

1.3 分子對接驗證 根據(jù)其PPI網(wǎng)絡(luò)中拓?fù)鋮?shù)(度數(shù)和接近中心度)進行分析，篩選出核心靶點，將其輸入Systems Dock Web Site(Version 2.0)[8]與Tet進行分子對接驗證，通過Docking Score評價Tet與靶點間的結(jié)合活性。

1.4 生物功能與通路富集分析 KOBAS是用于基因/蛋白質(zhì)功能注釋和功能集富集的Web服務(wù)器[9]。將Tet的抗腫瘤靶點基因Gene Symbol轉(zhuǎn)換成ensembl格式的ID，導(dǎo)入KOBAS 3.0分析平臺，獲取靶點的生物學(xué)注釋數(shù)據(jù)，并利用Omicshare平臺將得到的生物過程結(jié)果制作成氣泡圖。

2 結(jié)果

2.1 抗腫瘤靶點預(yù)測 Z′-score較Fit Score具有更好的統(tǒng)計學(xué)意義和置信區(qū)間，且Z′-score得分越高說明結(jié)合越好[5]，因此，選取Z′-score>0.5為潛在靶點，從PharmMapper分子-靶蛋白對接結(jié)果中篩選出103個靶蛋白，通過UniProt數(shù)據(jù)庫將PBD ID轉(zhuǎn)換為Gene Symbol，核對靶蛋白內(nèi)容選擇基因，剔除重復(fù)基因，結(jié)果共得到102個靶基因。再與Gene Cards數(shù)據(jù)庫挖掘得到5 858個抗腫瘤相關(guān)基因進行比對，得到86個Tet抗腫瘤的潛在作用靶點及其在Gene Cards數(shù)據(jù)庫中的腫瘤相關(guān)性評分，見表1。

2.2 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 把篩選得到與Tet相關(guān)的86個抗腫瘤靶蛋白基因，通過STRING數(shù)據(jù)庫獲得靶點蛋白相互作用關(guān)系，并利用Cytoscape軟件進行可視化處理(圖2)和Network analyzer[10]分析。在圖中，節(jié)點表示蛋白和化合物，邊表示蛋白之間的關(guān)聯(lián)，其大小反映了靶點蛋白degree的值，節(jié)點越大表示該靶點蛋白的degree值越大，表明該節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中越重要。網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)分析顯示，該共表達網(wǎng)絡(luò)聚類相關(guān)系數(shù)為0.618，網(wǎng)絡(luò)節(jié)點數(shù)為83，平均相鄰節(jié)點數(shù)量為11.373，表明Tet抗腫瘤作用具有多靶點屬性，且靶蛋白之間具有強烈的相關(guān)性。

2.3 分子對接分析 根據(jù)上述Network analyzer分析結(jié)果，選擇靶點中每個靶點的度拓?fù)鋮?shù)值大于中位數(shù)(degree=9)的2倍作為篩選核心靶點的條件[11]，將其Gene Symbol或PDB ID導(dǎo)入Systems Dock Web Site服務(wù)器中，與Tet.sdf格式的3D結(jié)構(gòu)進行對接，進一步確認(rèn)這11個靶點與Tet的結(jié)合活性，見表2。一般認(rèn)為，docking score>7.0表明藥物分子與靶點具有強烈的結(jié)合活性，>5.0表明藥物分子與靶點具有較好的結(jié)合活性，>4.25表明藥物分子與靶點具有一定的結(jié)合活性。結(jié)果表明，Tet的11個核心靶點的docking score>5.0的靶點有8個，表明Tet與ESR1、NOS3、PPARG、ALB、NR3C1、MDM2、LCK、IGF1具有較好的結(jié)合活性；Tet與MAPK14、細胞凋亡蛋白酶3(CASP3)具有一定的結(jié)合活性；同時，從表1也可發(fā)現(xiàn)，11個核心靶點具有很好的抗腫瘤相關(guān)性，從而進一步驗證了PharmMapper預(yù)測靶點的可靠性。

