薏苡仁油的提取方法、理化性質(zhì)及脂肪酸結(jié)構(gòu)分析

肖小年，王 凡，易孜成，周 潔，羅俊溢，李 娟，易 醒*

(南昌大學(xué)a.中德聯(lián)合研究院，江西 南昌 330047；b.中德食品工程中心，江西 南昌 330047)

薏苡仁油(Coix seed oil,CSO)是薏苡仁中的主要功能成分，其含量小于10%，具有抗腫瘤、提高免疫力、降血糖和抗炎消腫等作用[1-2]。含10%薏苡仁油的康萊特注射液，在1995年已正式被國(guó)家批準(zhǔn)用于抗癌治療，目前已作為一種較為理想的抗腫瘤藥物廣泛用于肺癌、肝癌、胃癌、子宮癌等的治療或輔助治療。采用傳統(tǒng)的壓榨法和溶劑法進(jìn)行提取，所得油的品質(zhì)不夠穩(wěn)定，損失偏多且存在溶解殘留問(wèn)題。CSO的提取主要采用水酶法[3]、超臨界CO2萃取法[4-5]、超聲法[6-7]、微波輔助提取法[8]等一些新型技術(shù)，其中超臨界CO2萃取法不僅降低了提取溫度和時(shí)間，提高了得油率和品質(zhì)，而且改善其他提取方法使用有機(jī)溶劑的不利因素。目前仍未有選用相同大小、生產(chǎn)批次、品種等的薏苡仁在以上所有工藝下同時(shí)提取的研究，因此缺少具有良好對(duì)比性的結(jié)果對(duì)對(duì)薏苡仁油的最佳提取方法做出判斷。

甘油三酯(Triglyceride,TG)是CSO的基本成分，其羥基結(jié)合的脂肪酸(Fatty acid,FA)中C18:1和C18:2含量最為豐富[9]。FA在TG中的位置分布與其雙鍵數(shù)目、位置、碳鏈長(zhǎng)短和組成一樣決定著脂肪的營(yíng)養(yǎng)特性[10-12]。董云發(fā)[13]等對(duì)6種國(guó)產(chǎn)薏苡仁的油脂含量及其脂肪酸組成進(jìn)行了研究，其中含油量介于3.92～6.53%之間，油酸(OA)、亞油酸(LOA)、亞麻酸(LNA)、棕櫚酸(PA)等為主要FA。薏苡仁油甘油三酯中不飽和脂肪酸對(duì)其穩(wěn)定性及活性有著重要的影響，但目前為止，有關(guān)此方面的研究報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)擬用超臨界CO2萃取法、水酶法、回流法、超聲法和微波法對(duì)同一批薏苡仁進(jìn)行油提取實(shí)驗(yàn)，并對(duì)其得率和品質(zhì)進(jìn)行比較，探討提取CSO的適宜方法。通過(guò)對(duì)最適宜提取法制得的CSO進(jìn)行一般特性的檢測(cè)以及脂肪酸組成和位置分布分析，為利用和進(jìn)一步探討其營(yíng)養(yǎng)保健特性提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

薏苡仁(南昌匯仁集團(tuán)有限公司)；果膠酶(500 000 U·mL-1)、中性蛋白酶(400 000 U·mL-1，和氏璧生物技術(shù)有限公司生產(chǎn))；液態(tài)CO2(純度99.5%，江西氨廠)；油酸(Fluka公司，純度≥99%)；亞油酸、胰脂肪酶、甘油三油酸酯(Sigma公司，純度≥99%)；乙腈、四氫呋喃、正己烷、氯仿、甲醇鈉、甲醇、乙酸甲酯(色譜純，西隴科學(xué)有限公司)；石油醚、乙醚(化學(xué)純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司)；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器

1200高效液相色譜儀，6890N型氣相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司)；RE52CS-1旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；HA121-50-01型超臨界萃取裝置(南通市華安超臨界萃取有限公司)；超微粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)；DSY-Ⅱ氮吹儀(北京金科科技公司)。

1.3 CSO的提取

采用超臨界CO2萃取法提取CSO的具體操作：鋼瓶中的CO2經(jīng)冷凝器液化后進(jìn)入儲(chǔ)罐，經(jīng)高壓泵調(diào)節(jié)到規(guī)定壓力，再通過(guò)熱交換器加熱后進(jìn)入已加有65目薏苡仁顆粒的萃取斧萃取2 h，控制萃取溫度45 ℃和萃取壓力為20 MPa.萃取物用等量體積的石油醚萃取3次，然后樣品經(jīng)減壓回收溶劑后放于通風(fēng)廚中自然揮干，最后對(duì)所得CSO進(jìn)行稱重并計(jì)算其得率。

