實驗動物遺傳質(zhì)量監(jiān)測技術(shù)研究進展與應用*

杜小燕 霍學云 陳振文

(首都醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院，北京 100069)

實驗動物的遺傳質(zhì)量監(jiān)測是通過科學的方法對近交系動物進行遺傳本底的一致性檢驗和封閉群動物的群體遺傳學分析，評價其是否符合品系或群體特征，確保品種、品系動物固有的遺傳組成和生物學特性。隨著生命科學的發(fā)展，實驗動物遺傳質(zhì)量檢測技術(shù)和方法也不斷進步，從最初的形態(tài)學、染色體技術(shù)、蛋白質(zhì)分子和免疫學技術(shù)到分子生物學的基因檢測，經(jīng)歷了由粗放到精細、由定性到定量、由繁瑣到簡便的發(fā)展歷程。上述發(fā)展，不僅顯著提高實驗動物遺傳質(zhì)量評價的準確性和可靠性，減少工作量和縮短檢測周期，而且通過遺傳檢測技術(shù)的提升，確保了實驗動物遺傳質(zhì)量的可靠性，對實驗動物的分類、品種和品系維系、資源的保存、開發(fā)和利用及動物的選種和選育發(fā)揮重要作用。

1 實驗動物遺傳質(zhì)量監(jiān)測技術(shù)

實驗動物遺傳質(zhì)量監(jiān)測技術(shù)是借助能反映該動物或群體遺傳本質(zhì)和特征的遺傳標記(genetic marker)評價實驗動物遺傳質(zhì)量。遺傳標記是生物體中基因型遺傳信息易于識別的表現(xiàn)形式，包括可用于遺傳分析的基因或序列，也包括由遺傳控制的任何表型差異，因此具有可遺傳學和可識別性兩個特征。

1.1 實驗動物遺傳監(jiān)測形態(tài)學方法

形態(tài)學標記(morphological markers)是以可辨認的外觀特征為依據(jù)。我國春秋時期伯樂相馬和奧地利學者孟德爾的豌豆雜交實驗均為形態(tài)學遺傳標記的先例。用于實驗動物遺傳監(jiān)測最常見的一種形態(tài)學標記是毛色，如白色或野生色分別代表不同基因型，利用毛色表型分離可以推斷近交系的毛色基因的方法稱毛色基因測試法。另一種形態(tài)學標記是頜骨(mandible)形態(tài)測定，該性狀與遺傳因素密切相關，被認為是比較穩(wěn)定的數(shù)量性狀，例如陳哲等[1]報道對小鼠進行測定時，可以在一定的坐標圖上測量其下頜骨11個位點的分布，然后進行數(shù)據(jù)分析。毛色在培育動物的過程中是天然的遺傳標記，故而仍在使用；頜骨標記則在新的種系鑒定中非常有價值。然而，可用做遺傳監(jiān)測的形態(tài)學標記是有限的，而且有些又易受環(huán)境的影響。另外，下頜骨標記需要處死動物和比較繁瑣的操作，所以這類遺傳標記有一定的局限性。

1.2 細胞遺傳學監(jiān)測技術(shù)

細胞遺傳學標記是指生物的染色體特征，以起源于20世紀50年代的染色體顯帶技術(shù)為依托[2]。常見的顯帶技術(shù)有Q-帶、G-帶、C-帶、R-帶、F-帶、Cd-帶、N-帶、F-帶、G-H等。其中G-帶在整個分裂間期和分裂期相對穩(wěn)定，可以用來進行品系鑒定和遺傳監(jiān)測。1978年，Hsu等[3]用6種小鼠染色體帶紋分析其親緣關系。其他實驗動物，如雞、牛、長爪沙鼠等均有進行染色體核型分析的報道。除了顯帶技術(shù)，熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, FISH)技術(shù)也可以應用于遺傳分析，在鑒定基因修飾動物中應用廣泛。

1.3 免疫學標記監(jiān)測技術(shù)

