響應(yīng)面法優(yōu)化糜子油提取率

金 燦，李克虎，Harold Corke，降彥苗?

（1. 上海交通大學(xué) 農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院 食品科學(xué)與工程系，上海 200240；

2. 河北省農(nóng)林科學(xué)院 谷子研究所，河北 石家莊 050035；3. 貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 生物技術(shù)系，貴州 貴陽 550025）

糜子（Panicum miliaceumL.）俗稱大黃米，屬于禾本科植物，被認(rèn)為是人類歷史上最早馴化的谷物之一[1]。其籽粒富含淀粉、蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素和礦物質(zhì)，多酚和纖維素也含量豐富[2-3]。有研究表明糜子油主要含亞油酸、油酸、棕櫚酸、硬脂酸和亞麻酸[4]，Shen等的研究也表明，糜子油脂肪酸組成主要以不飽和脂肪酸為主[5]。膳食中攝入不飽和脂肪酸可以有效降低患心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)[6]。隨著國民生活水平的不斷提高，人們越來越重視日常食用油的營養(yǎng)價(jià)值和質(zhì)量安全，對食用油多樣化的需求明顯提高，市場上已經(jīng)涌現(xiàn)出山茶油、紅花籽油、核桃油等多種多樣的食用油產(chǎn)品[7]。當(dāng)前糜子產(chǎn)品結(jié)構(gòu)單一，為了提升糜子的產(chǎn)品附加值，糜子油在食品及非食品工業(yè)中的應(yīng)用值得探索。

目前，對糜子油的提取工藝研究不多。響應(yīng)面法（Response Surface Methodology）是以數(shù)學(xué)科學(xué)為原理，利用統(tǒng)計(jì)方法，對所研究響應(yīng)值進(jìn)行優(yōu)化，響應(yīng)值的結(jié)果受多個變量影響。響應(yīng)面法在許多研究領(lǐng)域都有非常廣泛的應(yīng)用，涵蓋生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、生態(tài)學(xué)、食品學(xué)、工程學(xué)等多個領(lǐng)域[8]。響應(yīng)面法在食品領(lǐng)域中的應(yīng)用主要有兩個方面：確定食品中各組分的相互作用已經(jīng)確定各成分的比例、確定最優(yōu)反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)旨在采用響應(yīng)面法，以糜子油提取率為指標(biāo)，明確液料比、提取溫度及提取時間對糜子油得率的影響，確定實(shí)驗(yàn)室索氏提取糜子油的最佳工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

糜子：寧夏固原；石油醚（分析純）：上海麥克林生化科技有限公司；礱谷機(jī)（JLG-ⅡA）：中儲糧成都儲藏研究院有限公司；高速粉碎機(jī)（HC-700Y）：永康市天祺盛世工貿(mào)有限公司；脂肪測定儀（SZC-101）：上海纖檢儀器有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9030A）：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；電子天平（LE204E/02）：梅特勒-托利多儀器上海有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 糜子油提取方法

將糜子籽粒用礱谷機(jī)脫去外殼，烘干至恒重后，用高速粉碎機(jī)將糜子籽粒打成粉末狀備用。用濾紙準(zhǔn)確稱取2 g（精確到0.001 g）糜子粉，包裹后放入濾紙筒。將樣品放入脂肪測定儀并打開循環(huán)冷凝水，樣品杯中加入一定比例的石油醚，在脂肪測定儀上經(jīng)過浸泡 30 min、淋洗 30 min、回收15 min、蒸干10 min后取出浸提杯，于130 ℃下烘干40 min。然后，取出樣品杯進(jìn)行稱重，計(jì)算糜子油的得率。重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)，計(jì)算得率的平均值。

式中：M1為提取后樣品杯與油的質(zhì)量（g）；M0為提取前空的樣品杯的質(zhì)量（g）；M為樣品糜子粉末的質(zhì)量（g）。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 液料比對石油醚提取糜子油得率的影響設(shè)置提取溫度75 ℃，提取時間20 min，研究液料比（V/M）分別為5、10、15、20、25、30 mL/g時，對糜子油得率的影響。