表1 粉防己堿抗腫瘤靶點篩選結(jié)果

表2 粉防己堿核心抗腫瘤靶點分子對接結(jié)果

2.4 靶蛋白-通路網(wǎng)絡(luò)特征分析 代謝通路富集分析可以將相似生物學(xué)功能靶點聚集形成功能模塊，形成生物學(xué)功能模塊。為進一步闡明Tet的抗腫瘤作用，將預(yù)測出的86個抗腫瘤靶點通過KOBAS 3.0進行GO富集和KEGG通路注釋分析，利用Omicshare平臺進行作圖。GO富集分析包括3個分支，即生物過程(Biological process)、分子功能(Molecular function)和細胞組分(Cellular component)，見圖3。其中在生物過程cellular process、metabolic process、single-organism process、response to stimulus、response to regulation靶點富集較集中；在細胞組分中與cell和cell part相關(guān)性最大；在分子功能中binding和catalytic activity靶點相對集中富集。通過KEGG生物途徑富集分析，識別Tet顯著影響的生物途徑，其中P<0.05生物通路共有134條，P值最小的前20個的生物途徑見圖4，節(jié)點的顏色與大小由相關(guān)聯(lián)基因的數(shù)量和P決定，顏色從綠色到紅色反映了P值從大到小，節(jié)點從大到小反映了相關(guān)聯(lián)基因的數(shù)量從多到少。結(jié)果表明，Tet的抗腫瘤活性機制主要涉及腫瘤通路(Pathways in cancer)、PI3K-Akt信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)、代謝通路(Metabolic pathways)、胰島素抵抗(Insulin resistance)、蛋白聚糖腫瘤通路(Proteoglycans in cancer)等信號通路，從而也體現(xiàn)了Tet多途徑的作用特點。

圖3 粉防己堿抗腫瘤靶蛋白的GO富集分析

圖4 粉防己堿KEGG 通路富集分析

3 討論

本文運用反向分子對接[12]和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對Tet抗腫瘤作用的潛在靶點和可能作用的機制進行了預(yù)測，結(jié)果顯示，Tet可通過多靶點、多通路發(fā)揮抗腫瘤作用，與中藥作用成分多靶點、多途徑的特性相符。

3.1 Tetrandrine抗腫瘤相關(guān)靶基因的研究 對富集的抗腫瘤靶基因進一步分子對接驗證分析可知，Tet主要作用于ESR1、NOS3、PPARG、ALB、NR3C1、MDM2、LCK、IGF1等靶蛋白基因，通過共表達網(wǎng)絡(luò)可以看出，相關(guān)靶基因具有一定相關(guān)性，進而說明Tet具有多靶點抗腫瘤的潛在活性。

絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路主要包括細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(Extracellular signal-regulated kinase,ERK1/2)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)、p38 MAPK及BMK1(Big MAP kinase 1)通路。MAPK14，亦稱為p38-α，是MAPK信號傳導(dǎo)通路中的重要的信號分子，研究發(fā)現(xiàn)，Tet可通過激活p38 MAPK信號誘導(dǎo)結(jié)腸癌CT-26細胞凋亡，亦可通過抑制ERK磷酸化來增強對A549肺癌細胞的凋亡作用[13-14]。Cui等[15]研究發(fā)現(xiàn)，Tet可通過下調(diào)細胞凋亡調(diào)節(jié)器(B2CL1 /BCL2)和激活CASP3發(fā)揮抗喉癌干細胞的作用，此抗腫瘤通路也被證實在結(jié)腸癌HT-29細胞中[16]，并進行了系統(tǒng)藥理學(xué)的驗證。WU等[17]研究報道，Tet可通過介導(dǎo)下調(diào)人胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白5(IGFBP-5)的表達，進而使Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)失活發(fā)揮抗結(jié)腸癌細胞的作用，但Tet是否具體作用于IGF1靶點需要進一步驗證。Jang[18]研究發(fā)現(xiàn)，Tet可通過降低PPARG的表達或磷酸化達到抑制3T3-L1前脂肪細胞脂肪生成的作用，亦可通過降低脂多糖誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細胞中NOS的mRNA表達水平抑制其活化[19]，但是Tet對PPARG和NOS3在腫瘤通路中的研究未見報道。

