肺泡灌洗液流式細(xì)胞學(xué)、HRCT在兒童重癥肺炎的應(yīng)用

楊偉健 詹文麗 唐遠(yuǎn)平 劉永熙 朱歡歡 吳松 鄭亦男

肺炎是兒童的常見病[1]，病因多樣，有感染、過敏、系統(tǒng)性疾病(如先天性心臟病、免疫缺陷、風(fēng)濕性疾病)和圍生發(fā)育相關(guān)的原因。臨床有迫切的診斷壓力。目前國內(nèi)外推薦臨床-影像-病理多學(xué)科聯(lián)合的診斷模式[2-4]。兒科由于器械、麻醉風(fēng)險(xiǎn)等，肺組織病理開展不及成人普遍。支氣管肺泡灌洗安全性較高，灌洗液細(xì)胞、非細(xì)胞成分可行細(xì)胞學(xué)、分子生物學(xué)檢測(cè)。灌洗液細(xì)胞分類的傳統(tǒng)方法是染色后人工計(jì)數(shù)[5-7]，流式細(xì)胞學(xué)目前國內(nèi)外研究較少[8]，兒童缺乏正常參考值。本研究回顧性分析肺泡灌洗流式細(xì)胞學(xué)、胸部HRCT，探討其在兒童重癥肺炎中的應(yīng)用價(jià)值。

資料與方法

一、研究對(duì)象

收集2018年9月4日至2019年5月7日廣東省婦幼保健院(廣東省兒童醫(yī)院)兒童重癥醫(yī)學(xué)科40例重癥肺炎的臨床資料。設(shè)置對(duì)照組：異物取出術(shù)后復(fù)查10例，復(fù)查時(shí)間在術(shù)后3～5天。依據(jù)《兒科學(xué)(第九版)》診斷標(biāo)準(zhǔn)，支氣管肺炎：呼吸道癥狀、體征及肺部影像改變[9]。重癥肺炎：支氣管肺炎合并呼吸困難、呼吸衰竭、需要呼吸支持或存在休克及其他系統(tǒng)損害[10]。本研究通過廣東省婦幼保健院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(廣東省婦幼保健院醫(yī)學(xué)倫理201801085)，監(jiān)護(hù)人均知情同意并簽署知情同意書。

二、方法

1 支氣管鏡檢查：支氣管鏡檢查適應(yīng)癥、肺泡灌洗參考2018年國家衛(wèi)生健康委員會(huì)人才交流服務(wù)中心兒科呼吸內(nèi)鏡診療技術(shù)專家組的指南[11]。設(shè)備采用奧林巴斯外徑2.8 mm電子支氣管鏡。肺泡灌洗：0.9%氯化鈉溶液1～2 mL/kg灌洗實(shí)變肺段或支氣管開口堵塞的葉段，回收率50%左右。黏膜炎癥：黏膜充血/水腫/縱行皺襞。

2 HRCT檢查：廣東省婦幼保健院2名副主任醫(yī)師以上職稱放射科醫(yī)生對(duì)胸部HRCT作描述、診斷。實(shí)質(zhì)改變：毛玻璃樣密度不均的致密影；片狀密度均勻的致密影，存在支氣管充氣征。間質(zhì)病變：支氣管血管束增粗、小葉核心的結(jié)節(jié)或樹芽征、小葉核心的支氣管顯影、小葉內(nèi)的線網(wǎng)影、小葉間隔增厚及胸膜葉裂增厚[4, 12-13]。其他：實(shí)質(zhì)、間質(zhì)病變皆有/肺不張/肺氣腫/胸腔積液、積氣。

3 影像學(xué)分組：中心氣道改變(CAL)：氣管/左右主支氣管/右中間支氣管的支氣管鏡下黏膜炎癥+HRCT支氣管血管束增粗[14-16]。次級(jí)肺小葉改變(SPLL)：氣管、左右主支氣管及右中間支氣管的支氣管鏡下無黏膜炎癥+HRCT次級(jí)肺小葉改變(小葉核心的結(jié)節(jié)或樹芽征/小葉核心的支氣管顯影/小葉內(nèi)的線網(wǎng)影/小葉間隔增厚/實(shí)質(zhì)改變)[12, 17]。

5 實(shí)驗(yàn)室檢查：廣東省婦幼保健院檢驗(yàn)科完成肺泡灌洗液傳統(tǒng)培養(yǎng)、血常規(guī)及血清學(xué)檢查(免疫球蛋白IgM：呼吸道合胞病毒、腺病毒、流感病毒A、流感病毒B、副流感病毒、肺炎衣原體、嗜肺軍團(tuán)菌-血清1型及肺炎支原體)。廣東省婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳中心完成外周血T淋巴亞群分類、肺泡灌洗液熒光定量RT-PCR(巨細(xì)胞病毒、EB病毒、肺炎支原體、結(jié)核分支桿菌、人腸道病毒、呼吸道合胞病毒、博卡病毒及人鼻病毒)。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：使用GraphPad Prism 7.04統(tǒng)計(jì)分析。非正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)表示，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)，多組比較采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)，組間相關(guān)性分析采用Spearman Correlation；計(jì)數(shù)資料以百分比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、一般資料