索氏提取法：用濾紙準(zhǔn)確稱取 2 g（精確到0.001 g）糜子粉，包裹后放入濾紙筒，放入脂肪測定儀并打開循環(huán)冷凝水，每個樣品杯中加入一定比例的石油醚，打開脂肪提取儀進(jìn)行四個階段的溫度和時間設(shè)置：（1）浸泡：55 ℃，30 min；（2）淋洗：75 ℃，20 min；（3）回收：95 ℃，15 min；（4）蒸干：110 ℃，10 min。在液料比（V/M）分別為5、10、15、20、25、30 mL/g的條件下進(jìn)行6個不同提取條件的提取實(shí)驗(yàn)。然后，取出樣品杯進(jìn)行稱重，計(jì)算糜子油的得率。每個提取條件下重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)，記錄得率的平均值。

1.2.2.2 提取時間對石油醚提取糜子油得率的影響 當(dāng)提取溫度為 80 ℃，液料比（V/M）為20 mL/g時，研究提取時間分別為 10、15、20、25、30、35、40 min時，糜子油得率的變化。

操作步驟和實(shí)驗(yàn)條件同 1.2.2.1，在第二步的提取（淋洗）時間分別為10、15、20、25、30、35、40 min的條件下進(jìn)行7個不同提取條件的提取實(shí)驗(yàn)。每個提取條件下重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)，計(jì)算得率的平均值。

1.2.2.3 提取溫度對石油醚提取糜子油得率的影響 當(dāng)提取時間為 30 min，液料比（V/M）為20 mL/g時，在提取溫度分別為65、70、75、80、85、90 ℃時，研究其對糜子油得率的影響。

操作步驟和實(shí)驗(yàn)條件同 1.2.2.1，在第二步，將提取溫度分別設(shè)置為 65、70、75、80、85、90 ℃，進(jìn)行6個不同提取條件的實(shí)驗(yàn)。每個提取條件下重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)，計(jì)算得率的平均值。

1.2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在對單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行分析的基礎(chǔ)上，運(yùn)用Design Expert 10軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面，對液料比、提取時間、提取溫度這 3個因素分別選定 3個水平，按中心組合設(shè)計(jì)尋找最佳提取工藝條件。液料比、提取時間、提取溫度的主要水平編碼表如表1和表2所示。

表1 單因素實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels in one-factor experiments

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 2 Factors and levels in response surface test

1.3 數(shù)據(jù)處理

單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果用 Microsoft Office Excel 2016對其進(jìn)行分析，利用Design Expert 10軟件對工藝參數(shù)的組合進(jìn)行優(yōu)化，利用響應(yīng)面分析法（RSM）得到回歸模型和工藝參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 提取液料比對糜子油得率的影響

以石油醚為提取溶劑，當(dāng)提取溫度為75 ℃，提取時間為20 min時，研究液料比（V/M）分別為5、10、15、20、25、30 mL/g時，對糜子油的得率的影響。結(jié)果如圖1所示。

圖1 液料比對糜子油的得率影響Fig.1 Effect of liquid material ratio on yield of proso millet oil

由圖1可知，在液料比為5～20的范圍內(nèi)，糜子油的得率與液料比呈正相關(guān)性，糜子油得率隨液料比的增大而增加。當(dāng)液料比為20時，糜子油的得率達(dá)到最大值2.90%。當(dāng)液料比大于20后，得率會隨液料比的增加而逐漸減小至平緩。

原因可能是在一定液料比的范圍內(nèi)，溶劑量的增加提高了原料糜子粉與溶劑間的濃度差，促進(jìn)了提取溶劑石油醚與原料糜子粉的接觸，因此糜子油的得率有所提高，但此時再繼續(xù)增加溶劑的用量，會導(dǎo)致溶劑揮發(fā)速度加快[9]，使糜子油的得率下降甚至趨于平緩，而且溶劑用量的加大還會增加物質(zhì)成本。綜合考慮，最適液料比（V/M）范圍選取為 15、20、25 mL/g，進(jìn)而繼續(xù)對糜子油的得率進(jìn)行響應(yīng)面分析，以確定最佳的液料比。

