黑豆丹貝發(fā)酵前后香氣、酚類物質(zhì)及抗氧化活性分析

武 悅 趙 婧 王 坤 朱 丹 牛廣財(cái) 魏文毅

(1黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；2黑龍江省農(nóng)產(chǎn)品加工工程技術(shù)研究中心，黑龍江 大慶 163319；3黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江 大慶 163319)

丹貝是印度尼西亞傳統(tǒng)的大豆發(fā)酵制品。在發(fā)酵過程中，少孢根霉(Rhizopus oligosporus)不僅使發(fā)酵的豆制品具有獨(dú)特的風(fēng)味，而且能增強(qiáng)其抗氧化性[1-2]。如Jeleń 等[3]利用氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)在發(fā)酵后的丹貝中檢測(cè)出21 種香氣成分，其主要芳香化合物有2-乙酰基-1-吡咯啉、2-乙基-3，5-二甲基吡嗪二甲基三硫化物、甲氧基2-甲基丙醛和(E，E)-2，4-癸二烯醛；丁一[4]利用少孢根霉對(duì)添加高粱的大豆進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵樣品中單寧含量較發(fā)酵前提高了近30倍，且具有更高的DPPH 自由基清除率、總抗氧化能力和還原能力。黑豆富含不飽和脂肪酸、氨基酸、黃酮、酚類物質(zhì)等成分，具有比普通大豆更強(qiáng)的抗氧化性[5-6]。雖然黑豆?fàn)I養(yǎng)豐富，但目前食用方式主要有豆豉、醬油等[7]，產(chǎn)品形式單一，且需要進(jìn)一步提高其營養(yǎng)與保健價(jià)值。開發(fā)黑豆丹貝既能豐富丹貝的品種，又可以拓展黑豆的深加工途徑。然而，目前關(guān)于黑豆丹貝制備工藝、營養(yǎng)成分及功能特性的系統(tǒng)研究尚鮮見報(bào)道。僅王丹丹[8]對(duì)黑豆丹貝發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)油炸黑豆丹貝相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行了檢測(cè)，但未涉及香氣成分、酚類物質(zhì)以及抗氧化活性等的研究。

鑒于此，本試驗(yàn)以黑豆為原料，少孢根霉為發(fā)酵菌株，對(duì)黑豆丹貝發(fā)酵前后的水分、灰分、蛋白質(zhì)、脂肪、香氣成分等指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)發(fā)酵過程中黑豆丹貝的蛋白質(zhì)水解度以及麥角固醇、氨基酸態(tài)氮、10 kDa 以下肽、總酚、總黃酮和原花青素的含量進(jìn)行測(cè)定，最后分析各類酚物質(zhì)含量與抗氧化活性指標(biāo)，即1，1-二苯基-2-三硝基苯肼[1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2，2-diphenyl-1-(2，4，6-trinitrophenyl) hydrazyl，DPPH]自由基清除率、2，2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽陽離子[2，2-azinobis (3ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt cation，ABTS＋]自由基清除率、羥基自由基清除率和鐵離子還原力(ferric ion reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP)之間的關(guān)系，旨在為黑豆丹貝的開發(fā)利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 主要試驗(yàn)材料及試劑

黑豆，購于黑龍江省建三江農(nóng)場(chǎng)；食品級(jí)乳酸，購于鄭州高研生物科技有限公司；少孢根霉(Rhizopus oligosporus)，孢子數(shù)量在106個(gè)·g-1以上，購于南京天貝人發(fā)酵技術(shù)有限公司；色譜級(jí)甲醇，德國Darmstadt 公司；麥角固醇、DPPH、2，4，6-三吡啶基三嗪[2，4，6-Tris-(2-pyridyl)-s-triazine，TPTZ]、ABTS、水溶性維生素E(Trolox VE)，美國Sigma-Aldrich 公司；胰酪蛋白胨、β-巰基乙醇、蘆丁、福林酚、沒食子酸、兒茶素、香草醛、鄰苯二甲醛、四硼酸鈉、十二烷基磺酸鈉、硫酸、硫酸銅、硫酸鉀、乙酸鎂、正己烷、正戊烷、乙醇、無水乙醚、石油醚、甲醇、過硫酸鉀、氯化鐵、濃鹽酸等，均為分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

