胸水M1/M2型巨噬細胞比例在結(jié)核性胸膜炎與惡性胸腔積液鑒別中的價值

燕存子 孫峰 王海月

胸腔積液是一種常見的臨床表現(xiàn)，可由多種疾病引起，根據(jù)Light標準分為滲出液和漏出液。滲出液中以結(jié)核性胸膜炎與惡性胸水最難鑒別。結(jié)核性胸膜炎胸腔積液、結(jié)核菌涂片陽性率不到10%，MTB培養(yǎng)的敏感性在30%左右[1]；惡性胸水主要依靠病理診斷，但假陰性率居高不下。因此，臨床上需要尋找一個敏感性強、特異性高的鑒別診斷指標。巨噬細胞是結(jié)核性胸腔積液與惡性胸水共有的主要細胞成分之一，在不同的刺激下，可極化為促炎型M1細胞和抑炎型M2細胞[2]。因此巨噬細胞亞型的數(shù)量與比例可能成為不同疾病的鑒別診斷的免疫學(xué)標記物。本研究采用流式細胞術(shù)，比較結(jié)核性胸膜炎與惡性胸水患者胸水與外周血M1/M2型單核-巨噬細胞的數(shù)量及比例，探討不同疾病對巨噬細胞極化方向的影響，期望發(fā)現(xiàn)在鑒別結(jié)核性胸膜炎與惡性胸水中更高效的臨床指標。

資料與方法

一、研究對象

前瞻性收集2018年10月-2019年5月新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸與呼吸危重癥中心就診的新發(fā)胸腔積液患者，行胸腔穿刺獲取胸腔積液，根據(jù)Light標準判定為滲出液，結(jié)合臨床表現(xiàn)、影像學(xué)、病原學(xué)、病理學(xué)等檢查，診斷為結(jié)核性胸膜炎或惡性胸腔積液者納入本研究。結(jié)核性胸膜炎標準[1]：①胸水蛋白定量>30 g/L；②胸水白細胞計數(shù)>500×106/L；③胸水腺苷脫氨酶(adenosine deaminase，ADA)≥40U/L；④外周血γ干擾素釋放試驗(IGRA)陽性；⑤除外結(jié)締組織病、肺炎、腫瘤等其他疾病。惡性胸腔積液依據(jù)[3]《惡性胸腔積液診斷與治療專家共識》，胸水經(jīng)過病理學(xué)證實發(fā)現(xiàn)惡性細胞確診。剔除標準：既往有抗結(jié)核或抗腫瘤治療者；合并肝炎、糖尿病、艾滋病、自身免疫性疾病的患者；接受糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑治療的患者、妊娠者；已納入結(jié)核性胸膜炎組，但抗結(jié)核治療失敗者。本研究通過新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(審批號：20180913-08)，所有受試者均簽署知情同意書。

二、研究方法

1 胸水與外周血單個核細胞的分離：采集10 mL胸腔積液置于肝素抗凝管，離心(1500 rpm，10 min)，移去上清液后再加入30 mL生理鹽水混勻。再次加入15 mL Ficoll-Paque淋巴細胞分離液(美國GE healthcare公司)在室溫下離心(2500 rpm，25 min)。小心抽取中間層的單核細胞，再次用生理鹽水混勻。即得到胸水單核細胞(plural effusion mononuclear cell，PE-MCs)。采集5 mL外周血置于乙二胺四乙酸二鉀抗凝管中，按照上述方法分離得到外周血單核細胞(Peripheral blood mononuclear cell，PB-MCs)。

2 流式細胞儀檢測:將分離的單核細胞用抗人CD14-FITC、CD86-PE/cy7、CD163-PE 標記巨噬細胞(美國biolegend公司)，用FC500流式細胞儀(美國Beckman Coulter公司)檢測這些分子的表達，表達水平用陽性細胞比例表示。

