miR-539通過(guò)靶向調(diào)控DCLK1抑制非小細(xì)胞肺癌的侵襲能力

陳衛(wèi)萍 朱嵩 田東波

肺癌是全球癌癥死亡的第一大原因[1]。非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)約占所有原發(fā)性肺癌病例的80%[2]，大多數(shù)NSCLC患者被診斷為晚期，預(yù)后較差[3]。 高復(fù)發(fā)率、易遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是肺癌高死亡率的主要原因。因此，闡明NSCLC侵襲、轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，對(duì)NSCLC患者的臨床治療有重要意義。microRNA(miRNA)是一類單鏈、小型非編碼RNA(長(zhǎng)度為19-25個(gè)核苷酸)，通過(guò)與靶基因的3′端非編碼區(qū)(3′-UTR)互補(bǔ)結(jié)合，調(diào)節(jié)其靶基因表達(dá)[4]。據(jù)報(bào)道，miR-539在多種癌細(xì)胞中均下調(diào)，表明其在癌癥進(jìn)展中起到關(guān)鍵的作用。然而，在肺癌范圍內(nèi)關(guān)于miR-539調(diào)節(jié)肺癌細(xì)胞侵襲、遷移的研究尚未有報(bào)道。本研究希望通過(guò)調(diào)節(jié)miR-539在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)，探究miR-539對(duì)肺癌細(xì)胞侵襲能力的影響，期望能對(duì)NSCLC的治療策略提供新的靶點(diǎn)。

資料與方法

一、材料

1. 細(xì)胞株：人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞和NCI-H1299細(xì)胞由清遠(yuǎn)市人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心保存。miR-539購(gòu)自公司。DCLK1過(guò)表達(dá)載體由清遠(yuǎn)市人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心保存。

2. 主要試劑：高糖DMEM培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基及10%胎牛血清均購(gòu)自Gibco公司。Trizol購(gòu)自天根公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑購(gòu)自Takra公司。定點(diǎn)突變?cè)噭┖匈?gòu)自南京諾唯贊公司。Dual Luciferase Reporter Assay System試劑盒購(gòu)自Promega公司。

3. 細(xì)胞培養(yǎng)：非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞采用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液; NCI-H1299采用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液。所有細(xì)胞系在37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

4. 病例來(lái)源：從GEO(Gene Expression Omnibus)數(shù)據(jù)庫(kù)下載基因微陣列表達(dá)數(shù)據(jù)GSE16025(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE16025)，該數(shù)據(jù)集使用GPL5106平臺(tái)，包含71個(gè)樣本，其中61例非小細(xì)胞肺癌組織樣本，10例正常肺組織樣本。

二、方法

1. 轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)中所用的miR-539 mimic(miR-539)、miRNA陰性對(duì)照(miR-NC)、miR-539抑制劑(anti-miR-539)、抑制劑陰性對(duì)照(anti-miR-NC)由GenePharma公司(中國(guó)上海)合成。 轉(zhuǎn)染步驟如下，將細(xì)胞接種到6孔板中，并根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)進(jìn)行轉(zhuǎn)染測(cè)定。轉(zhuǎn)染48 h后，收獲細(xì)胞用于進(jìn)一步分析研究。

2. RNA提取與熒光實(shí)時(shí)定量PCR：用TRIzol試劑(Tiagen公司，中國(guó))從培養(yǎng)的細(xì)胞和組織樣品中提取總RNA。以總RNA為模板，使用Reverse Transcription 試劑盒(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)獲得RNA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，使用Taqman MicroRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Applied Biosystems，CA，USA)獲得miRNA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。通過(guò)miScript SYBR Green PCR 試劑盒(Qiagen，Germany)和SYBR Premix Ex Taq試劑盒(TaKaRa，Japan)在ABI7500 熒光定量PCR上測(cè)量miRNA或mRNA的表達(dá)水平。U6和GAPDH分別用作內(nèi)參。數(shù)據(jù)使用2-△△Ct法計(jì)算miRNA或mRNA的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)中所用到的引物(見(jiàn)表1)。

表1 本研究所用到的引物

3. 構(gòu)建報(bào)告基因載體：合成預(yù)測(cè)為miR-539結(jié)合位點(diǎn)的DCLK1的3′UTR區(qū)的野生型序列，及相應(yīng)的3′-UTR結(jié)合點(diǎn)突變型序列，并將其結(jié)合到psi-CHECK2載體(Promega, WI, USA)中，獲得野生型psi-DCLK1-3′UTR(DCLK1-3′UTR)及突變型psi-DCLK1-3′UTR(DCLK1-3′UTR-mut)重組質(zhì)粒。