DGG-9140B 干燥箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；LRH-150 型生化培養(yǎng)箱，上海益恒實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；SX2-12-10 箱式電阻爐，上海實(shí)驗(yàn)電爐廠；JTXT-150S 索氏提取器，天津天玻玻璃儀器有限公司；UV-1100 型紫外可見分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器；湘儀L420 臺(tái)式低速自動(dòng)平衡離心機(jī)，長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；Agilent GC 6890-MS 5973N 型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、Agilent 1260 infinityⅡ高效液相色譜儀，美國Agilent 公司；50/30 μm (DVB/CAR/PDMS)萃取頭，美國Supelco 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 黑豆丹貝的制備 參照武悅等[9]的方法制備黑豆丹貝。其中，在塑料發(fā)酵袋(8 cm×12 cm)上扎孔(1.25 個(gè)孔·cm-2)，發(fā)酵袋及產(chǎn)品形態(tài)見圖1。

圖1 黑豆丹貝發(fā)酵袋(A)及黑豆丹貝產(chǎn)品(B)Fig.1 Fermentation bag of black bean tempeh (A)and its product (B)

1.3.2 基本營養(yǎng)成分測(cè)定 分別參照GB 5009.3-2016[10]、GB 5009.4-2016[11]及GB 5009.6-2016[12]測(cè)定水分、灰分及粗脂肪含量。粗蛋白含量測(cè)定參照GB/T 6432-2018[13]中的凱氏定氮法。

1.3.3 香氣成分測(cè)定 參照丁一[4]的方法提取香氣成分并進(jìn)行分析。其中，程序升溫是以10℃·min-1升至90℃，保持3 min；再以5℃·min-1升至140℃，保持1 min；最后以10℃·min-1升至230℃，保持8 min。溶劑延遲1 min，不分流進(jìn)樣。質(zhì)譜(mass spectrometry，MS)條件:MS 離子源在225℃全掃描，電離方式:EI；掃描質(zhì)量范圍:50～500 amu。本研究僅報(bào)道匹配度大于80%以上的物質(zhì)。

1.3.4 麥角固醇含量測(cè)定 參照吳寒[14]的方法略有更改。萃取后得到的上層清液需旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，甲醇復(fù)溶后過濾膜待測(cè)。高效液相色譜分析條件:Supersil AQ-C18 色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流速1.0 mL·min-1，洗脫時(shí)間15 min。麥角固醇(0 ～200 μg·mL-1)標(biāo)準(zhǔn)溶液的線性回歸方程為y=29.251x-74.065(R2=0.998 3)。

1.3.5 氨基酸態(tài)氮含量測(cè)定 參照GB 5009.235-2016[15]的方法測(cè)定。

1.3.6 蛋白質(zhì)水解度測(cè)定 參考吳寒[14]的方法制備蛋白提取液。參照Wu 等[16]的方法測(cè)定黑豆丹貝發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)的水解度。

1.3.7 10 kDa 以下肽含量測(cè)定 對(duì)制備的蛋白質(zhì)提取液進(jìn)行10 kDa 以下肽含量的測(cè)定[14]。胰酪蛋白胨(0～20 mg·mL-1)作為標(biāo)準(zhǔn)物，線性回歸方程為y=0.067 6x-0.061 9(R2=0.992 8)。

1.3.8 酚化合物含量及抗氧化活性測(cè)定 稱取樣品并用正己烷脫脂2 次(料液比1 ∶10 g·mL-1)[9]，每次1 h，然后7 000 r·min-1離心10 min，將沉淀烘干至恒重。之后加入乙醇溶液，置于45℃水浴中超聲提取2 h 后7 000 r·min-1離心10 min，收集上清液[14]，待測(cè)。

1.3.8.1 總酚測(cè)定 采用 Folin-Ciocalteus 法測(cè)定[14]。沒食子酸(0 ～250 μg·mL-1)標(biāo)準(zhǔn)溶液的線性回歸方程為y=0.004 3x＋0.015 2(R2=0.999 2)。

