血清γ-干擾素誘導(dǎo)蛋白10對(duì)活動(dòng)性肺結(jié)核的診斷價(jià)值

張雪 沙玉霞 周浩泉 潘家華 朱孝武 郇霞 王華

2017年全球新發(fā)結(jié)核病患者約1000萬(wàn)，小于15歲兒童占到10%，發(fā)病高峰年齡為0～4歲和16～24歲[1]。雖然目前我國(guó)已普及卡介苗的接種，仍未阻止兒童青少年結(jié)核病的發(fā)生，其臨床特征極不典型，常被誤診誤治，且無(wú)有效快速檢測(cè)診斷手段。有研究[2-3]指出成人活動(dòng)性肺結(jié)核或結(jié)核性胸膜炎、結(jié)核性腦膜炎患者血漿和胸腔積液、腦脊液中γ-干擾素誘導(dǎo)蛋白10(Interferon induced protein 10,IP-10)水平升高明顯，并提出利用IP-10的檢測(cè)可作為結(jié)核病的早期診斷依據(jù)，但是關(guān)于IP-10對(duì)兒童青少年結(jié)核感染診斷價(jià)值相關(guān)報(bào)道甚少。本文通過(guò)對(duì)兒童青少年肺結(jié)核和非結(jié)核感染者進(jìn)行IP-10檢測(cè)和結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)(T-SPOT)，以探討IP-10在兒童青少年活動(dòng)性肺結(jié)核的臨床診斷意義。

資料與方法

一、研究對(duì)象

(1)活動(dòng)性肺結(jié)核組：2018年3月-2019年2月就診于山南市人民醫(yī)院感染科和安徽省立醫(yī)院感染科、安徽省胸科醫(yī)院結(jié)核科確診肺結(jié)核兒童青少年92人。納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有肺結(jié)核病例的診斷在流行病學(xué)、臨床癥狀、體征、胸部影像學(xué)表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室檢查等方面均嚴(yán)格遵守《肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)WS 288-2017》診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]，②獲得患兒或其監(jiān)護(hù)人書(shū)面知情，③入組對(duì)象依從性良好；(2)對(duì)照組：同期于山南市人民醫(yī)院和安徽省立醫(yī)院體檢的無(wú)活動(dòng)性結(jié)核病兒童青少年107人。納入標(biāo)準(zhǔn)：①結(jié)核病癥狀篩查陰性，PPD試驗(yàn)及胸片均陰性，并結(jié)合其他輔助檢測(cè)方法隨訪(fǎng)跟蹤一年后未提示結(jié)核感染，②獲得患兒或其監(jiān)護(hù)人書(shū)面知情，③入組對(duì)象依從性良好。排除標(biāo)準(zhǔn)：患肺外結(jié)核病者，患有乙型肝炎、艾滋病、免疫缺陷病或其他疾病需激素治療者，參與其他臨床研究者。

本研究經(jīng)安徽省立醫(yī)院、安徽省胸科醫(yī)院、西藏山南市人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過(guò)，所有入組者均簽署知情同意書(shū)。入組年齡7～18歲，男105例(52.8%)，女94例(47.2%)，平均年齡(13.6±2.2)歲；兩組在種族、性別、年齡之間，經(jīng)比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

二、方法

1 血標(biāo)本采集：所有研究對(duì)象均采集外周靜脈血2 mL，4℃放置過(guò)夜后，4℃5000 rpm，離心10 min，分離血清，裝于EP管，于-20℃貯存，進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)IP-10；同時(shí)合肥地區(qū)肺結(jié)核組43例和對(duì)照組50例亦采取肝素抗凝外周新鮮血4 mL，以進(jìn)行結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)(T-SPOT)檢測(cè)。

2 試劑來(lái)源：CXCL10 ELISA試劑盒購(gòu)于Abnova公司(貨號(hào)KA：2004)。T-SPOT.TB試劑盒來(lái)自上海復(fù)星高科技集團(tuán)，淋巴細(xì)胞分離液來(lái)自北京索萊寶科技有限公司。

3 操作步驟：IP-10檢測(cè)方法：采用酶聯(lián)免疫方法，取ELISA試劑盒中的96孔板，分別設(shè)定好標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)孔中加入預(yù)先準(zhǔn)備好的標(biāo)準(zhǔn)品100 μL，樣品孔分別加入100 μL樣品，空白對(duì)照孔加入100 μL的樣品稀釋液，37℃孵育90 min，吸凈液體，每孔中加入生物素化的IP-10抗體，37℃孵育60 min，洗滌緩沖液洗3次，每孔中加入100 μL的親和素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物，37℃孵育30 min，洗滌緩沖液洗五次，每孔加入90 μL的顯色劑，室溫避光孵育30 min，每孔加入100 μL的終止液，30 min內(nèi)使用酶標(biāo)儀在492nm處檢測(cè)吸光度，進(jìn)行結(jié)果分析。

