NT-3修飾的施萬細胞聯(lián)合膠原—殼聚糖神經(jīng)導(dǎo)管對大鼠坐骨神經(jīng)損傷的修復(fù)作用研究

許 蕙，葉 放，于 寧，王艷生 (沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院手外科,遼寧 沈陽 110024)

周圍神經(jīng)系統(tǒng)(peripheral nervous system，PNS)損傷通常會導(dǎo)致神經(jīng)痛或肌肉運動功能受損[1-2]。目前，用于修復(fù)PNS損傷的外科手術(shù)主要有神經(jīng)斷端吻合術(shù)、自體神經(jīng)移植和人工神經(jīng)導(dǎo)管移植[3]。盡管自體神經(jīng)移植是首選治療方案，但由于供體組織可用性有限，且存在喪失神經(jīng)功能和形成神經(jīng)瘤的可能，因而限制了其臨床應(yīng)用[4]。自體施萬細胞(Schwann cells，SCs)在周圍神經(jīng)再生中起關(guān)鍵作用[5]。植入人工導(dǎo)管后，增殖的施萬細胞可以釋放營養(yǎng)因子，引導(dǎo)再生軸突穿過病變，但因其無法快速生成足夠的細胞，故而其臨床應(yīng)用受到限制。神經(jīng)營養(yǎng)素3(neurotrophin 3，NT-3)是重要的自分泌因子，可以支持施萬細胞存活和分化，并刺激神經(jīng)突生長和髓鞘形成，有利于受損神經(jīng)快速修復(fù)[6]，但以人工神經(jīng)導(dǎo)管為載體、復(fù)合以NT-3修飾的施萬細胞是否有利于施萬細胞的存活及PNS損傷的有效修復(fù)目前尚不清楚。因此，本研究將復(fù)合NT-3修飾的施萬細胞聯(lián)合膠原—殼聚糖神經(jīng)導(dǎo)管作為植入體，研究其對坐骨神經(jīng)損傷的治療效果，以期為臨床應(yīng)用提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級SD大鼠80只，8周齡，體質(zhì)量(200±10)g，均為雄性，購自上海劍鈍生物科技有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(滬)2019-0027。本研究經(jīng)我院動物倫理委員會批準，實驗遵守3R保護原則。

1.1.2 藥品與試劑 Ⅰ型膠原蛋白(C3867)和殼聚糖(448869)購自Sigma公司，DMEM/F12培養(yǎng)基(A4192001)、胎牛血清(10100147)、0.25%胰酶(15050057)和青霉素—鏈霉素(10 000 U/mL，15140148)購自美國Thermo Fisher Scientific公司，TUNEL凋亡檢測試劑盒(C1088)購自上海碧云天公司，DAPI(ab104139)、S100(ab181975)、Sox10兔單克隆抗體(ab155279)、山羊抗兔IgG H&L(Alexa Fluor?488，ab150077)和驢抗兔IgG H&L(Alexa Fluor?647，ab150075)多克隆抗體、Live/Dead試劑盒(ab253384)購自英國Abcam公司。

1.1.3 主要儀器 NeuroExam M 800型肌電圖儀購自珠海麥康科技有限公司，F(xiàn)M-200熒光顯微鏡購自上海普丹光學(xué)儀器有限公司，H600型透射電鏡購自日本Hitachi公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 膠原—殼聚糖神經(jīng)導(dǎo)管制備 參照文獻方法[7]，按照質(zhì)量比4∶1稱?、裥湍z原蛋白280 mg和殼聚糖70 mg，分別加入5 mL濃度為3 mg/mL的冰醋酸，低溫放置24 h后混合2種溶液，冰浴、混勻、抽真空、靜置過夜、注模，然后將模具浸入液氮，梯度冷淋后，再于-60 ℃、-13.3 Pa下凍干，裁剪為每段14 mm的神經(jīng)導(dǎo)管，常溫干燥并滅菌保存，密封備用。

1.2.2 施萬細胞的培養(yǎng)及鑒定 按照文獻方法[8]，取新生SD大鼠5只，消毒后暴露坐骨神經(jīng)，盡量剔除神經(jīng)外膜組織，剪碎后使用Ⅰ型膠原酶和0.25%胰酶于37 ℃消化20 min，加入DMEM/F12完全培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)，輕輕吹打，離心6 min(1 500 r/min)，收集細胞沉淀，并調(diào)整細胞密度為1×104/mL，接種于用多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)瓶，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。棄去舊培養(yǎng)液，加入終濃度為2 g/mL的阿糖胞苷DMEM/F12完全培養(yǎng)液，培養(yǎng)3 d，以除去成纖維細胞，待細胞融合率達90%左右，胰酶消化傳代。取第3代施萬細胞，利用S100和Sox10免疫熒光鑒定施萬細胞純度，其中施萬細胞純度=[S100陽性(綠色熒光)細胞+Sox10陽性(紅色熒光)細胞]/DAPI標記細胞數(shù)(藍色熒光)×100%。