1.3.8.2 總黃酮測(cè)定 參照陳虎等[17]的方法測(cè)定。蘆丁(0～0.06 μg·mL-1)標(biāo)準(zhǔn)溶液的線性回歸方程為y=14.980 4x-0.002 1(R2=0.993 0)。

1.3.8.3 原花青素含量測(cè)定 參照周蕓[18]的方法測(cè)定。兒茶素(0～250 μg·mL-1)標(biāo)準(zhǔn)溶液的線性回歸方程為y=0.003 7x＋0.011 3(R2=0.995 8)。

1.3.8.4 抗氧化活性相關(guān)指標(biāo)測(cè)定 1)參照吳寒[14]的方法測(cè)定DPPH 自由基清除率。其中，DPPH 溶液用100%甲醇溶解。DPPH 自由基清除率用水溶性維生素E(Trolox)等價(jià)抗氧化能力表示，DPPH 自由基清除率與Trolox(0 ～50 μg·mL-1)標(biāo)準(zhǔn)溶液的線性回歸方程為y=1.783x＋3.692 8 (R2=0.992 8)。

2)參照白海娜等[19]的方法制備ABTS＋溶液，然后進(jìn)行ABTS＋自由基清除能力測(cè)定并計(jì)算清除率。Trolox(0 ～20 μg·mL-1)標(biāo)準(zhǔn)溶液的線性方程為y=14.079 8x-3.113 1(R2=0.990 6)。

3)采用南京建成羥基自由基測(cè)定試劑盒法測(cè)定羥基自由基清除能力并計(jì)算清除率。Trolox(0 ～20 μg·mL-1)標(biāo)準(zhǔn)溶液的線性方程為y=3.171 2x-1.017 1(R2=0.993 7)。

4)參照吳寒[14]的方法進(jìn)行FRAP 的測(cè)定，結(jié)果以FeSO4當(dāng)量表示。FeSO4(0 ～350 μmol·L-1)標(biāo)準(zhǔn)溶液的線性回歸方程為y=3.442 9x＋0.034 0(R2=0.993 7)。

1.3.9 數(shù)據(jù)處理 利用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行2 個(gè)樣本獨(dú)立T 檢驗(yàn)，并對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。數(shù)據(jù)多重比較采用Duncan法分析，并選用Pearson 相關(guān)系數(shù)法對(duì)活性成分和抗氧化各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析。所有試驗(yàn)均設(shè)置3 次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑豆丹貝基本營養(yǎng)成分分析

由表1 可知，發(fā)酵前后的黑豆丹貝灰分、粗脂肪含量差異不顯著；水分、粗蛋白含量差異顯著。發(fā)酵后黑豆丹貝粗蛋白含量由43.46%升至46.67%，這是因?yàn)槲⑸镌谏L繁殖過程中利用非蛋白氮合成菌體蛋白，從而提高了發(fā)酵產(chǎn)物的粗蛋白含量[20-21]。水分含量由58.49%降至56.61%，這可能是恒溫培養(yǎng)致使黑豆丹貝中的自由水揮發(fā)導(dǎo)致的。

2.2 黑豆丹貝香氣成分分析

由表2 可知，發(fā)酵前后樣品中共檢出29 種香氣成分。

表1 黑豆丹貝發(fā)酵前后基本營養(yǎng)成分含量Table 1 Basic nutrients contents of black soybean tempeh before and after fermentation

發(fā)酵前樣品可檢出10 種香氣物質(zhì)，相對(duì)含量為70.12%；發(fā)酵后樣品可檢出24 種香氣物質(zhì)，相對(duì)含量為43.14%。

發(fā)酵前后樣品中均檢出的5 種烷類香氣類物質(zhì)，分別為1，1，1，5，5，5-六甲基-3，3-二乙氧基三硅氧烷、八甲基環(huán)四硅氧烷、十甲基環(huán)五硅氧烷、四溴甲基環(huán)庚硅氧烷和六甲基環(huán)三硅氧烷。發(fā)酵后樣品新增加3 種烷類風(fēng)味物質(zhì)，分別為1-(1，2-二甲基丙基)-1-甲基-2-壬基-環(huán)丙烷、二十八烷和十四甲基-環(huán)庚硅氧烷，其相對(duì)含量分別為0.59%、0.42%和3.17%?？傮w來說，1-(1，2-二甲基丙基)-1-甲基-2-壬基-環(huán)丙烷和二十八烷的相對(duì)含量較低，對(duì)黑豆丹貝風(fēng)味貢獻(xiàn)較小，十四甲基-環(huán)庚硅氧烷可能是微生物的代謝產(chǎn)物。