血T-SPOT檢測(cè)方法：采用體外釋放酶聯(lián)免疫法，由研究人員在4 h內(nèi)完成肝素抗凝外周新鮮血4 mL進(jìn)行T-SPOT.TB檢測(cè)。首先按照試劑盒說(shuō)明書(shū)快速分離淋巴細(xì)胞，配制每100 μL含有25萬(wàn)個(gè)細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)溶液500 μL進(jìn)行外周血單個(gè)核細(xì)胞的收集與計(jì)數(shù)，參照試劑盒使用說(shuō)明書(shū)檢測(cè)步驟操作，記錄每個(gè)反應(yīng)孔內(nèi)深藍(lán)色清晰的斑點(diǎn)，分析結(jié)果。目視法判定標(biāo)準(zhǔn):陽(yáng)性對(duì)照孔內(nèi)斑點(diǎn)數(shù)≥20個(gè)視為實(shí)驗(yàn)有效；陰性對(duì)照孔內(nèi)斑點(diǎn)數(shù)為≤5個(gè)，任一實(shí)驗(yàn)孔內(nèi)斑點(diǎn)數(shù)-陰性孔斑點(diǎn)數(shù)≥6個(gè)，認(rèn)定結(jié)果為陽(yáng)性；若陰性對(duì)照孔內(nèi)斑點(diǎn)數(shù)≥6個(gè)，任一實(shí)驗(yàn)孔內(nèi)斑點(diǎn)數(shù)≥陰性孔斑內(nèi)點(diǎn)數(shù)×2，認(rèn)定結(jié)果為陽(yáng)性；若任一實(shí)驗(yàn)孔內(nèi)斑點(diǎn)數(shù)<20個(gè)，且陽(yáng)性對(duì)照孔內(nèi)斑點(diǎn)數(shù)≥20個(gè)，認(rèn)定結(jié)果為陰性。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、活動(dòng)性肺結(jié)核組和對(duì)照組比較

活動(dòng)性肺結(jié)核組IP-10濃度(295.55±21.69 pg/mL)明顯高于對(duì)照組(44.46±4.32 pg/mL)，差異具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(見(jiàn)表1)。

二、IP-10在活動(dòng)性肺結(jié)核診斷臨界值及ROC曲線(xiàn)

從ROC曲線(xiàn)得出，曲線(xiàn)下面積(AUC)0.921，IP-10的ROC曲線(xiàn)下面積95%可信區(qū)間為(0.882～0.960)。IP-10診斷活動(dòng)性肺結(jié)核的臨界濃度值為155.82 pg/mL，取臨界值時(shí)，其診斷活動(dòng)性肺結(jié)核的敏感性為75.5%，特異性為95.9%，Yonden指數(shù)(特異性+敏感性-1)為0.714，表明IP-10可作為活動(dòng)性肺結(jié)核的診斷指標(biāo)(見(jiàn)圖1)。

表1 肺結(jié)核組和對(duì)照組IP-10測(cè)定結(jié)果

圖1 IP-10的ROC曲線(xiàn)

三、血IP-10和血T-SPOT檢測(cè)對(duì)活動(dòng)性肺結(jié)核的敏感性、特異性結(jié)果比較

結(jié)合圖1，取血IP-10臨界診斷值時(shí)敏感性(75.5%)、特異性(95.9%) ，其在92例肺結(jié)核組和107例非結(jié)核感染對(duì)照組真陽(yáng)性者69例，真陰性者103例。與血T-SPOT檢測(cè)結(jié)果比較顯示血IP-10敏感性(75.5%)低于血T-SPOT(90.7%)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)比較χ2值=4.513，P=0.034；其特異性(95.9%) 明顯高于血T-SPOT(84%) ，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)比較χ2值=7.258，P=0.019(見(jiàn)表2)。

表2 活動(dòng)性肺結(jié)核血IP-10和血T-SPOT的敏感性、特異性比較

討 論

兒童青少年是社會(huì)發(fā)展和進(jìn)步的重要階梯部分，其感染結(jié)核分枝桿菌后起病隱襲、進(jìn)展慢，臨床醫(yī)生對(duì)該年齡段結(jié)核病的認(rèn)識(shí)不足，檢查檢驗(yàn)方法的靈敏度和特異性低，難以獲得結(jié)核分枝桿菌的陽(yáng)性結(jié)果，臨床診斷較困難。兒童青少年肺結(jié)核的延遲診斷可能造成學(xué)校和幼兒園等環(huán)境出現(xiàn)結(jié)核病傳播的危害，造成學(xué)校聚集性爆發(fā)。多數(shù)兒童和青少年感染結(jié)核桿菌后未得到及時(shí)診治，引起粟粒性肺結(jié)核、肺外結(jié)核病等嚴(yán)重感染，不同程度的影響其生長(zhǎng)發(fā)育、學(xué)業(yè)和未來(lái)工作，是引起成年后結(jié)核病的主要因素，也是評(píng)估一個(gè)國(guó)家未來(lái)結(jié)核病控制情況，因此對(duì)于兒童青少年結(jié)核病需要早期發(fā)現(xiàn)、及時(shí)規(guī)律治療。