重癥肺炎共40例，男27例，女13例，年齡中位數(shù)6個(gè)月(1～108個(gè)月)，體重中位數(shù)7 kg(3～30kg)。病程2周以上13例(32.5%)，ICU停留時(shí)間7天(1～38天)。對(duì)照組共10例，男6例，女4例，年齡中位數(shù)18個(gè)月(11～73個(gè)月)，體重中位數(shù)12 kg(9～23 kg)。

二、肺泡灌洗液流式細(xì)胞學(xué)

1 細(xì)胞分類(見表1)。

2 T淋巴亞群分類(見表2)。

3 相關(guān)性分析：(1)不同影像學(xué)分組(中心氣道改變/次級(jí)肺小葉改變)BALF N%的相關(guān)性(見圖1)。(2)肺泡灌洗液與外周血之間的細(xì)胞學(xué)相關(guān)性(見表3、4)。

表1 肺泡灌洗液的細(xì)胞分類

表2 肺泡灌洗液的T淋巴細(xì)胞亞群

圖1 中心氣道改變、次級(jí)肺小葉改變關(guān)于BALF N%的相關(guān)性

表3 肺泡灌洗液與外周血間細(xì)胞分類的相關(guān)性

表4 肺泡灌洗液與外周血間T淋巴亞群分類的相關(guān)性

三、影像學(xué)

40例患兒完成胸部HRCT和支氣管鏡檢查。HRCT：實(shí)質(zhì)改變8例(20%)，間質(zhì)改變14例(35%)，其他18例(45%)。支氣管鏡檢查：黏膜炎癥21例(53%)，腔內(nèi)分泌物14例(35%)，塑形性支氣管炎3例(8%)，心血管外壓3例(8%)，支氣管軟化2例(5%)，支氣管狹窄2例(5%)。中心氣道改變13例(33%)，次級(jí)肺小葉改變17例(43%)。

四、病原學(xué)

1 分類：混合感染16例(40%)，單純病毒感染9例(22.5%)，單純細(xì)菌感染6例(15%)，單純肺炎支原體感染3例(7.5%)，病原學(xué)陰性6例(15%)。

圖2 中心氣道改變與次級(jí)肺小葉改變的細(xì)菌感染差異

圖組與組的病毒感染差異

討 論

肺泡灌洗取材是在病變的葉段支氣管開口部署支氣管鏡，灌洗生理鹽水，范圍呈圓錐形向遠(yuǎn)端肺組織鋪開，深度達(dá)次級(jí)肺小葉水平。疾病狀態(tài)下灌洗液有細(xì)胞學(xué)特征，故有學(xué)者稱肺泡灌洗是“液體肺活檢”。本研究應(yīng)用流式細(xì)胞學(xué)分析了巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞(包括亞群)及嗜酸性粒細(xì)胞在肺炎急性期灌洗液中的比例。正常人的巨噬細(xì)胞游走于肺泡隔、肺泡腔內(nèi)，是肺泡灌洗液的主要細(xì)胞，占比超85%。中性粒、淋巴及嗜酸性粒細(xì)胞是肺臟在感染、過敏、損傷等侵害時(shí)的免疫細(xì)胞[8]，他們比例異常，提示不同類型的免疫應(yīng)答，提示鑒別診斷信息[5]。本研究重癥肺炎兒童肺泡灌洗液的中性粒細(xì)胞升高42.6%(2.0%～92.8%)，對(duì)應(yīng)外周血沒有相關(guān)性(見表3)。兒童血常規(guī)中，白細(xì)胞有生理性的比例特點(diǎn)，有時(shí)中性粒細(xì)胞升高臨床并不容易察覺。正常人中性粒細(xì)胞極少在肺泡腔或氣道內(nèi)，所以肺泡灌洗取材更容易發(fā)現(xiàn)細(xì)胞學(xué)異常，反映炎癥程度。