發(fā)酵前樣品醇類物質(zhì)有1-辛烯-3-醇、3-辛醇，其中1-辛烯-3-醇具有蘑菇、薰衣草、玫瑰和干草香氣，3-辛醇呈蘑菇香氣。發(fā)酵后，樣品中這2 種物質(zhì)未檢出，檢出異戊醇，此物質(zhì)具有蘋果白蘭地香氣，這可能是因?yàn)榘l(fā)酵過程中發(fā)生了氧化反應(yīng)或酯化反應(yīng)，導(dǎo)致1-辛烯-3-醇未檢出，其他醇類的出現(xiàn)不同程度地豐富了黑豆丹貝的風(fēng)味[4]。發(fā)酵前，樣品中酮類物質(zhì)有3-辛酮，其相對(duì)含量為9.18%，發(fā)酵后3-辛酮未檢出，增加了5-甲基-3-庚酮和2，3-二氫-7-甲氧基-4-甲基-1H-1，5-苯二氮雜-2-酮，其中5-甲基-3-庚酮具有檸檬草的香氣。發(fā)酵前后，苯類主要物質(zhì)組成由2-[(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基]-1-異丙基-4-甲基苯變?yōu)?，3-二(三甲基甲硅烷基)苯，相對(duì)含量由1.19%降至0.15%，新苯類物質(zhì)的出現(xiàn)豐富了黑豆丹貝的風(fēng)味。發(fā)酵前，樣品中2-正戊基呋喃的相對(duì)含量為6.55%，發(fā)酵后，2-正戊基呋喃未檢出，新出現(xiàn)1-氨基環(huán)戊酰胺，使黑豆丹貝具有其典型的香味。

發(fā)酵后新增加的香氣風(fēng)味物質(zhì)主要有醛、酯、烴類。其中異戊醛和壬醛的總相對(duì)含量達(dá)2.94%，使黑豆丹貝具有輕微的水果香氣；1-硫代異氰酸戊酯、甲基肼甲二硫代酯、棕櫚酸乙酯的總相對(duì)含量達(dá)9.39%，這些物質(zhì)的出現(xiàn)使黑豆丹貝具有清冽的水果味道；雙戊烯、(Z)-3-乙基-2-甲基-1，3-己二烯、香橙烯、馬兜鈴烯、雪松烯V6 和1-石竹烯的總相對(duì)含量為12.25%，令黑豆丹貝具有檸檬、柑橘、丁香的香氣。

表2 黑豆丹貝發(fā)酵前后香氣成分的GC-MS 分析結(jié)果Table 2 Analysis results of aroma components in black bean tempeh by GC-MS before and after fermentation

2.3 黑豆丹貝發(fā)酵過程中麥角固醇與氨基酸態(tài)氮含量的變化

麥角固醇是真菌細(xì)胞膜的主要組分，其含量變化可以在一定程度上反映少孢根霉菌絲的生長狀況[22]。由圖2-A 可知，發(fā)酵過程中黑豆丹貝的麥角固醇含量總體上呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。發(fā)酵0 ～33 h 內(nèi)麥角固醇含量逐漸上升至最大值(911.39 μg·g-1)，表明少孢根霉能夠以黑豆為基質(zhì)，持續(xù)快速的生長[22]；發(fā)酵33 h 后麥角固醇含量開始下降，并在發(fā)酵39 h 時(shí)下降至760.26 μg·g-1，這可能是因?yàn)殡S著發(fā)酵時(shí)間的延長，部分菌絲發(fā)生了自溶，從而導(dǎo)致麥角固醇的分解。