3 血常規(guī)：需抽取 2 mL 靜脈血于乙二胺四乙酸二鉀抗凝管中，送本院檢驗中心檢測，用希斯美康 Sysmex XE2100 血細胞分析儀(日本西斯美康公司產(chǎn)品)測定白細胞計數(shù)(White cell count，WBC)、中性粒細胞計數(shù)(neutrophil count，N)、淋巴細胞計數(shù)(lymphocyte count，L)、單核細胞計數(shù)(Monocyte Count，M)。

4 胸腔積液ADA檢測：需抽取5 mL胸腔積液于肝素抗凝管中送本院檢驗中心檢測，采用Beckman LK-20全自動生化分析儀進行檢測，使用Beckman原裝檢測試劑盒，按照說明書操作。

5 全血γ干擾素釋放試驗(IGRA)：抽取靜脈血各1 mL于陰性對照管(Nil對照管)、陽性對照管(Mitogen對照管)、TB抗原管，采用QFT-GIT試劑盒(Cellestis公司)檢測，按照說明書操作。陽性結(jié)果判定：TB抗原管-Nil對照管≥0.35 IU/mL，且Nil管≤8 IU/mL。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié) 果

一、臨床資料

共納入結(jié)核性胸膜炎患者56例，惡性胸腔積液患者39例，其中5例結(jié)核性胸膜炎患者抗結(jié)核治療后胸水反復(fù)出現(xiàn)，剔除本研究。最終納入結(jié)核組51例，腫瘤組39例(均為原發(fā)性肺癌伴胸膜轉(zhuǎn)移病例)。兩組患者臨床資料(見表1)。腫瘤組年齡較結(jié)核組更高，結(jié)核組外周血M、ESR、IGRA、胸水ADA均高于腫瘤組(P<0.05)。

二、流式細胞檢測結(jié)果

外周血流式細胞檢測結(jié)果(見表2)。外周血CD14+單個核細胞結(jié)核組高于腫瘤組，M1型(CD14+CD86+)、M2型(CD14+CD163+)細胞兩組無顯著差異。胸水流式細胞檢測結(jié)果(見圖1、2)。胸水中結(jié)核組M1型(CD14+CD86+)更高，而腫瘤組M2型(CD14+CD163+)更多(P<0.05)，兩組CD14+單個核細胞兩組無顯著差異(P>0.05)。

表1 兩組患者臨床資料比較

表2 兩組外周血M1型(CD86+CD163-)與M2型(CD86-CD163+)巨噬細胞比例比較

三、ROC曲線分析胸水M1、M2細胞、M1/M2比例及血沉在鑒別結(jié)核性胸膜炎與惡性胸腔積液中的價值

分別對胸水M1、M2細胞、M1/M2比例及血沉繪制從惡性胸腔積液中鑒別診斷結(jié)核性胸膜炎的ROC曲線(見圖3)，四組ROC曲線參數(shù)(見表3)。

討 論

胸水中巨噬細胞的極化方向成為胸腔積液的診斷、治療研究新熱點[4]。胸腔積液可由多種原因引起，對胸腔積液中細胞成分的分析為臨床上胸腔積液的鑒別診斷提供了新的思路。巨噬細胞是胸腔積液中重要的細胞成分之一，成熟的巨噬細胞在不同因素誘導(dǎo)下可極化成為不同的亞型：經(jīng)典激活途徑活化的巨噬細胞具有吞噬殺菌、釋放促炎因子的功能，可啟動適應(yīng)性免疫應(yīng)答，清除入侵病原體和腫瘤細胞，調(diào)控Th1型免疫應(yīng)答，稱為M1型巨噬細胞，表面CD80/CD86/HLA-DR表達顯著增高。替代激活途徑活化的巨噬細胞被稱為M2型細胞，分泌大量IL-10等抑炎因子維持體內(nèi)平衡，促進Th2免疫和體液免疫，表面CD163/CD206表達顯著增高[2]。結(jié)核桿菌和惡性腫瘤細胞刺激巨噬細胞，可能導(dǎo)致巨噬細胞向不同亞型極化，本研究選用CD14標記單核巨噬細胞，以CD86標記M1型細胞，CD163標記M2型細胞，采用流式細胞術(shù)對胸腔積液中M1型(CD14+CD86+)與M2型(CD14+CD163+)分類計數(shù)，通過比較闡述不同病因下巨噬細胞的極化方向，為鑒別診斷尋找新方法。本研究中外周血M1、M2細胞兩組間無顯著差異?？赡苡捎谕庵苎袉魏思毎形醇せ罘只癁槌墒斓木奘杉毎?，故未在極化方向上表現(xiàn)出差異。胸腔積液中兩組M1、M2細胞比例有顯著差異，說明微環(huán)境中的巨噬細胞極化方向在鑒別診斷中有重要價值。