IP-10是由IFN-γ誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種趨化因子，參與遲發(fā)性超敏反應(yīng)，趨化活化T細(xì)胞至炎癥感染部位，擴(kuò)大Th1反應(yīng)，增加γ干擾素基因表達(dá)等參與疾病發(fā)生發(fā)展，趨化CXCR3+細(xì)胞到炎癥部位發(fā)揮抗炎或促炎作用、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及增殖、抑制新生血管形成、抗病毒等，其靶向治療已應(yīng)用到臨床。有研究[5]指出結(jié)核分枝桿菌感染者可分泌大量IP-10以趨化各種炎癥細(xì)胞和炎癥因子，提出其可作為結(jié)核感染及活動(dòng)性結(jié)核病診治和評(píng)估療效的生物學(xué)指標(biāo)。2014年Latorre等[6]指出IFN-γ結(jié)合IP-10檢測(cè)有助于診斷兒童活動(dòng)性肺結(jié)核和潛伏性結(jié)核感染，IP-10是診斷兒童結(jié)核病的一個(gè)精確生物標(biāo)志物。

本研究顯示在兒童青少年肺結(jié)核患者中IP-10濃度(295.55±21.69 pg/mL)明顯高于對(duì)照組(44.46±4.32 pg/mL)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與張迪等[7]對(duì)成人結(jié)核病的研究結(jié)果一致，但與一項(xiàng)<5歲兒童結(jié)核感染的研究[8]結(jié)果不同，提示兒童青少年活動(dòng)性肺結(jié)核IP-10水平與成人相仿，可能與兒童青少年機(jī)體細(xì)胞與體液免疫功能已達(dá)成人水平有關(guān)，IP-10水平可能存在一定的年齡依賴(lài)性。本研究IP-10曲線(xiàn)下面積(AUC)大于0.9，IP-10的ROC曲線(xiàn)下面積95%可信區(qū)間為(0.882～0.960)，其診斷活動(dòng)性肺結(jié)核的臨界濃度值為155.82 pg/mL，敏感性為75.5%，特異性為95.9%，Yonden指數(shù)(特異性+敏感性-1)為0.714，表明IP-10可作為兒童青少年活動(dòng)性肺結(jié)核的輔助診斷指標(biāo)，與Mamishi Setareh等[9]觀點(diǎn)一致。

T- SPOT.TB檢測(cè)原理是通過(guò)分離外周血MTB特異性T細(xì)胞，經(jīng)體外培養(yǎng)和抗原再次刺激后分泌IFN-γ,以相應(yīng)抗體檢驗(yàn)IFN-γ濃度來(lái)診斷是否存在MTB感染，但是易受到外周血T淋巴細(xì)胞數(shù)量的影響[10]，多數(shù)研究均指出T-SPOT敏感性和特異性明顯高于TST，但是其敏感性和特異性仍有爭(zhēng)議[11]。2008-2017年湖南省兒童醫(yī)院結(jié)核病住院患兒多為3～12歲兒童，肺結(jié)核T-SPOT.TB檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性率(82.26%)高于肺外結(jié)核(52.86%)[12]。有研究[13]提出血IP-10與IFN-γ聯(lián)合檢測(cè)能夠提高潛伏性結(jié)核感染的臨床診斷，并可用于其臨床療效的評(píng)估。本研究結(jié)果顯示血IP-10敏感性(75.5%)低于血T-SPOT(90.7%)，但其特異性(95.9%)明顯高于血T-SPOT(84%)，提示血IP-10可作為臨床診斷活動(dòng)性肺結(jié)核輔助檢測(cè)指標(biāo)，與T-spot聯(lián)合有助于提高臨床診斷及鑒別診斷，以減少臨床漏診和誤診。

綜上所述，本研究肺結(jié)核組IP-10濃度明顯高于對(duì)照組，提示IP-10可作為兒童青少年活動(dòng)性肺結(jié)核的輔助診斷指標(biāo)，ROC曲線(xiàn)提示IP-10診斷活動(dòng)性肺結(jié)核的特異性高于T-SPOT，與T-SPOT聯(lián)合應(yīng)用能夠快速準(zhǔn)確診斷兒童青少年活動(dòng)性肺結(jié)核，關(guān)于IP-10臨床應(yīng)用以及聯(lián)合T-SPOT對(duì)兒童青少年結(jié)核病的臨床價(jià)值可通過(guò)進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行探討。