酶法、回流法、超聲法和微波法提取CSO，按本課題組先前研究中報(bào)道[14]的方法進(jìn)行。

1.4 含量測(cè)定[15]

將CSO(0.1 g)、30% KOH溶液(5 mL)、10%抗壞血酸溶液(2 mL)和無(wú)水乙醇(25 mL)混合均勻后進(jìn)行約1.5 h的回流皂化。然后，皂化液用石油醚進(jìn)行3次萃取，并將除去石油醚的水層pH調(diào)至4.0，以使油酸及亞油酸鹽轉(zhuǎn)化為OA和LOA。該水層再用石油醚進(jìn)行3次萃取，得到的石油醚層經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸干后用CH3CN/THF(4:1，w/w)混合液定容至10 mL。樣品中的OA和LOA采用高效液相色譜在30 ℃的C18反相柱中以1.0 mL·min-1流速的乙腈/水/四氫呋喃(含0.4%乙酸，77:20:3，V/V/V)進(jìn)行分離和測(cè)定

1.5 理化特性檢測(cè)

參照國(guó)家相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)CSO的氣味、溶解性、相對(duì)密度、外觀、水分、旋光度、折光系數(shù)和含量進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 薏苡仁油的脂肪酸組成分析

1.6.1 薏苡仁油甘油三酯的純化

采用硅膠柱層析的方法[16]對(duì)薏苡仁油甘油三酯進(jìn)行純化，具體操作如下：將適量石油醚/乙醚的混合液(87:13，V/V)和硅膠加入底部填充有少量玻璃棉的層析柱中進(jìn)行裝柱。稱取薏苡仁油樣品約1.3 g，用洗脫液定容至25 mL配制樣品溶液。用約250 mL洗脫液以2 mL·min-1的速度對(duì)20 mL樣品溶液進(jìn)行洗脫，并將洗出物中的洗脫液除去，即得純化的甘油三酯。

1.6.2 胰脂肪酶解

分別取1 mL 0.2 mol·L-1(pH 7.7)的Tris緩沖液、0.1 mL 2.2% CaCl2水溶液、0.25 mL 0.05%膽酸鹽水溶液、10 mg純化后的薏苡仁甘油三酯置于具塞試管中，混勻，水浴1 min(37 ℃)，再加入8 mg胰脂肪酶，混勻后繼續(xù)水浴25 min[17-18]進(jìn)行水解。先后用乙醚和水清洗水解液各3次后，加入無(wú)水Na2SO4吸收殘余水分，再用N2吹除殘留的乙醚。將處理后的水解液滴點(diǎn)于硅膠G板上，用甲酸/正己烷/乙醚(75:25:1，V/V/V)將樣品中的甘油一酯、甘油二酯和游離脂肪酸進(jìn)行分離[19]。用碘蒸氣對(duì)展開樣品后的硅膠G板進(jìn)行顯色后，將斑帶刮下并用三氯甲烷浸泡提取其中的成分。最后，用N2除去提取液中的三氯甲烷，即得到各斑帶中的成分[20]。

1.6.3 氣相色譜分析

在室溫下，將CSO(1.5 mL，正己烷溶液)、乙酸乙酯(40 μL)和甲醇鈉(100 μL)混合均勻并反應(yīng)約20 min。然后，將60 μL H2C2O4快速加入經(jīng)10 min冷凍的反應(yīng)液中，并依次進(jìn)行離心，棄沉淀和無(wú)水Na2SO4除水分操作[16]。處理后的樣品進(jìn)行氣相色譜分析，具體條件如下：設(shè)定程序升溫(在45 ℃維持4 min，再升溫至175 ℃并保持27 min，然后升溫至215 ℃并保持35 min，前后速度分別為13 ℃和4 ℃·min-1)；采用熔融石英毛細(xì)管色譜柱(CP-Sil88，100 m×0.25 nm)；載氣為H2；燃燒氣為N2、H2和空氣混合氣。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取方法的比較

對(duì)5種方法的提取的得率、所得薏苡仁油的過(guò)氧化值及酸價(jià)進(jìn)行比較(表1)，可以評(píng)價(jià)各方法提取CSO的效果。