1.2.3 施萬細胞鑒定和基因修飾 取1.2.2培養(yǎng)的第3代施萬細胞，接種于6孔板，培養(yǎng)8 h。將攜帶NT-3基因、且用RFP標記的腺病毒載體(AdvNT-3)原液(1×109TU/mL)按照病毒滴度值(MOI)3、10、100與培養(yǎng)基稀釋后，用于培養(yǎng)上述施萬細胞24 h，然后更換為DMEM/F12完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，熒光顯微鏡下觀察，確定最佳MOI值。然后按照上述方法用未標記的AdvNT-3慢病毒感染施萬細胞，用于后續(xù)實驗。

1.2.4 動物模型制備[9]及分組 將SD大鼠隨機分為5組：對照組(A組)，12只；模型組(B組)，10只；神經(jīng)導(dǎo)管單獨移植組(C組)，11只；未修飾施萬細胞+神經(jīng)導(dǎo)管移植組(D組)，20只；NT-3修飾施萬細胞+神經(jīng)導(dǎo)管移植組(E組)，22只。給予各組大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.004 mL/g)麻醉，無菌環(huán)境手術(shù)暴露左側(cè)坐骨神經(jīng)，切除8 mm神經(jīng)干制備坐骨神經(jīng)損傷模型。然后進行以下操作：A組采用自身坐骨神經(jīng)翻轉(zhuǎn)吻合后縫合；B組采用切除坐骨神經(jīng)后縫合；C組采用神經(jīng)導(dǎo)管橋接縫合缺損神經(jīng)；D組采用未修飾的施萬細胞以1×106/mL復(fù)合神經(jīng)導(dǎo)管，橋接缺損神經(jīng)；E組采用NT-3修飾的施萬細胞以1×106/mL復(fù)合神經(jīng)導(dǎo)管，橋接缺損神經(jīng)。術(shù)后每天腹腔注射青霉素50 000 IU/kg，持續(xù)3 d。

1.2.5 施萬細胞存活率 術(shù)后5 d、11 d隨機選取D組和E組大鼠各5只，處死后取移植處的復(fù)合神經(jīng)導(dǎo)管，采用Live/Dead染色法檢測移植后的施萬細胞存活狀態(tài)。其中綠色和紅色熒光分別代表活細胞和死細胞。

1.2.6 坐骨神經(jīng)功能指數(shù)(sciatic functional index，SFI)測定[10]術(shù)后1周、4周、7周、10周和13周，將各組大鼠(其中D組和E組，術(shù)后1周分別隨機選取10只和12只大鼠)后左右足均蘸墨水，由暗箱一側(cè)走至另一側(cè)，分別記錄3～4個正常側(cè)和手術(shù)側(cè)清晰足跡，并測量足印長度、第1腳趾至第5腳趾距離、第2腳趾至第4腳趾距離，按照Bain公式計算大鼠SFI值，取平均值。

1.2.7 電生理檢測 術(shù)后13周，將各組剩余的全部大鼠用10%水合氯醛(0.004 mL/g)腹腔麻醉，暴露左側(cè)移植坐骨神經(jīng)，于梨狀肌下緣3 mm神經(jīng)干處放置刺激電極，同側(cè)外踝關(guān)節(jié)上10 mm腓腸肌安置接收電極，電極強度1 V，間隙0.25 ms，測定肌肉復(fù)合動作電位傳導(dǎo)速率和峰峰值。

1.2.8 TUNEL測定 待電生理檢測結(jié)束后，取各組大鼠移植處組織5 mm，制成常規(guī)石蠟切片，根據(jù)TUNEL染色說明書操作步驟對組織切片染色，隨機抽取5個視野觀察神經(jīng)元細胞凋亡情況。

1.2.9 坐骨神經(jīng)髓鞘再生情況 取TUNEL測定中大鼠移植處組織，經(jīng)2.5%戊二醛固定、脫水、包埋、固化后，制成60 nm超薄切片，用檸檬酸和乙酸鈾酰染色，然后在透射顯微鏡下觀察軸突超微結(jié)構(gòu)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 施萬細胞鑒定結(jié)果

