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    microRNA-22-3p低表達上調(diào)幼年哮喘氣道重塑大鼠的NK1R表達*

    2021-01-28 06:15:44宋建剛高永偉劉慶賈鯤鵬龐隨軍李元霞
    西部醫(yī)學 2021年1期
    關(guān)鍵詞:熒光素酶平滑肌氣道

    宋建剛 高永偉 劉慶 賈鯤鵬 龐隨軍 李元霞

    (延安大學附屬醫(yī)院兒科,陜西 延安 716000)

    哮喘是一種慢性炎癥性氣道疾病,其特征在于可逆性氣流阻塞和氣道高反應(yīng)性[1]。炎癥細胞釋放的炎癥介質(zhì)引起持續(xù)的氣道慢性炎癥,從而在哮喘過程中觸發(fā)支氣管收縮和氣道結(jié)構(gòu)變化[2],后者最初是作為響應(yīng)炎癥引起的氣道壁損傷而啟動的修復(fù)過程,然而,這種修復(fù)過程的失調(diào)導(dǎo)致氣道重塑[3]。近年來我國小兒哮喘的患病率顯著增加,為個人、家庭、社會均帶來了巨大的負擔[4-5]。因此,研究新的哮喘診斷和預(yù)后靶點以及開發(fā)新的治療策略以逆轉(zhuǎn)氣道重塑至關(guān)重要。

    MicroRNA(微小RNA,miRNA)是轉(zhuǎn)錄后基因表達調(diào)節(jié)劑的一大家族,其長度約為21個核苷酸,可控制真核生物中的許多細胞和發(fā)育過程[6]。新的研究表明,多種miRNA的表達水平與哮喘和氣道炎癥有關(guān),包括miR-21、miR-223和miR-142-3p[7]。miR-22是多種細胞增殖和炎癥反應(yīng)的抑制因子。研究[8]表明,miR-22可以抑制RASF滑膜成纖維細胞增殖和促炎細胞因子的產(chǎn)生。大量研究發(fā)現(xiàn),miR-22前提的3p臂成熟體miR-22-3p可抑制肝癌[9]、結(jié)腸癌[10]、胃癌細胞的增殖[11]。研究表明miR-22-3p能夠調(diào)節(jié)乳腺癌細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移,該過程是通過負調(diào)節(jié)神經(jīng)激肽受體1(neurokinin receptor 1,NK1R)發(fā)揮作用[12]。研究表明,感覺神經(jīng)肽NK1R與小兒哮喘的發(fā)作及緩解關(guān)系極為密切[13],例如豚鼠哮喘模型急性期的支氣管中NK1R的表達增多,而且在藥物作用下可以抑制哮喘大鼠模型中的NK1R表達[14-15]。但其在哮喘氣道重塑中是否受到miRNA調(diào)節(jié)仍不明確。因此,本研究探討miR-22-3p在幼年哮喘大鼠氣道重塑過程中是否靶向調(diào)節(jié)NK1R,為確定新的幼小兒哮喘預(yù)后和治療靶標提供前期基礎(chǔ)。

    1 材料和方法

    1.1 實驗試劑 OVA購買于上海生工生物技術(shù)有限公司(貨號:A003056-0100);氫氧化鋁購買于北京Solarbio科學技術(shù)公司(貨號:A7130);TRIzol試劑盒購買于美國的英杰公司(貨號:15596018);大鼠氣道平滑肌細胞(Rat airway smooth muscle cells,RASMCs)購買于美國培養(yǎng)物保藏中心(貨號:#AC340472);TIANamp基因組DNA試劑盒購于北京天根生物技術(shù)公司(貨號:DP348);熒光素酶報告基因測定試劑盒購買于美國普洛麥格公司(貨號:E1310);NK1R,β-actin的抗體和第二抗體均購于美國Abcam公司(貨號:ab183713,ab115777)。

    1.2 動物分組 48只體重62 ~79 g的5周齡的無特定病原體(SPF)等級幼年雌性Wistar大鼠(延安大學醫(yī)學院動物研究中心提供),飼養(yǎng)、飲水、光照和溫度均保持在恒定水平,所有動物均在SPF條件下飼養(yǎng)。設(shè)施中的環(huán)境條件符合“實驗動物對環(huán)境和住房設(shè)施的要求(GB14925-2001)”中有關(guān)實驗動物隔離設(shè)施的相關(guān)準則。隨機分為對照組、模型組、模型+mimic組、模型+mimic-NC組、模型+inhibitor組、模型+inhibitor-NC組,每組各8只。