免疫標記(immunogenetic markers)監(jiān)測技術(shù)是指利用動物細胞免疫成分進行遺傳檢測，主要包括組織相容性抗原(H-2)[4]等。1958年，Snell等[5]發(fā)現(xiàn)不同基因型的小鼠之間進行皮膚移植無法成功，由此鑒定出一系列小鼠組織相容性復合體(major histocompatibility complex，MHC)基因，并做了大量的工作。Callahan等[6]報道大鼠的種間MHC基因也存在多樣性，可進行種的區(qū)分。對于近交系小鼠，鑒定MHC基因應用最多的方法是皮膚移植[7]；對于單倍型的實驗動物雞和鴨可以采用PCR擴增的方法進行MHC基因型的檢測，并已納入2021年最新發(fā)布的北京市實驗動物地方標準[8]。皮膚移植方法在新的實驗動物近交系品系鑒定中仍然非常重要，但是該方法使用動物數(shù)量多，觀察時間長，對手術(shù)操作的技術(shù)要求較高，因此在日常遺傳監(jiān)測中應用較少。

1.4 生物化學監(jiān)測技術(shù)

生化標記(biochemical markers)分析方法是蛋白水平的檢測，可用于近交系的品系鑒定和封閉群群體遺傳結(jié)構(gòu)分析，具有檢測基因位點明確、方法簡便、快速、經(jīng)濟等優(yōu)點。我們國家在邢瑞昌等[9]科學家的努力下，研究開發(fā)大小鼠生化位點方法。在1994、2004及2010版國家標準[10]中推薦實驗動物近交系小鼠16個生化位點和大鼠11個生化位點的檢測方法。除此之外，還有用于其他實驗動物遺傳檢測的報道，包括實驗兔[11]、長爪沙鼠[12]等多種動物。生化標記方法在品系鑒定尤其是大小鼠的鑒定中發(fā)揮著非常重要的作用。在國家標準中，對大小鼠常用品系位點的電泳位置都有準確定義，但是生化位點的多態(tài)性較低，用于封閉群群體遺傳結(jié)構(gòu)分析時計算的雜合度、多態(tài)信息含量等遺傳參數(shù)值均偏低。另外，生化位點方法對技術(shù)的要求較高，其操作和結(jié)果判斷需要具有非常豐富的經(jīng)驗。

1.5 分子生物學監(jiān)測技術(shù)

遺傳差異歸根結(jié)底是基因組DNA的不同，因此檢測DNA是最直接可靠的遺傳評價。DNA水平的分子遺傳標記克服了上述方法的諸多不足，具有結(jié)果易判讀、準確性高、穩(wěn)定性強、檢測周期短、費用低等優(yōu)點，并可實現(xiàn)無創(chuàng)采樣，因而受到實驗動物科技工作者的青睞。

1.5.1限制性片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)是第一代DNA水平的分子遺傳標記。1980年Wyman等[13]發(fā)現(xiàn)了對人基因組DNA酶切可獲得RFLP，且符合孟德爾遺傳。后來Hayashi等[14]發(fā)現(xiàn)大鼠線粒體DNA中也存在RFLP。從此以后，RFLP廣泛應用于人類及動物遺傳學研究，在種間鑒別中非常有價值，目前仍然廣泛應用于動物遺傳研究和種的鑒別，如Kovalchuk等[15]報道的用于牛β血紅蛋白A/B兩個變異體的鑒定等。RPLF操作簡單，結(jié)果易于判斷，但在小鼠近交系間多態(tài)性較低，不宜用于小鼠近交品系的遺傳質(zhì)量監(jiān)測。