氨基酸態(tài)氮含量可反映蛋白質(zhì)的水解程度，是判斷傳統(tǒng)發(fā)酵食品發(fā)酵程度的一項(xiàng)重要指標(biāo)[14]。由圖2-B 可知，發(fā)酵0～9 h 內(nèi)氨基酸態(tài)氮含量呈現(xiàn)緩慢下降趨勢(shì)，這可能是因?yàn)榘l(fā)酵前期微生物胞內(nèi)蛋白酶尚未充分合成，而自身生長又需要氨基酸作為氮源。發(fā)酵9 h 后氨基酸態(tài)氮含量開始上升，從0.05 g·100g-1上升至0.87 g·100g-1，這是因?yàn)殡S著少孢根霉的生長，其自身分泌的大量蛋白酶可將蛋白質(zhì)水解[1]，因此，可溶性氮含量增加。

圖2 黑豆丹貝發(fā)酵過程中麥角固醇(A)、氨基酸態(tài)氮(B)含量的變化Fig.2 Changes of ergosterol (A) and amino acid nitrogen(B) content during fermentation of black soybean tempeh

2.4 黑豆丹貝發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)水解度與10 kDa 以下肽含量的變化

由圖3-A 可知，在發(fā)酵初期(0 ～15 h)，黑豆丹貝蛋白質(zhì)的水解度先下降后保持穩(wěn)定，發(fā)酵15 ～39 h 期間，蛋白質(zhì)水解度由4.85%顯著上升至29.43%。天冬氨酸蛋白酶是根霉分泌的主要蛋白酶，它在酸性環(huán)境中具有更好的活性和穩(wěn)定性。丹貝制作過程中，乳酸的添加為蛋白酶提供了良好的酸性環(huán)境[16，23]。因此，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，蛋白酶不斷增加，大分子物質(zhì)分解成小分子物質(zhì)，蛋白質(zhì)水解度顯著增加。

圖3 黑豆丹貝發(fā)酵過程中水解度(A)與10 kDa 以下肽含量(B)的變化Fig.3 Changes of hydrolysis degree (A) and peptide content below 10 kDa (B) during fermentation of black soybean tempeh

與蛋白質(zhì)水解度的變化趨勢(shì)相似，發(fā)酵過程中黑豆丹貝10 kDa 以下肽含量總體呈先穩(wěn)定后上升的變化趨勢(shì)(圖3-B)。發(fā)酵初期(0 ～15 h)黑豆丹貝的10 kDa 以下肽含量無顯著變化，發(fā)酵15 ～39 h 時(shí)其含量從93.28 mg·g-1上升至335.60 mg·g-1，表明少孢根霉可以很好地促進(jìn)黑豆蛋白質(zhì)降解成小分子量的多肽。多肽是蛋白質(zhì)水解的中間產(chǎn)物，具有極高的生物活性，可賦予丹貝多種生理功能，如抗氧化、抗腫瘤、抗高血壓等[24-25]。

2.5 黑豆丹貝發(fā)酵過程中酚類物質(zhì)的變化

由圖4-A 可知，發(fā)酵初期(0 ～15 h)黑豆丹貝總酚含量基本維持在0.86～0.94 mg·g-1，這可能是因?yàn)樵诔醢l(fā)酵時(shí)，酚類物質(zhì)大部分以結(jié)合態(tài)的形式存在。發(fā)酵15～33 h 時(shí)，總酚含量由0.94 mg·g-1顯著上升至2.23 mg·g-1。33～39 h 時(shí)，發(fā)酵逐漸徹底，總酚含量基本維持在2.23 mg·g-1。

發(fā)酵中黑豆丹貝總黃酮含量呈上升趨勢(shì)，由0.35 mg·g-1升至0.70 mg·g-1(圖4-B)。這可能是因?yàn)椋S著發(fā)酵時(shí)間的延長，微生物含量增加，其產(chǎn)生的酶催化類黃酮由結(jié)合態(tài)轉(zhuǎn)為游離態(tài)[26]。

同樣，發(fā)酵過程中(9 ～39 h)，黑豆丹貝中原花青素含量逐漸升高，由0.55 mg·g-1上升至2.22 mg·g-1(圖4-C)。這可能是因?yàn)樵诎l(fā)酵初始階段，原花青素以高聚體的形式存在，然而，發(fā)酵過程中由于微生物的作用，導(dǎo)致原花青素由高聚體轉(zhuǎn)為低聚體，其含量逐漸增加[27]。