S100陽性施萬細胞呈綠色，Sox10陽性施萬細胞呈紅色；DAPI陽性施萬細胞細胞核呈藍色，施萬細胞純度為95%以上，見圖1。

圖1 施萬細胞鑒定結(jié)果

2.2 最佳MOI值確定

MOI值為3、10、100的施萬細胞RFP陽性表達依次升高，其中MOI值為100的施萬細胞RFP陽性表達最強，表示最佳MOI值為100，紅色熒光表示成功感染NT-3慢病毒(圖2)。

a:MOI=3;b:MOI=10;c:MOI=100

2.3 施萬細胞存活情況

D組術(shù)后5 d、11 d施萬細胞存活率分別為(95.28±2.31)%和(98.64±2.39)%，E組術(shù)后5 d、11 d施萬細胞存活率分別為(92.56±1.94)%和(94.74±1.63)%，存活狀態(tài)均良好，見圖3。

2.4 坐骨神經(jīng)功能指數(shù)測定

術(shù)后1周，與A組比較，其余各組SFI均明顯降低(P<0.05)，但其余各組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；術(shù)后4周，與A組比較，其余各組SFI均顯著降低(P<0.05)，其余各組中E組最高(P<0.05)，而B組、C組、D組間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；術(shù)后7周、10周和13周，與A組相比，其余各組SFI均明顯較高(P<0.05)，與B組和C組相比，D組和E組SFI均顯著較高(P<0.05)，且E組高于D組(P<0.05)，B組和C組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，見表1。

2.5 電生理檢測

術(shù)后13周，與A組相比，其余各組動作電位傳導(dǎo)速度顯著較低(P<0.05)，除E組外其余各組峰峰值顯著較低(P<0.05)；與B組相比，C組、D組和E組動作電位傳導(dǎo)速度和峰峰值依次升高(P<0.05)，且E組高于D組(P<0.05)，見表2。

2.6 損傷區(qū)神經(jīng)元凋亡情況

術(shù)后13周，與A組相比，B組神經(jīng)元細胞凋亡數(shù)量明顯較多；與B組相比，C組、D組和E組神經(jīng)元細胞凋亡數(shù)量依次減少，綠色為凋亡神經(jīng)元細胞，見圖4。

圖3 D組和E組術(shù)后5 d、11 d復(fù)合移植導(dǎo)管中施萬細胞存活鑒定結(jié)果(×100)

表1 術(shù)后不同時間點各組大鼠SFI值比較

表2 各組大鼠動作電位傳導(dǎo)速度和峰峰值比較

2.7 大鼠坐骨神經(jīng)損傷區(qū)再生神經(jīng)軸突超微結(jié)構(gòu)分析

術(shù)后13周，A組神經(jīng)纖維數(shù)量豐富、粗細均勻、髓鞘較厚、排列均勻，且結(jié)構(gòu)清晰；B組神經(jīng)纖維數(shù)量明顯較少，且有嚴重的脫髓鞘變化及軸漿萎縮等異?，F(xiàn)象，纖維生長明顯狀態(tài)不良；與B組相比，C組、D組和E組神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)明顯清晰，纖維數(shù)量依次增多，脫髓鞘現(xiàn)象得到顯著改善，見圖5。

圖4 術(shù)后13周各組大鼠坐骨神經(jīng)損傷移植段神經(jīng)元細胞形態(tài)學(xué)變化情況

圖5 術(shù)后13周各組移植大鼠中段再生坐骨神經(jīng)1 μm橫截面電鏡超微結(jié)構(gòu)

3 討論

PNS損傷是臨床常見的疾病，通常會導(dǎo)致四肢痛覺過敏、與疼痛有關(guān)的步態(tài)和腫脹等問題，嚴重影響患者生活質(zhì)量[11]。當PNS損傷嚴重到無法進行自主活動時，通常使用患者自身的腓腸神經(jīng)等自體神經(jīng)進行移植，但有限的來源給供給造成較大的困難，因此，可匹配或超過自體移植物性能的替代方法是當前臨床明顯緊缺的，也是臨床應(yīng)用研究的熱點。