ESR1是一種雌激素依賴的轉(zhuǎn)錄因子，屬于核受體超家族的成員，能夠通過與雌激素結(jié)合并轉(zhuǎn)移至乳腺癌細胞核中，參與調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄信號通路，進而促進乳腺癌細胞的增殖。目前臨床上許多抗癌藥物(如來曲唑、依西美坦、他莫昔芬等)的作用機制就是利用和控制這個節(jié)點，干擾或阻滯雌激素與雌激素受體的結(jié)合，對乳腺癌進行治療[20-21]。Tet對ESR1靶蛋白的作用，目前尚未見報道。ALB作為血液系統(tǒng)的重要組分，是親水性的蛋白，可滲入腫瘤組織，卻不能進入正常組織，它的這種高的通透性和滯留性被作為抗癌藥物載體已有大量研究報道[22-23]。在腫瘤細胞中，腫瘤內(nèi)皮表達的GP60受體蛋白對ALB有高度的親和力，GP60參與ALB和相關(guān)大分子藥物復(fù)合物的吸收和分布[24]。Tet雖然具有非常好的生物活性，但是它是親脂性的，基于PPI網(wǎng)絡(luò)分析，ALB可作為Tet的藥物載體，為深入研究Tet抗腫瘤作用提供了一個很好的思路。NR3C1為細胞核糖皮質(zhì)激素受體，是一種配體依賴性核轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，糖皮質(zhì)激素的生物學(xué)效應(yīng)主要是通過NR3C1 介導(dǎo)，涉及細胞的增殖、分化、凋亡、代謝、遷移及免疫調(diào)節(jié)等多個方面，對多種類型腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有重要的調(diào)節(jié)作用[25]。Tet對NR3C1靶蛋白的作用，目前尚未見報道。MDM2 是一種 E3 泛素連接酶，可以使 p53 泛素化并被蛋白酶體降解，MDM2在多種腫瘤細胞中過度表達，不僅能抑制p53的活性，還會導(dǎo)致p53基因突變。近年來小分子MDM2抑制劑(如Idasanutlin、NVP-CGM097和APG-115等)已有多個化合物進入不同階段的臨床研究[26]。因此，阻斷MDM2的功能，促使腫瘤細胞凋亡，可作為Tet一個新的抗腫瘤的潛在靶點進行研究。LCK是一種在T細胞和自然殺傷細胞中表達的Src家族的細胞質(zhì)酪氨酸激酶，其對T細胞的發(fā)育、激活和T細胞抗原受體的信號通路都起著重要作用。LCK激酶在細胞中的異位表達可以誘發(fā)細胞發(fā)生癌變，因此直接選擇性抑制LCK可以為T細胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病、炎癥性疾病、白血病和實體腫瘤等提供良好的治療[27]。Tet對Lck靶蛋白的作用，目前尚未見報道。

3.2 Tetrandrine相關(guān)生物過程和信號通路的研究 腫瘤是一個復(fù)雜的過程，涉及到多基因與信號通路。GO生物過程富集分析，發(fā)現(xiàn)這些靶點主要富集在細胞過程、代謝過程、刺激應(yīng)答、催化活性和細胞周期的調(diào)控等生物過程，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。結(jié)合KEGG基因富集數(shù)目和富集因子(圖4)可以得知，腫瘤通路、PI3K-Akt信號通路、代謝通路、胰島素抵抗、蛋白聚糖腫瘤通路等信號通路等是Tet發(fā)揮抗腫瘤活性的主要通路。Xu等[28]報道，Tet可通過caspase級聯(lián)調(diào)控、細胞周期阻滯、激活MAPK和抑制PI3K/Akt/mTOR信號途徑來誘導(dǎo)糖皮質(zhì)激素抵抗的人白血病Jurkat T細胞凋亡。Tet通過靶向RAS信號通路的不同效應(yīng)分子在體內(nèi)外抑制結(jié)腸癌、乳腺癌、膠質(zhì)瘤和肺癌的生長[2]。Liu等[29]研究發(fā)現(xiàn)，Tet通過激活caspase級聯(lián)和抑制PI3K/Akt信號通路，對前列腺癌DU145和PC-3細胞的增殖、遷移和侵襲有較強的抑制作用。武建毅等[30]研究發(fā)現(xiàn)，Tet可抑制Akt和NF-κB信號通路誘導(dǎo)人乳腺癌MCF-7細胞的凋亡，此通路的抑制也可明顯誘導(dǎo)肺癌細胞A549的凋亡[31]?？傊?，雖有一些通路未被實驗證實，但大量研究[2,32]仍提示Tet在腫瘤治療中有很好的應(yīng)用前景。

綜上所述，這些靶基因參與了多種腫瘤通路，對于判斷腫瘤發(fā)展過程和治療效果預(yù)測，降低復(fù)發(fā)率和死亡率，延長生存期都具有重要意義，如在甲狀腺癌患者中ESR1的高表達提示有不良的總生存周期[33]；IGF-IR表達陰性的結(jié)直腸癌患者的累積生存率和平均生存時間均顯著高于IGF-IR表達陽性的結(jié)直腸癌患者[34]。因此，本文通過反向?qū)拥姆椒▽et抗腫瘤的潛在的人源靶蛋白進行了虛擬篩選研究，并進一步探討了潛在靶蛋白的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)及其KEGG通路研究，結(jié)果顯示所得預(yù)測的部分潛在抗腫瘤靶點和通路已有相關(guān)文獻報道，在一定程度上確證了本研究有關(guān)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測的準(zhǔn)確性，預(yù)測的一些新靶標(biāo)和通路為進一步的實驗研究指引了新方向，也為以Tet為基礎(chǔ)的創(chuàng)新抗腫瘤藥物研制奠定了基礎(chǔ)。