圖1 兩組胸水M1型(CD86+CD163-)與M2型(CD86-CD163+)細胞比例

表3 胸水M1、M2細胞及M1/M2比例在鑒別結(jié)核性胸膜炎與惡性胸腔積液中的價值

圖2 兩組胸水M1型(CD86+CD163-)與M2型(CD86-CD163+)細胞比較

圖3 胸水M1、M2細胞、M1/M2比例及血沉診斷結(jié)核性胸膜炎的ROC曲線

本研究發(fā)現(xiàn)結(jié)核組胸水中M1型(CD14+CD86+)細胞顯著高于腫瘤組(P<0.05)，腫瘤組胸水中M2型(CD14+CD163+)細胞顯著高于結(jié)核組(P<0.05)，說明結(jié)核性胸膜炎患者胸水中巨噬細胞向M1極化，而惡性胸腔積液患者胸水中巨噬細胞向M2極化。Tang 等[5]也發(fā)現(xiàn)M1型細胞在結(jié)核性胸膜炎胸水中>結(jié)核性胸膜炎患者外周血>健康人外周血，M2型細胞在結(jié)核性胸膜炎胸水<結(jié)核性胸膜炎外周血(P<0.05)。胸腔積液中巨噬細胞向M1極化有助于炎癥局限，殺滅病原體，控制結(jié)核感染范圍。M2型巨噬細胞在腫瘤組織中高表達[6-8]，肺癌組織中CD14+CD163+的表達與組織學(xué)惡性程度分級有關(guān)[9]，還與腫瘤預(yù)后、療效相關(guān)，M2細胞(CD14+CD163+)>12%的惡性胸腔積液患者預(yù)后更差(P<0.05)[10]。筆者認為，惡性腫瘤中CD163+高表達是由于惡性腫瘤細胞促進巨噬細胞向M2型極化，分泌抑炎因子，產(chǎn)生免疫抑制，促進腫瘤的發(fā)展。在結(jié)核性胸膜炎和惡性胸腔積液中，巨噬細胞通過調(diào)節(jié)極化方向在疾病發(fā)生中起到不同的作用，因此可以作為鑒別診斷的指標。然而不同的研究中M1型與M2型巨噬細胞占胸水CD14+單核細胞比例不同，試驗方法、熒光標記物的選擇等對結(jié)果影響大，使結(jié)果重復(fù)性差。本研究中選用胸水M1/M2比例作為鑒別診斷指標，可以減少試驗方法偏倚，重復(fù)性高。研究結(jié)果推薦以M1/M2>0.92為臨界值，結(jié)核性胸膜炎與惡性胸腔積液鑒別的敏感性84.3%，特異性94.6%。與胸水M1比例、胸水M2比例、血沉相比，胸水M1/M2比例有更高的鑒別診斷效能。

本研究發(fā)現(xiàn)巨噬細胞在結(jié)核性胸膜炎與惡性胸腔積液中發(fā)揮不同的免疫作用，與不同誘因誘發(fā)不同的極化方向有關(guān)，胸水M1/M2>0.92可用于結(jié)核性胸膜炎的鑒別診斷。然而本研究病例數(shù)量有限，僅對M1、M2型巨噬細胞的數(shù)量進行研究分析，未檢測巨噬細胞的功能及炎癥因子水平。尚需進一步研究闡明結(jié)核感染對細胞免疫功能的影響及分子機制。需要大規(guī)模的臨床試驗進一步驗證胸水M1/M2比例在結(jié)核性胸膜炎與惡性胸腔積液鑒別診斷中的價值。