1.5.2微衛(wèi)星(microsatellite，MS)DNA是基因組中重要的一種重復序列，又稱短串聯(lián)重復(short tandem repeat，STR)，由1～6個核苷酸的重復單元組成，幾乎存在于所有的有機體和細胞中。STR呈現(xiàn)孟德爾式共顯性遺傳，其多態(tài)性非常豐富，如封閉群小型豬的等位基因數(shù)能達到幾十個[16]。STR有一定的物種保守性，在種系間也可能有同源性，通過同源擴增(cross amplification)可能篩選到新的實驗動物STR基因位點。趙太云等[17]和Du等[18]先后用大鼠或小鼠的微衛(wèi)星DNA引物成功篩選出了長爪沙鼠的STR基因位點；Liu等[19]用長爪沙鼠的微衛(wèi)星DNA位點獲得了灰倉鼠的11個STR基因位點。作為分子遺傳標記，微衛(wèi)星DNA廣泛地應用于物種鑒定、個體識別、親子鑒定等很多領域。在實驗動物遺傳監(jiān)測方面，微衛(wèi)星DNA也發(fā)揮著重要作用。國內(nèi)最初由陳振文教授帶領的團隊歐陽兆和等[20]和李瑞生等[21]優(yōu)化PCR條件，篩選優(yōu)化小鼠和大鼠微衛(wèi)星DNA位點并進行應用，之后謝建云等[22]和王洪等[23]報道用微衛(wèi)星DNA位點對近交系和封閉群小鼠及來源于不同生產(chǎn)單位的BALB/c和C57BL/6J進行了分析。目前已建立微衛(wèi)星DNA遺傳標記監(jiān)測方法的實驗動物還包括豚鼠[24]、裸鼴鼠[25]、比格犬[26]等，最近Zhang等[27]建立了實驗用雞、鴨和鵝的微衛(wèi)星DNA遺傳質(zhì)量檢測方法。2021年發(fā)布的北京市實驗動物質(zhì)量地方標準中對實驗小型豬、實驗狨猴、實驗貓、實驗雪貂等11種(品系)動物均推薦了微衛(wèi)星DNA遺傳標記的檢測方法[8]。微衛(wèi)星DNA方法簡單易行，比較經(jīng)濟，且結(jié)果易于判斷(可借助多種軟件)，因而受到眾多實驗工作者的認可。

1.5.3單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)是20世紀90年代由美國學者Lander提出的第三代DNA遺傳標記[28]，突變率為10-9，與微衛(wèi)星DNA(10-2～10-4)相比遺傳穩(wěn)定性更高。常用的SNP分析方法包括直接測序法、基質(zhì)輔助激光解析飛行時間質(zhì)譜分析法等。大小鼠目前已建立較成熟的SNP遺傳檢測方法，岳秉飛研究團隊建立了基于PCR擴增的SNP大小鼠檢測方法[29-30]，杜小燕團隊用比較多的SNP位點(94個)分別對封閉群和近交系小鼠進行了遺傳檢測，并比較了近交系品系間的差異和STR、SNP和生化位點檢測封閉群小鼠的差異[31-32]。2004年Petkov等[33]報道的Jackson實驗室的科學家研究了小鼠SNP，從235個SNP凝煉出28個SNP位點，能夠?qū)?00多種小鼠品系進行區(qū)分[33]。2015年Kazuyuki等[34]從1 361個SNP中開發(fā)了100個C57BL/6N特異性位點，成功區(qū)分該品系的11個衍生品系(即不同生產(chǎn)商的動物)，也可以區(qū)分C57BL/6J及其衍生品系。SNP分布廣泛數(shù)量龐大，而且適于建立高通量方法，但恰恰由于其數(shù)量太多，如何在“浩瀚大?！敝姓业阶钸m合SNP進行各種實驗動物遺傳監(jiān)測，是很大的挑戰(zhàn)。

2 實驗動物遺傳質(zhì)量監(jiān)測的思考和展望

實驗動物生產(chǎn)和繁殖過程中一直伴隨著遺傳質(zhì)量問題，近交系的長期近親繁殖、同一品系在不同國家、地域或生產(chǎn)單位的長時間隔離繁殖、封閉群動物群體數(shù)量過小等均會引起遺傳漂變。長期的人工飼養(yǎng)環(huán)境和選擇壓力會引起不可避免的突變，也包括自然突變等。目前實驗動物遺傳監(jiān)測越來越傾向于DNA水平的技術(shù)方法，應用這些方法時需考慮以下問題。

2.1 遺傳檢測方法的選擇

選擇適當?shù)倪z傳檢測方法需要綜合考慮技術(shù)人員力量、儀器設備條件、經(jīng)費預算、實驗耗時和動物使用量所涉及的倫理要求，并結(jié)合所使用方法的特點、準確性、重復性等多個方面，例如選用毛色標記需要技術(shù)人員有較好的遺傳繁育知識、耗時長、成本高；選用STR、RFLP、SNP等分子標記，不需要處死動物，更符合倫理要求，快速簡便，但需要掌握PCR和基因分型技術(shù)，配備毛細管凝膠電泳和熒光PCR儀；選用生化位點方法則對提取蛋白、蛋白電泳、染色等技術(shù)的要求較高，但獲得的多態(tài)信息含量較低，并且需要處死動物；在近交系品系鑒定時利用皮膚移植是很準確的方法，但其耗時長且動物用量較大。總之，科研工作人員應根據(jù)自身的需求和條件選擇適當?shù)倪z傳檢測方法。