4. 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)：雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)步驟如下，將HEK-293T細(xì)胞接種到6孔板中，并根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)共轉(zhuǎn)染野生型DCLK1-3′UTR質(zhì)粒、突變型DCLK1-3′UTR-mut質(zhì)粒以及miR-539或miR-NC。溫育48 h后，使用Dual Luciferase Reporter試劑盒(Promega)評(píng)估熒光素酶活性。

5. 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：將總共5×104個(gè)肺癌A549細(xì)胞懸浮在200μl無(wú)血清培養(yǎng)基中，并接種于Transwell小室的上層。 將含有10%FBS的完全培養(yǎng)基添加到小室下層。 在37 ℃、5%CO2中孵育24 h后，將小室放入甲醇中固定15 min，吸去小室上層培養(yǎng)基并用棉簽小心擦拭干凈，去除尚未從上室遷移出的細(xì)胞。隨后將小室放入1%的結(jié)晶紫染色15 min，然后在顯微鏡下計(jì)數(shù)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、miR-539在非小細(xì)胞肺癌中低表達(dá)且與患者較差的預(yù)后負(fù)相關(guān)

通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)dbDEMC(version2.0，http://www.picb.ac.cn/dbDEMC/search.php)統(tǒng)計(jì)后證實(shí)miR-539在61例非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)量(5.49±0.15)顯著低于其在10例正常肺組織中的表達(dá)量(5.72±0.25)(t=3.79，P=3.10×10-4，見(jiàn)圖1)。同時(shí)在235例高表達(dá)miR-539的非小細(xì)胞肺癌患者和102例低表達(dá)miR-539的非小細(xì)胞肺癌患者中進(jìn)行預(yù)后分析，結(jié)果顯示miR-539高表達(dá)的非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后較好，而miR-539低表達(dá)的患者預(yù)后較差[HR=0.67(0.47～0.97)，P=0.033(見(jiàn)圖2)]。這表明miR-539在非小細(xì)胞肺癌中可能起到抑癌基因的作用。

圖1 非小細(xì)胞肺癌組織和正常肺組織中miR-539的相對(duì)表達(dá)量

二、miR-539抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞侵襲能力

在A549細(xì)胞中分別過(guò)表達(dá)miR-539、轉(zhuǎn)染miR-539抑制劑，并用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)過(guò)表達(dá)及沉默效果(圖3，4)。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在A549細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-539，A549細(xì)胞的侵襲能力相比對(duì)照組明顯降低(t=49.40，P=3.12×10-11，圖5A)。相反的，在A549細(xì)胞中沉默miR-539，A549細(xì)胞的侵襲能力較對(duì)照組顯著的增強(qiáng)(t=-58.65，P=7.93×10-12)(圖5B)。這表明，miR-539能抑制肺癌細(xì)胞A549的侵襲能力。

圖2 miR-539對(duì)非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后的影響

圖3 用miR-539 mimics轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后miR-539的表達(dá)變化

圖4 用anti-miR-539轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后miR-539的表達(dá)變化

圖5 miR-539對(duì)肺癌細(xì)胞侵襲能力的影響(×100)

三、miR-539靶向調(diào)控DCLK1

為了尋找miR-539抑制肺癌A549細(xì)胞侵襲能力的原因，首先通過(guò)在線軟件microRNA.org(http://www.microrna.org/microrna/getGeneForm.do)預(yù)測(cè)miR-539的潛在靶基因。我們發(fā)現(xiàn)DCLK1的3′UTR區(qū)存在miR-539的結(jié)合位點(diǎn)(見(jiàn)圖6)。其次在A539細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-539，用熒光定量PCR的方法檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-539可顯著降低DCLK1的表達(dá)(F=115.87，P=7.93×10-4)(見(jiàn)圖7)。為了證明DCLK1的表達(dá)水平降低是由miR-539直接結(jié)合所導(dǎo)致，我們構(gòu)建了野生型DCLK1-3′UTR載體，以及與miR-539結(jié)合位點(diǎn)突變的DCLK1-3′UTR-mut載體，并開(kāi)展了雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)。在HEK-293T細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-539可明顯下調(diào)野生型DCLK1-3′UTR的熒光素酶活性(P=1.03×10-6)(圖8)，但是對(duì)突變型DCLK1-3′UTR-mut的熒光素酶活性沒(méi)有影響(P>0.05)(圖8)。這表明miR-539可以直接靶向抑制DCLK1的表達(dá)。