    1.3 動物模型構(gòu)建和治療 大鼠接受適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。適應(yīng)后第1 d開始,給大鼠1 mL誘導(dǎo)劑(包含100 mg卵白蛋白和200 mg 氫氧化鋁,腹腔注射)。15 d開始暴露。將大鼠置于一個特殊的密閉玻璃容器中(20 cm×20 cm×20 cm),將含有1%中的OVA的50 mL 生理鹽水注入進行霧化激發(fā),將大鼠每周3次暴露于這種治療30 min,連續(xù)8周。對照組僅接受生理鹽水注射。在暴露期后24 h內(nèi)處死大鼠[16]。另外,模型+mimic組、模型+mimic-NC組、模型+inhibitor組、模型+inhibitor-NC組對大鼠的處理為大鼠每次激發(fā)前1 h內(nèi)分別尾靜脈注射1 mL的mimic、mimic-NC、inhibitor、inhibitor-NC,濃度均為(10 μg/mL)[17-18]。分離氣管、支氣管和肺組織,結(jié)扎后取出右中肺。將肺標本保存在4%多聚甲醛中,隨后進行常規(guī)石蠟包埋,切片和蘇木精-伊紅(H&E)染色。在顯微鏡下評估氣道病理。

    1.4 病理圖像分析 用顯微鏡對完整的肺橫截面成像,并使用Leica Application Suite V4.3圖像分析軟件測量肺壁的內(nèi)周(Pi)、面積(WA)和外周(Pe),支氣管平滑肌面積(S)和支氣管平滑肌細胞核數(shù)(N)。使用Pi和S對這三個測量值進行歸一化,并表示為WA/Pi2、S/Pi2和N/S。

    1.5 定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR) 使用TRIzol一步法從RASMCs細胞和氣道組織中提取總RNA。用少量液氮將組織研磨成均勻的粉末,隨后加入Trizol試劑提取RNA。將焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的超純水加到混合物中以溶解RNA。使用ND-1000紫外可見分光光度計測量260 nm和280 nm的光密度(OD)。測定總RNA的質(zhì)量,并相調(diào)節(jié)RNA濃度。采用兩步法對提取的RNA進行反轉(zhuǎn)錄。使用以下反應(yīng)條件:70 ℃ 10 min,冰浴2 min,42 ℃ 60 min和70 ℃10 min。將反轉(zhuǎn)錄的cDNA暫時置于-80 ℃。RT-qPCR使用TaqMan探針法進行。反應(yīng)條件如下:在95 ℃下預(yù)變性30 s的一個循環(huán),隨后在95 ℃下進行40個循環(huán)的10 s變性,在60 ℃下退火10 s。并在70 ℃下延伸10 s。U6用于miR-22-3p的內(nèi)參基因,β-actin用于NK1R基因的內(nèi)參基因。使用相對定量方法,將每個靶基因的相對表達倍數(shù)表示為2-ΔΔCt。每個實驗重復(fù)3次。

    1.6 Western blot 從RASMCs細胞和氣道組織中獲得總蛋白樣品,使用12%的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)將不同大小的蛋白分離開。將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上,在室溫下使用含有5%牛血清白蛋白(BSA)的Tris緩沖鹽水-Tween(TBS-T)封閉1 h。將膜與抗NK1R和β-actin的一抗進行孵育,過夜。然后將膜在TBS-T中沖洗(每次3次×10 min)。然后,膜與二抗進行孵育。6 h后,將膜用TBS-T洗滌(每次3次×15 min)?;瘜W發(fā)光試劑A溶液和B溶液以1∶1的比例混合,最后將混合物均勻滴在膜上,使膜顯影,并對所有免疫印跡帶進行相對密度分析。

    1.7 RASMCs培養(yǎng) RASMCs在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)(37 ℃,5%CO2)。每2 d換液一次,細胞鋪滿培養(yǎng)皿時,用0.25%的胰蛋白酶消化并傳代細胞。用含有10%FBS的DMEM代替培養(yǎng)基。