表1 5種提取方法比較

油脂品質(zhì)好壞通常用酸價(jià)與過(guò)氧化值進(jìn)行判斷，但提取過(guò)程中，溫度、水分、氧氣等因素會(huì)對(duì)油脂質(zhì)量造成影響[21]。從表1中可知，超臨界CO2萃取法顯示出最高的CSO得率，其次是微波法和超聲法，回流法最低。采用回流法提取的CSO具有較高的過(guò)氧化值，這可能是由于在回流提取時(shí)間較長(zhǎng)且接觸空氣的相對(duì)面積較大，油脂氧化程度較為嚴(yán)重。除回流法之外，其他方法的過(guò)氧化值和酸價(jià)幾乎相同，保持在一個(gè)較低的水平。由于超臨界CO2萃取法的溫度較低，其可以極大程度保留有效成分[22]，因此該方法提取的油脂質(zhì)量高且得率可觀，為提取CSO的最佳方法。

2.2 理化特性及含量

CSO的多個(gè)理化性質(zhì)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果如表2所示。其中CSO的折光系數(shù)(1.461～1.470)明顯高于一般油脂,說(shuō)明CSO中含有大量帶有雙鍵的不飽和脂肪酸[23]。根據(jù)已有研究顯示，這些不飽和脂肪酸中的油酸與亞油酸是賦予薏苡仁油具有抗癌功效的主要活性成分[25-26]。薏苡仁油中油酸與亞油酸的HPLC示差折光法的譜圖如圖1所示，并根據(jù)油酸(y=127 358x-4 165，R2=0.999 6)與亞油酸(y=139 436x+910.18，R2=0.999 5)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算其含量分別為44.1%和28.2%。

表2 薏苡仁油的一般特性

2.3 薏苡仁油甘油三酯中FA分布

2.3.1 脂肪酸組成GC-MS分析

如圖2所示，依據(jù)保留時(shí)間對(duì)CSO中含有的FA進(jìn)行鑒別，并采用面積歸一化法計(jì)算不同F(xiàn)A的含量(表3)。

由表3可知，CSO中共被分離檢測(cè)出16種FA，占FA總量的98.588%。主要含有12.854%PA，54.567%OA和27.356%LOA。另外本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)薏苡仁油中含有高等動(dòng)植物少有的奇數(shù)碳鏈脂肪酸，長(zhǎng)鏈脂肪酸C20～C24含量低于1%。

2.3.2 sn-2位FA分析

由于胰脂酶可以專一性地水解sn-1、3位的FA[26-27]，并在一定條件下不對(duì)sn-2位進(jìn)行水解。通過(guò)分析對(duì)比水解得到的游離FA成分，可區(qū)別TG中sn-1、3位與sn-2位的FA組成，從而確定FA在TG中的具體分布。因此本實(shí)驗(yàn)選用胰脂肪酶對(duì)提取制得的薏苡仁油進(jìn)行作用，以研究其TG中FA的位置分布。

結(jié)果顯示，共16種FA在sn-2位上被鑒定出，UFA含量高達(dá)93.032%，其中含有52.614%的PUFA和40.48%的MUFA。另外，SFA含量?jī)H為4.445%，其中主要是3.314%的C16:0。將近半數(shù)的C18:1和C18:2均位于sn-2上，說(shuō)明薏苡仁油甘油三酯中UFA(C18:1、C18:2)主要分布于sn-2位，而sn-1、3位上主要為SFA(C16:0、C18:0)。奇數(shù)碳鏈脂肪酸和長(zhǎng)鏈脂肪酸(C20～C24)則全都分布在sn-1、3位上。

3 結(jié)論

傳統(tǒng)回流法的CSO得率最低且過(guò)氧化值高，油品質(zhì)較差，而其余四種新方法均可不同程度地提高油得率和品質(zhì)。其中，超臨界CO2萃取法的CSO得率幾乎是回流法的3倍，且該方法所得油的質(zhì)量較好，是目前為止提取CSO的較好方法。采用該方法可得到淡黃色，澄清油狀液體且具有特有清香的CSO，水分≤0.5%，相對(duì)密度為0.953～0.971，折光系數(shù)(n20)為1.461～1.470，旋光度為-2.6°～+3.1°。甘油三酯含量(紫外法)≥91.5%，其中含OA(HPLC示差折光法)≥44.1%，LOA(HPLC示差折光法)≥28.2%。該CSO中共鑒定出16種FA，其中sn-2位上主要為UFA，少量的SAF分布在sn-1、3位上。另外，在sn-1、3位上發(fā)現(xiàn)了高等動(dòng)植物少有的奇數(shù)碳鏈脂肪酸。油脂的脂肪酸組成和分布與其功能性有著密切的關(guān)系，而CSO中脂肪酸分布特征是否與其抗癌、降脂、鎮(zhèn)痛等生物活性特征有直接或間接的關(guān)系，還有待進(jìn)一步研究。