2.1.2 提取時間對糜子油得率的影響

以石油醚為提取溶劑，當(dāng)提取溫度為80 ℃，液料比（V/M）為20 mL/g時，研究提取時間分別為10、15、20、25、30、35、40 min時，對糜子油得率的影響。結(jié)果如圖2所示。

圖2 提取時間對糜子油的得率影響Fig.2 Effect of extraction time on the yield of proso millet oil

結(jié)果表明，在10～30 min內(nèi)，糜子油的得率與提取時間呈正相關(guān)，隨著提取時間的延長，糜子油的得率不斷增加。在30 min時，糜子油的得率為最大值2.91%。而當(dāng)時間大于30 min之后，隨著時間的增加，糜子油的得率開始減小。

這可能是因?yàn)樵谝欢〞r間范圍內(nèi)，隨時間的延長，油料分子與溶劑分子的接觸會更加充分完全，有利于油脂的充分提取，因此得率隨著時間的延長而增加。在一定時間之后接觸達(dá)到平衡，此時再隨著時間的延長，原料分解，導(dǎo)致雜質(zhì)溶出，從而降低糜子油的得率，甚至還會增加時間成本[10]。綜合考慮，提取溫度選取25、30、35 min這三個水平，繼續(xù)對糜子油的得率進(jìn)行響應(yīng)面分析，以確定最佳提取時間。

2.1.3 提取溫度對糜子油得率的影響

以石油醚為提取溶劑，當(dāng)提取時間為30 min，液料比（V/M）為20 mL/g時，研究提取溫度分別為 65、70、75、80、85、90 ℃時，對糜子油得率的影響。結(jié)果如圖3所示。

圖3 提取溫度對糜子油的得率影響Fig.3 Effect of extraction temperature on yield of proso millet oil

由圖3可知，在65～80 ℃范圍內(nèi)，糜子油的得率與提取溫度呈正相關(guān)性，得率隨提取溫度升高而增加。當(dāng)提取溫度為 80 ℃時，糜子油的得率達(dá)到最大值3.01%。當(dāng)提取溫度大于80 ℃后，其得率隨提取溫度的升高而減小。

原因可能是在適當(dāng)?shù)臏囟葪l件下，分子熱運(yùn)動隨溫度增加而劇烈，促進(jìn)物料與溶劑分子間的相對運(yùn)動，從而有利于油脂的浸出擴(kuò)散。但當(dāng)溫度過高接近溶劑沸點(diǎn)時，溶劑汽化量增加，揮發(fā)性物質(zhì)增多，壓力增加，從而阻礙了油脂浸出[11]。綜合考慮，提取溫度選取 75、80、85 ℃三個水平，繼續(xù)對糜子油得率進(jìn)行響應(yīng)面分析，以確定最佳提取溫度。

2.2 石油醚提取糜子油工藝優(yōu)化響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛿M合

為了獲得索氏提取法提取糜子油的最佳工藝條件，采用正交設(shè)計(jì)法，以得率為響應(yīng)值，研究不同因素之間的綜合效應(yīng)，根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對液料比（mL/g）、提取時間（min）、提取溫度（℃）進(jìn)行3因素3水平實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。

以單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)，以液料比（A）、提取時間（B）、提取溫度（C）、三個因素為自變量，以糜子油得率（Y）為響應(yīng)值，通過 Design-Expert 10軟件對糜子油提取工藝的參數(shù)進(jìn)行Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。實(shí)驗(yàn)因素和水平的設(shè)計(jì)如表3所示。

表3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素組合表Table 3 Combination of experimental factors in response surface test

2.2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯著性分析

響應(yīng)面分析方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示；回歸模型和方差分析結(jié)果如表5所示。

表4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果表Table 4 Results of response surface test

用Design-expert得到了二次多元回歸擬合方程：Y=3.00+0.056A+0.050B+0.10C–0.12AB+0.030AC–0.023BC–0.41A2–0.35B2–0.31C2