2.2 分子遺傳標記位點的選擇

可供選擇的實驗動物遺傳檢測分子標記十分豐富，但是采用哪種方法以及選擇哪些位點還沒有統(tǒng)一，不同動物的差別也較大。李銀銀等[31]用微衛(wèi)星DNA和SNP對封閉群小鼠進行檢測時發(fā)現(xiàn)，同一個群體，用微衛(wèi)星DNA標記計算的群體遺傳參數(shù)遠大于SNP和生化位點，其中生化位點由于其多態(tài)性信息含量較低，所計算的遺傳參數(shù)最小。另外，在比格犬遺傳檢測方法的研究中發(fā)現(xiàn)，有些微衛(wèi)星位點具有群體間的普遍性(general)，有些具有群體的獨特性(unique)。在建立遺傳檢測方法的時候，應該選擇“general”的位點還是“unique”的位點，是一個值得思考的問題。

2.3 檢測結(jié)果的判斷

在2010版實驗動物遺傳質(zhì)量控制國家標準中，對生化位點檢測近交系小鼠的結(jié)果判斷有很詳細的描述，因為每個品系的生化位點特征都很清楚，但是對于STR或SNP數(shù)量龐大，定義每個品系的特征性STR或SNP位點并非易事。另外，對24種近交系小鼠進行STR和SNP的檢測，發(fā)現(xiàn)結(jié)果卻有所不同，SNP位點呈現(xiàn)品系內(nèi)單態(tài)的比例較低，這進一步說明SNP的精確性或敏感性高于STR。另外，目前在多個地方標準中推薦了微衛(wèi)星DNA或SNP用于封閉群動物的群體遺傳結(jié)構(gòu)分析，但檢測結(jié)果的判斷標準不盡相同，有的采用平均雜合度，有的推薦用卡方檢驗來判斷是否為平衡群體，是否應該將香隆指數(shù)等更多遺傳參數(shù)推薦到結(jié)果判斷中，需要進一步研究和論證。

2.4 發(fā)現(xiàn)遺傳變異的處理方式

前已述及，遺傳變異在實驗動物的生產(chǎn)繁殖中不可避免，同一品系的動物在各生產(chǎn)單位之間由于遺傳漂變，出現(xiàn)個別位點的等位基因差異也很正常，例如實驗中，用STR檢測時發(fā)現(xiàn)，Jackson和Taconic來源的BALB/c、C3H和DBA/2分別有2個、1個和3個位點的等位基因型不同(未發(fā)表數(shù)據(jù))。2015年，根據(jù)Kazuyuki等[35]報道，用100個SNP的檢測結(jié)果也說明，來自不同公司的C57BL/6 N和C57BL/6J的SNP等位基因不同[34]，說明同一品系不同生產(chǎn)廠家的動物是存在一定差異的。

實驗動物遺傳檢測技術(shù)不斷發(fā)展為遺傳質(zhì)量控制提供了新的手段，并促使我們思考以下問題：①快速、無損傷、高通量且準確地評價實驗動物遺傳質(zhì)量，是實驗動物遺傳檢測新技術(shù)面臨的挑戰(zhàn)。例如，用多重PCR進行微衛(wèi)星DNA的基因型分析，開發(fā)和研制小鼠等常用實驗動物的SNP芯片等，都將是努力的方向；②將鑒別品系轉(zhuǎn)變?yōu)殍b定品系。目前研究開發(fā)的STR或SNP都能實現(xiàn)越來越精確的品系鑒別，無論是用4個STR位點還是11或100個SNP位點都可以有效區(qū)分不同小鼠近交系或不同生產(chǎn)商家的同一品系。但是，如何對每一種(品系)實驗動物建立自身特有的位點體系，從而對其進行鑒定，需要全世界相關領域的專家長期不斷協(xié)作努力，期待這一天早日到來。