圖6 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)DCLK1的3′UTR區(qū)存在miR-539的結(jié)合位點(diǎn)

圖7 過(guò)表達(dá)miR-539對(duì)肺癌A549細(xì)胞DCLK1表達(dá)量的影響

圖8 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)miR-539對(duì)DCLK1相對(duì)熒光素酶活性的影響 注：***P<0.0001

討 論

已有的研究表明，miRNA在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后水平上充當(dāng)基因表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，與人類腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[5]。表達(dá)失調(diào)的miRNA充當(dāng)腫瘤抑制因子或致癌基因，以調(diào)節(jié)大多數(shù)人類癌癥的發(fā)生和發(fā)展[6-8]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，某些miRNA可用作肺癌的預(yù)后生物標(biāo)志物和潛在治療靶標(biāo)[9-10]。

先前的報(bào)道表明，miR-539在多種惡性腫瘤中均表現(xiàn)為抑癌作用，包括神經(jīng)膠質(zhì)瘤[11]、肝細(xì)胞癌[12]、結(jié)直腸癌[13]、鼻咽癌[14]和乳腺癌[15]。Jin H也報(bào)道說(shuō)，miR-539能夠通過(guò)靶向基質(zhì)金屬蛋白酶8抑制骨肉瘤細(xì)胞的侵襲和遷移[16]。本研究首先分析數(shù)據(jù)庫(kù)資料，發(fā)現(xiàn)miR-539在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)量顯著低于其在癌旁組織中的表達(dá)量。在細(xì)胞水平研究發(fā)現(xiàn)，miR-539在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)量顯著低于正常肺上皮細(xì)胞。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-539抑制肺癌細(xì)胞A549的侵襲能力。這些結(jié)果表明，miR-539在肺癌發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮抑癌作用。

miRNA對(duì)腫瘤細(xì)胞功能的調(diào)控，一般來(lái)自對(duì)靶基因的調(diào)節(jié)[17]。為進(jìn)一步研究miR-539抑制肺癌細(xì)胞A549侵襲能力的機(jī)制，我們利用 microRNA.org預(yù)測(cè)miR-539的潛在靶基因，觀察到DCLK1是miR-539的潛在靶基因。DCLK1又稱雙腎上腺皮質(zhì)激素樣激酶-1，它是蛋白激酶超家族和雙皮質(zhì)素家族的重要成員[18]。已有研究表明DCLK1參與了腫瘤上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)過(guò)程[19]。EMT常常伴隨著細(xì)胞形態(tài)和行為的顯著變化，影響細(xì)胞增殖、分化、粘附和遷移能力； 此外，EMT 可以增強(qiáng)癌細(xì)胞的遷移和侵襲特性，并與誘導(dǎo)腫瘤干細(xì)胞特性相關(guān)[20-21]。Ikezono報(bào)道，胰腺癌細(xì)胞中，DCLK1通過(guò)上調(diào)EMT相關(guān)基因Slug、N-Cadherin，促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的遷移、侵襲能力[22]。本研究通過(guò)熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)與突變型DCLK1-3′UTR-mut報(bào)告基因相比，miR-539顯著降低了野生型DCLK1-3′UTR-WT報(bào)告基因的熒光素酶活性。說(shuō)明miR-539可能是通過(guò)下調(diào)DCLK1發(fā)揮抑癌功能的。基于以上研究結(jié)果，推測(cè)miR-539對(duì)肺癌細(xì)胞侵襲能力的抑制作用，可能是通過(guò)靶向抑制DCLK1的表達(dá)，從而間接調(diào)節(jié)EMT而實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，我們首先發(fā)現(xiàn)miR-539在非小細(xì)胞肺癌中低表達(dá)，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-539能抑制肺癌細(xì)胞的侵襲能力，其作用機(jī)制可能是通過(guò)靶向沉默DCLK1，間接調(diào)節(jié)EMT而抑制肺癌細(xì)胞的侵襲能力。miR-539可能是肺癌發(fā)展中的抑癌基因，能否為肺癌的治療策略提供了新的靶點(diǎn)，還有待進(jìn)一步探討。