隨著組織工程學(xué)的發(fā)展，應(yīng)用于神經(jīng)缺損的神經(jīng)導(dǎo)管為神經(jīng)再生提供了指導(dǎo)和生物學(xué)環(huán)境，但導(dǎo)管本身對神經(jīng)修復(fù)的作用有限，因此神經(jīng)修復(fù)主要集中在利用細胞療法或基因修飾優(yōu)化神經(jīng)導(dǎo)管。施萬細胞是神經(jīng)膠質(zhì)細胞，在整個發(fā)育過程中與軸突緊密接觸，并為周圍的神經(jīng)元提供重要營養(yǎng)支持，而PNS損傷會影響施萬細胞功能[12]。NT-3有益于周圍神經(jīng)和施萬細胞生長，能夠促進軸突再生和相關(guān)髓鞘形成[13]。本研究首先從新生SD大鼠中提取施萬細胞，經(jīng)S100/Sox10雙熒光標記鑒定施萬細胞純度為95%以上，并采用最佳MOI值100以攜帶NT-3基因的AdvNT-3修飾施萬細胞，然后復(fù)合膠原—殼聚糖神經(jīng)導(dǎo)管植入坐骨神經(jīng)損傷大鼠，結(jié)果顯示術(shù)后5 d、11 d施萬細胞在大鼠體內(nèi)存活狀態(tài)良好，表明復(fù)合導(dǎo)管可有效保持攜帶NT-3基因的施萬細胞活性，這可能有利于施萬細胞發(fā)揮促進坐骨神經(jīng)損傷修復(fù)的作用。

季夕萌等[14]研究發(fā)現(xiàn)，將載骨髓間充質(zhì)干細胞雙層膠原神經(jīng)導(dǎo)管橋接于大鼠坐骨神經(jīng)缺損部位，可有助于大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)。將牙髓干細胞復(fù)合聚乳酸乙醇酸神經(jīng)導(dǎo)管移植到糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)，可明顯增加其神經(jīng)傳導(dǎo)速度和神經(jīng)血流[15]。此外，骨髓基質(zhì)細胞復(fù)合聚乳酸聚乙醇酸神經(jīng)導(dǎo)管能夠改善坐骨神經(jīng)間隙模型大鼠脊髓運動神經(jīng)元的生長，有助于神經(jīng)軸突再生和功能恢復(fù)[16]。SFI是用于評估大鼠或小鼠周圍神經(jīng)功能恢復(fù)情況的可靠參數(shù)[17]。損傷后坐骨神經(jīng)動作電位的振幅與總神經(jīng)纖維數(shù)量及興奮強度成正比[18]。本研究結(jié)果顯示，坐骨神經(jīng)損傷大鼠的SFI、動作電位傳導(dǎo)速度和峰峰值降低，神經(jīng)纖維數(shù)量明顯減少，且出現(xiàn)軸漿萎縮等現(xiàn)象，同時神經(jīng)元細胞凋亡數(shù)量增多，表明坐骨神經(jīng)損傷大鼠的神經(jīng)功能恢復(fù)緩慢。神經(jīng)導(dǎo)管單獨移植組坐骨神經(jīng)損傷大鼠以上指標改善均不明顯，給予未修飾施萬細胞+神經(jīng)導(dǎo)管移植后，神經(jīng)功能恢復(fù)效果相對提升，給予NT-3修飾的施萬細胞+神經(jīng)導(dǎo)管移植后，大鼠各項指標改善顯著，說明NT-3修飾的施萬細胞有利于坐骨神經(jīng)損傷大鼠髓鞘再生，且改善效果優(yōu)于未修飾的施萬細胞+神經(jīng)導(dǎo)管移植。Wright等[19]的研究顯示，用神經(jīng)營養(yǎng)蛋白調(diào)節(jié)細胞行為，可以實現(xiàn)自體嗅鞘細胞移植功能的最佳化。而將施萬細胞和嗅鞘細胞共移植能夠顯著改善脊髓損傷大鼠的運動功能[20]，因此推測NT-3修飾的施萬細胞聯(lián)合膠原—殼聚糖神經(jīng)導(dǎo)管在促進坐骨神經(jīng)功能恢復(fù)方面具有較大潛力。

綜上所述，NT-3修飾的施萬細胞聯(lián)合膠原—殼聚糖神經(jīng)導(dǎo)管能夠促進坐骨神經(jīng)損傷大鼠損傷部位的神經(jīng)髓鞘再生，保護神經(jīng)纖維功能，對大鼠坐骨神經(jīng)損傷具有良好的修復(fù)作用，表明該方案在治療PNS損傷方面具有潛在價值。但PNS損傷可以誘發(fā)復(fù)雜的病理生理過程和炎癥反應(yīng)，這給治療組織損傷帶來一定困難，因此，NT-3修飾的施萬細胞聯(lián)合膠原—殼聚糖神經(jīng)導(dǎo)管對PNS損傷的治療效果仍需深入探討。