    1.8 雙熒光素酶基因報告實驗 利用生物信息學預(yù)測網(wǎng)站microRNA.org預(yù)測miR-22-3p靶基因,并精確預(yù)測miRNA可識別得潛在靶位點。使用TIANamp基因組DNA試劑盒提取RASMCs的DNA。利用含有miR-22-3p結(jié)合位點的NK1R 3′UTR野生型序列(NK1R-3′-UTR-wt)和突變的NK1R的3′-UTR序列(NK1R-3′-UTR-mut)構(gòu)建熒光素酶報告載體,并將其轉(zhuǎn)染到RASMCs中。使用熒光素酶報告基因測定試劑盒檢測熒光素酶活性。

    2 結(jié)果

    2.1 模型組與對照組幼年大鼠氣道壁結(jié)構(gòu)的病理變化 每次OVA暴露后,模型組中的所有幼年大鼠均表現(xiàn)出煩躁、咳嗽、頻繁抓撓、呼吸急促等癥狀。大鼠連續(xù)暴露幾天后,模型組幼年大鼠的反應(yīng)較對照組慢。老鼠皮毛的顏色變暗。在大鼠肺組織切片中,HE染色顯示藍黑色核和淡紅色細胞質(zhì)(見圖1)。模型組表現(xiàn)出更多氣道壁和氣道平滑肌增厚和不均勻的細胞排列。對照組氣道壁結(jié)構(gòu)未見病理變化。模型組支氣管壁厚度(WA/Pi2)、支氣管壁平滑肌厚度(S/Pi2)及支氣管壁中平滑肌細胞的數(shù)量(N/S)高于對照組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表1。

    表1 對照組與模型組WA/Pi2、S/Pi2、N/S比較Table 1 Comparison of WA/Pi2,S/Pi2,N/S between control group and model group

    2.2 哮喘大鼠中miR-22-3p表達變化 與對照組比較,模型組的miR-22-3p的表達水平明顯降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01),見圖2。

    圖2 對照組和模型組大鼠氣道組織中miR-22-3p的表達水平Figure 2 The expression level of miR-22-3p in the airway tissues of control group and model group注:A.miR-22-3p的表達水平變化點狀圖;B.miR-22-3p的表達水平變化熱圖。與對照組相比,①P<0.01

    2.3 NK1R是miR-22-3p的靶基因 NK1R mRNA 3′-UTR區(qū)域和miR-22-3p的序列具有結(jié)合位點(見圖3A)。mimic對Mut-NK1R的熒光素酶活性的影響差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),mimic降低了wt-NK1R的熒光素酶活性強度,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),見圖3B。

    圖3 使用熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CNK1R mRNA的3′UTR和miR-22-3p的直接結(jié)合關(guān)系Figure 3 The luciferase reporter gene experiment was used to verify the direct binding relationship between 3′UTR of NK1R mRNA and miR-22-3p注:A.NK1R mRNA的3′UTR和miR-22-3p預(yù)測的結(jié)合位點;B.熒光素酶報告基因?qū)嶒炗^察熒光素酶活性變化。與對照組比較,①P<0.01

    2.4 NK1R在幼年哮喘大鼠氣道組織中的表達變化 通過RT-qPCR、Western blot分析每組大鼠氣道組織中NK1R的表達變化。與對照組相比,模型組的NK1R的mRNA和蛋白表達水平明顯上調(diào),差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01,P<0.05),見圖4A~D。

    圖4 對照組和模型組大鼠氣道組織中NK1R的表達水平Figure 4 The expression level of NK1R in the airway tissue of control group and model group注:A.NK1R mRNA表達水平變化的點狀圖;B.NK1R mRNA表達水平變化的熱圖;C.NK1R的蛋白條帶;D.NK1R蛋白表達水平變化的柱形圖。與對照組相比,①P<0.01;與對照組相比,②P<0.05

    2.5 miR-22-3p體內(nèi)調(diào)節(jié)NK1R的蛋白表達水平 明確miR-22-3p對NK1R表達的調(diào)節(jié)作用,mimc下調(diào)模型組中NK1R的mRNA水平,各組差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05);inhibitor上調(diào)模型組中NK1RmRNA水平,各組差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見圖5A)。mimc下調(diào)模型組中NK1R的蛋白水平,各組差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05);inhibitor上調(diào)模型組中NK1R的蛋白水平,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖5B、圖5C。