近年臨床應(yīng)用肺泡灌洗液細(xì)胞分類的數(shù)據(jù)源于美國胸科學(xué)會(huì)對(duì)非吸煙健康成人的多中心研究。其方法為染色人工計(jì)數(shù)[5]。流式細(xì)胞學(xué)的原理是通過抗原抗體反應(yīng)標(biāo)識(shí)細(xì)胞，較具特異性，相比傳統(tǒng)方法，可減少人為誤判。2015年美國一項(xiàng)研究應(yīng)用流式細(xì)胞學(xué)分析健康志愿者的肺泡灌洗液、捐獻(xiàn)者(無肺部疾病、吸煙史)胸膜下肺組織的細(xì)胞學(xué)[8]，提供了實(shí)驗(yàn)方法及相關(guān)數(shù)據(jù)?？紤]到其樣品量較少，且數(shù)據(jù)與傳統(tǒng)方法相近，故本研究僅參考其實(shí)驗(yàn)方法，正常范圍仍參考美國胸科學(xué)會(huì)的數(shù)據(jù)。

本研究中肺泡灌洗液N%升高，次級(jí)肺小葉改變對(duì)比中心氣道改變，N%更高(表1)，正相關(guān)(圖1)，且細(xì)菌感染率更高(圖2)。文獻(xiàn)報(bào)道，肺泡灌洗液的中性粒細(xì)胞升高見于細(xì)菌或真菌的化膿性感染[5, 19-20]、遷延性細(xì)菌性支氣管炎[21-23]、呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎[24]、急性肺損傷[25-26]及特發(fā)性肺纖維化[20, 27]。所以在臨床綜合考慮為感染性病例時(shí)，細(xì)胞學(xué)表現(xiàn)可為臨床提供病原學(xué)考慮傾向。傳統(tǒng)培養(yǎng)的敏感性，受較多因素影響，如病原體活性、數(shù)量、培養(yǎng)環(huán)境及抗生素使用，陽性率一般在30～40%。細(xì)菌培養(yǎng)至少要2～3天，真菌培養(yǎng)需要1周甚至更多。流式細(xì)胞學(xué)報(bào)告在取材后數(shù)小時(shí)可獲得。因此肺泡灌洗液送病原學(xué)檢查，同時(shí)送流式細(xì)胞學(xué)檢查，可早期獲得有用的鑒別診斷信息，有利于重癥兒童的救治。

淋巴細(xì)胞來源胸腺、骨髓，大量儲(chǔ)備在淋巴器官組織。沒有抗原刺激，不會(huì)異常增多。異常增多或T淋巴亞群比例異常，通常提示免疫失調(diào)，在過敏性疾病、良惡性淋巴增生性疾病和病毒感染方面具有較大的鑒別意義。本研究肺泡灌洗液T淋巴亞群與外周血T淋巴亞群具有正相關(guān)性(表4)?？赡芴崾荆?)肺泡灌洗液T淋巴亞群分類的適應(yīng)證、結(jié)果判讀可參考外周血T淋巴亞群分類[28-29]。2)發(fā)現(xiàn)外周血淋巴細(xì)胞明顯升高時(shí)，需進(jìn)一步完善淋巴亞群分類?；純号R床表現(xiàn)以肺部為主的，考慮肺泡灌洗液T淋巴亞群分類。

本研究重癥肺炎病例均完善HRCT、支氣管鏡檢查。支氣管鏡下診斷，直觀反映從大氣道至3～4級(jí)支氣管的腔內(nèi)表現(xiàn)，解剖上屬于導(dǎo)氣部間質(zhì)。其中黏膜炎癥、腔內(nèi)分泌物最常見，辨別塑形性支氣管炎、管腔軟化和狹窄具有動(dòng)態(tài)觀察的優(yōu)勢(shì)。HRCT應(yīng)用價(jià)值有：1)提供診斷信息。HRCT展現(xiàn)從中心氣道至次級(jí)肺小葉水平，從實(shí)質(zhì)到間質(zhì)，補(bǔ)充支氣管鏡在次級(jí)肺小葉水平、管腔外結(jié)構(gòu)的診斷劣勢(shì)[32]。本研究有相當(dāng)?shù)牟±蒆RCT發(fā)現(xiàn)肺不張、肺氣腫及胸膜腔積液/積氣的肺炎并發(fā)癥。所以結(jié)合HRCT和支氣管鏡檢查，使肺炎患兒獲得更全面的定位和定性影像學(xué)診斷。2)引導(dǎo)介入操作。本研究所有病例均在支氣管鏡檢查前完成胸部HRCT，優(yōu)化取材，規(guī)避風(fēng)險(xiǎn)。

綜上所述，肺泡灌洗液流式細(xì)胞學(xué)、胸部HRCT均屬于間接證據(jù)，從解剖分布、細(xì)胞水平反映肺臟受侵害時(shí)病灶的表現(xiàn)，幫助鑒別感染/非感染病灶。隨著細(xì)胞標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，更多細(xì)化的流式細(xì)胞學(xué)將服務(wù)于重癥兒童。