圖4 黑豆丹貝發(fā)酵過程中總酚(A)、總黃酮(B)、原花青素(C)含量的變化Fig.4 Changes of total phenol (A)，total flavonoids (B) and procyanidins(C) contents during fermentation of black soybean tempeh

2.6 黑豆丹貝抗氧化活性變化

由圖5-A 可知，發(fā)酵15～27 h 時(shí)，DPPH 自由基清除率顯著增加；發(fā)酵39 h 時(shí)，DPPH 自由基清除率達(dá)到最大值，為83.41%(每克黑豆丹貝凍干樣品相當(dāng)于0.45 mg Trolox)?？梢姡l(fā)酵后的黑豆丹貝對(duì)DPPH自由基的清除能力遠(yuǎn)大于未發(fā)酵樣品。

由圖5-B 可知，發(fā)酵15～21 h 時(shí)，ABTS＋自由基清除能力顯著增強(qiáng)，清除率由79.84%提高至98.17%(每克凍干樣品相當(dāng)于0.072 mg Trolox)，發(fā)酵21 ～39 h 后ABTS＋自由基清除能力趨于穩(wěn)定。黃士淇[28]利用少孢根霉發(fā)酵青刺果種子的研究結(jié)果顯示，發(fā)酵后青刺果種子的ABTS＋自由基清除能力較發(fā)酵前顯著提高，這與本研究結(jié)果一致。

由圖5-C 可知，發(fā)酵0～21 h 時(shí)，羥基自由基清除率由76.75%提高至92.11%(每克凍干樣品相當(dāng)于0.29 mg VE)，發(fā)酵21 h 后，羥基自由基清除率趨于穩(wěn)定。這與Sheih 等[29]利用黑霉M46 發(fā)酵大豆后，大豆胚芽的羥基自由基和超氧化物自由基的抗氧化活性提高的結(jié)論一致。

圖5 黑豆丹貝發(fā)酵過程中DPPH 自由基清除率(A)、ABTS+自由基清除率(B)、羥自由基清除率(C)、FRAP(D)的變化Fig.5 Changes of DPPH radical scavenging rate(A)，ABTS+ radical scavenging rate(B)，hydroxyl radical scavenging rate(C) and FRAP (D) during fermentation of black soybean tempeh

由圖5-D 可知，發(fā)酵0～21 h 內(nèi)FRAP 變化不大，隨后逐漸增加，至發(fā)酵33 h 時(shí)達(dá)到最大(7.18 μmol·g-1)，之后趨于穩(wěn)定。說明發(fā)酵后的黑豆丹貝具有較強(qiáng)的FRAP。

2.7 黑豆丹貝活性成分與抗氧化能力相關(guān)性分析

由表3 可知，總酚和原花青素含量均分別與DPPH 自由基清除率和FRAP 呈極顯著正相關(guān)(P＜0.01)，與ABTS＋自由基清除率和羥基自由基清除率呈顯著正相關(guān)(P＜0.05)；總黃酮含量與DPPH 自由基清除率、ABTS＋自由基清除率、羥基自由基清除率呈極顯著正相關(guān)(P＜0.01)，與FRAP 呈顯著正相關(guān)(P＜0.05)，表明總酚、總黃酮和原花青素含量與抗氧化活性之間密切相關(guān)。上述結(jié)果與張杉杉等[30]研究發(fā)酵豆渣中總酚含量及抗氧化能力均顯著升高且具有極顯著相關(guān)性的結(jié)果一致。此外，Singh 等[31]研究表明，發(fā)酵后大豆較未發(fā)酵大豆的酚類物質(zhì)、黃酮類物質(zhì)含量和抗氧化能力均有提高，這可能和酚類、黃酮類物質(zhì)與自由基反應(yīng)的終止有關(guān)，也可以用于解釋本試驗(yàn)中黑豆丹貝具有較強(qiáng)的清除自由基的能力。

表3 總酚、總黃酮、花青素含量和抗氧化能力的皮爾森相關(guān)分析Table 3 Pearson correlation analysis of total phenol，total flavonoids，anthocyanin content and antioxidant capacity