    圖5 體內(nèi)驗證miR-22-3p沉默對NK1R表達的調(diào)節(jié)作用Figure 5 In vivo verification of the regulatory effect of miR-22-3p silencing on NK1R expression注:A.NK1R mRNA表達水平變化的柱形圖;B.NK1R的蛋白條帶;C.NK1R蛋白表達水平變化的柱形圖。與模型+mimic-NC組相比,①P<0.05;與模型+inhibitor-NC組相比,②P<0.05

    3 討論

    小兒哮喘給家庭和社會造成了巨大精神和經(jīng)濟負擔,因此需要深入探究小兒哮喘的發(fā)生機制[19]。最近研究表明,感覺神經(jīng)肽例如SP、NKA、NKB及降鈣素基因相關(guān)肽與肺部疾病和癌癥有關(guān)[20-21]。因此,探索感覺神經(jīng)肽在氣道重塑中的分子調(diào)節(jié)機制對于研究潛在的小兒哮喘治療靶點至關(guān)重要。

    通過利用幼年大鼠實驗性慢性哮喘,結(jié)果顯示miR-22-3p的表達與哮喘之間可能具有關(guān)聯(lián)。目前研究[7]表明,多種miRNA的表達水平與哮喘和氣道炎癥有關(guān)。包括miR-21、miR-223、miR-22-3p。研究[22]表明,miR-26a在ASMC肥大中起調(diào)節(jié)作用,這是氣道重塑發(fā)展中的關(guān)鍵過程。此外miR-221抑制哮喘患者的ASMC過度增殖[23]。miR-22-3p在維持心肌肥厚和組織重構(gòu)中扮演重要作用[24]。本研究中miR-22-3p的表達在幼年大鼠哮喘發(fā)生過程中降低,因此可能與哮喘的發(fā)展具有密切關(guān)系。miR-22-3p可調(diào)節(jié)多種細胞增殖,包括視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞[25]、肺腺癌[26]、動脈平滑肌細胞[27]。但很少有研究調(diào)查miR-22-3p在幼年哮喘模型中的表達和下游調(diào)節(jié)靶點。

    本研究中通過生物信息學預(yù)測出miR-22-3p和NK1R mRNA的3′-UTR區(qū)存在潛在的靶向調(diào)節(jié)位點。以往研究表明,NK1R表達于呼吸道中的不同部位,包括氣道平滑肌、粘膜下腺、血管內(nèi)皮、炎性細胞[15,28]。新的研究表明,在哮喘氣道重建過程中,NK1R可通過增加微管蛋白的表達促進大鼠氣道平滑肌細胞的遷移,表明NK1R可能是預(yù)防和控制哮喘氣道重塑的新靶標[28]。本研究進一步探究miR-22-3p與神經(jīng)肽NK1R表達之間的關(guān)系,結(jié)果表明在哮喘大鼠中,miR-22-3p和NK1R的表達趨勢相反,而且表明miR-22-3p可直接抑制氣道組織中神經(jīng)肽NK1R的表達。首先在體外的熒光素酶報告基因研究結(jié)果表明,在RASMCs細胞中,miR-22-3p能直接與NK1R mRNA的3′-UTR結(jié)合,通過靶向抑制降低NK1R的蛋白表達。另外,在幼年哮喘大鼠體內(nèi)實驗中,我們通過注射mimics在氣道組織中過表達miR-22-3p,結(jié)果發(fā)現(xiàn)NK1R的表達受到明顯抑制,而通過inhibitor可以明顯抑制miR-22-3p及可以明顯上調(diào)NK1R的表達。一項研究同樣表明,miR-22能夠靶向抑制NK1R,并且因此負調(diào)節(jié)乳腺癌細胞的增殖、侵襲、遷移[12]。因此,在幼年哮喘大鼠的氣道組織中miR-22-3p可以靶向抑制NK1R,從而可能通過調(diào)節(jié)平滑肌細胞和炎性細胞的增殖,以及平滑肌細胞遷移。

    4 結(jié)論

    本研究結(jié)果表明,在幼年哮喘大鼠的氣道組織中,miR-22-3p可以靶向抑制NIK1R的表達,此調(diào)節(jié)機制在哮喘大鼠氣道重塑過程中可能扮演重要作用。miR-22-3p以及NK1R在肺組織中的表達特征對哮喘的早期診斷有潛在的應(yīng)用價值。但仍需擴大樣本量深入研究,以確定miR-22-3p/NK1R信號發(fā)揮作用的具體機制。

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