對此模型方程進(jìn)行方差分析，從表 5的方差分析結(jié)果中可以看出回歸模型呈極顯著（P<0.01），失擬項(xiàng)無顯著性（P>0.05），回歸方程的相關(guān)系數(shù)R2=0.991 3，校正后的相關(guān)系數(shù)。意味著方程中的自變量與因變量的線性關(guān)系顯著，該方程可用于石油醚索氏提取糜子油的提取工藝優(yōu)化。

表5 回歸模型方差分析Table 5 Analysis of variance in regression model

各實(shí)驗(yàn)因素對糜子油提取率的影響為：C>A>B，一次項(xiàng)中A的偏回歸系數(shù)顯著（P<0.05），說明液料比對糜子油的提取率有顯著性影響，B的偏回歸系數(shù)顯著（P<0.05），說明提取時間對糜子油的提取率有顯著影響，而C的偏回歸系數(shù)極顯著（P<0.01），說明提取溫度對糜子油的提取率有極顯著影響。交互項(xiàng)AB對提取率影響極顯著（P<0.01），AC、BC對提取率的影響不顯著（P>0.05）。二次項(xiàng)中的A2、B2和C2對提取率的影響均為極顯著（P<0.01）。

2.3 響應(yīng)面和等高線圖分析

2.3.1 提取時間和液料比的交互作用

在提取溫度為 80 ℃下，三維面較陡，等高線呈橢圓形。表明提取時間和液料比的交互作用顯著，用石油醚提取糜子油的得率受到二者的共同影響。其中液料比坡度比提取時間的三維面稍微陡一些，說明液料比對糜子油的得率有顯著性影響。當(dāng)提取時間在27～31 min之間，液料比在19～23 mL/g之間時，糜子油的得率達(dá)到最大值，隨著提取時間和液料比的變化，糜子油的得率會下降。

圖4 因素A、因素B響應(yīng)面分析圖及等高線分布圖Fig.4 F actor A, B response surface analysis map and contour map

2.3.2 提取溫度和液料比的交互作用

在提取時間在30 min時，三維面較陡，說明糜子油的得率受到二者的共同影響。等高線呈圓形，說明提取溫度和液料比的交互作用不明顯。其中提取溫度和液料比都對糜子油的得率有顯著影響。當(dāng)提取溫度在79～83 ℃范圍內(nèi)，液料比在19～23 mL/g范圍內(nèi)，糜子油的得率達(dá)到最大值，隨著提取溫度和液料比的變化，糜子油得率會下降。

圖5 因素A、因素C響應(yīng)面分析圖及等高線分布圖Fig.5 F actor A, C response surface analysis map and contour map

2.3.3 提取溫度和提取時間的交互作用

在提取的液料比為20 mL/g的條件下，三維面較陡，等高線呈圓形。表明提取溫度和提取時間的交互作用不顯著，但其中提取溫度和提取時間都對糜子油的得率有顯著影響。當(dāng)提取時間在29～33 min之間，提取溫度在79～83 ℃之間時，糜子油的得率達(dá)到最大值，隨著提取溫度和提取時間的變化，糜子油得率會下降。

圖6 因素B、因素C響應(yīng)面分析圖及等高線分布圖Fig.6 F actor B, C response surface analysis map and contour map

3 結(jié)論

用Design-Expert對數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)測以確定糜子油索氏提取工藝條件的最佳參數(shù)。結(jié)果表明：液料比為20.34 mL/g、提取時間為30.27 min、提取溫度為 80.86 ℃時，在此提取條件下糜子油的預(yù)測最高得率為3.008%。為了實(shí)驗(yàn)的方便和可操作性，對此模型進(jìn)行修正為：液料比為 20 mL/g、提取時間為30 min、提取溫度為80 ℃。在修正后的提取條件下，糜子油的得率為 3.01%，與預(yù)測結(jié)果接近，證明該模型可以用于索氏提取法提取糜子油并驗(yàn)證其得率的相關(guān)實(shí)驗(yàn)。