3 討論

通常少孢根霉(Rhizopus oligosporus)發(fā)酵后的黑豆丹貝中醛類、酯類、烴類等香氣成分較多[32]。本研究中黑豆丹貝發(fā)酵后新檢出的壬醛、棕櫚酸乙酯及1-石竹烯等香氣成分，賦予其獨(dú)特的味道，并且有淡淡的玫瑰香味和水果香氣。此外，異戊醇的出現(xiàn)賦予丹貝清香的味道[33]。發(fā)生這種香氣變化的機(jī)制可能是，少孢根霉將淀粉水解，產(chǎn)成的葡萄糖進(jìn)一步水解后生成乙醇、乙醛、乙酸，然后繼續(xù)與其他物質(zhì)作用而形成酯類；而脂肪經(jīng)脂肪酶水解后生成的脂肪酸與甘油結(jié)合而形成低分子酯類，脂肪酸還可以與醇類物質(zhì)進(jìn)一步作用，這為有機(jī)酸、醛類、酮類、烴類等發(fā)酵豆制品的芳香類化合形成提供機(jī)會(huì)[34]。此外，1-石竹烯的形成可能與葡萄糖苷酶活性有關(guān)[35]，其香氣很特別且明顯。

本研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵過程中黑豆丹貝的氨基酸態(tài)氮、水解度、10 kDa 以下肽含量整體變化趨勢(shì)一致，即在發(fā)酵0～15 h 變化幅度較小，發(fā)酵15 ～39 h 迅速升高，發(fā)酵39 h 達(dá)到最大值；麥角固醇含量呈先上升后下降的趨勢(shì)，在發(fā)酵33 h 達(dá)到最大值。說明隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，少孢根霉生長狀況良好，并利用自身分泌的蛋白酶將蛋白質(zhì)水解成為多肽、小肽或游離氨基酸等物質(zhì)，這些物質(zhì)不僅賦予丹貝豐富的風(fēng)味，還提高了黑豆丹貝的營養(yǎng)，有利于人體的消化吸收[23，25]。同時(shí)，發(fā)酵后黑豆丹貝的總酚、總黃酮和原花青素含量分別是未發(fā)酵樣品的2.59、2.12 和4.04 倍(P＜0.05)，且均與抗氧化活性密切相關(guān)(P＜0.05)。雖然植物中含有大量的酚類物質(zhì)，但主要以共軛形式存在，這導(dǎo)致其活性羥基減少，從而抑制了抗氧化活性[36]。微生物代謝產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶、纖維素酶、木聚糖酶和蛋白酶等水解酶類可促進(jìn)酚類物質(zhì)由結(jié)合態(tài)轉(zhuǎn)化為游離態(tài)[37]。而游離多酚、黃酮和原花青素含量的增加，則往往伴隨著抗氧化活性的增強(qiáng)[25，38-39]。因此，微生物發(fā)酵可以作為提升產(chǎn)品抗氧化活性的一種有效途徑[36]。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，發(fā)酵后黑豆丹貝的水分含量顯著降低，粗蛋白含量顯著增加，共檢出24 種香氣物質(zhì)，較未發(fā)酵樣品多14 種，且發(fā)酵后樣品新檢出醛類、烴類和酯類三類香氣物質(zhì)；發(fā)酵結(jié)束后的黑豆丹貝蛋白質(zhì)水解度以及麥角固醇、氨基酸態(tài)氮、10 kDa 以下肽、總酚、總黃酮、原花青素含量均較未發(fā)酵樣品顯著增加，且酚類物質(zhì)含量與抗氧化活性呈顯著正相關(guān)。綜上，少孢根霉發(fā)酵對(duì)黑豆丹貝產(chǎn)品香氣有積極影響，且發(fā)酵后產(chǎn)品的主要成分和抗氧化水平獲得顯著改善。因此，利用少孢根霉發(fā)酵是生產(chǎn)黑豆丹貝產(chǎn)品的一條新途徑。但目前對(duì)黑豆丹貝的研究尚淺，應(yīng)進(jìn)一步探究黑豆丹貝發(fā)酵中的生化動(dòng)態(tài)、生物活性及其產(chǎn)品的生理功能，以期為黑豆丹貝的深度開發(fā)提供依據(jù)。