減壓貯藏對去殼黃甜竹筍的保鮮效果及其生理和分子機(jī)制

戴 丹 鄭 劍 周成敏 龐林江 翁方榮

(1 浙江農(nóng)林大學(xué)信息工程學(xué)院/林業(yè)感知技術(shù)與智能裝備國家林業(yè)和草原局重點實驗室/浙江省林業(yè)智能監(jiān)測與信息技術(shù)研究重點實驗室，浙江 杭州 311300；2 浙江農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院/浙江省農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)改良技術(shù)研究重點實驗室，浙江 杭州 311300；3 浙江省麗水市農(nóng)林科學(xué)研究院，浙江 麗水 323000；4浙江省麗水市遂昌縣羽峰食品廠，浙江 遂昌 323300)

黃甜竹(Acidosasa edulis) 是禾本科酸竹屬(Acidosasa)混生竹，廣泛種植于浙西南地區(qū)。黃甜竹筍口感鮮甜、細(xì)膩，富含氨基酸、糖類、膳食纖維等營養(yǎng)素；因其于氣溫較高的4 ～5月份出筍，且其采后極易發(fā)生褐變、木質(zhì)化和腐爛變質(zhì)，因此保鮮難度大，嚴(yán)重制約其運輸銷售，影響產(chǎn)業(yè)發(fā)展。

減壓貯藏能夠通過降低貯藏環(huán)境的氣壓進(jìn)而降低氧氣含量，從而抑制果蔬呼吸，且減壓貯藏可以快速去除呼吸熱[1]。相關(guān)研究表明，減壓貯藏能夠顯著抑制蘋果[1]、蘆筍[2]、甜櫻桃[3]、草莓[4-5]、青辣椒[6]、綠皮西葫蘆[7]、番茄[8-9]、水蜜桃[10]、鮮切西蘭花[11]、雙孢菇[12]、杏鮑菇[13]、松茸[14]和芒果[15]等果蔬和食用菌采后成熟、衰老以及品質(zhì)劣變的速度，其作用機(jī)制主要是通過延緩果實硬度下降和葉綠素降解、抑制呼吸速率和失重率上升、減輕膜脂過氧化程度和延緩褐變發(fā)生、抑制維生素C 等營養(yǎng)成分損失等途徑，有效延緩食用品質(zhì)下降并延長貯藏期。鄭先章等[16]提出，減壓貯藏短期處理對生鮮果蔬具有后續(xù)保鮮效應(yīng)，可在一定程度上彌補(bǔ)目前生鮮果蔬等冷鏈流通過程中斷鏈的缺陷，為生鮮果蔬銷售流通提供一定的技術(shù)支撐。

去殼凈筍產(chǎn)業(yè)近些年來快速發(fā)展，去殼凈筍以其加工烹飪方便以及無筍殼等固體廢棄物污染等優(yōu)點廣受城市消費者青睞。然而，關(guān)于減壓貯藏對去殼冷藏黃甜竹筍的褐變、筍肉木質(zhì)化以及品質(zhì)影響的研究尚鮮見報道。鑒于此，本試驗以去殼黃甜竹筍為原料，研究減壓貯藏對延緩黃甜竹筍冷藏期間木質(zhì)化、褐變進(jìn)程的影響效果及其內(nèi)在調(diào)控機(jī)制，以期為黃甜竹凈筍流通銷售過程中保鮮方法的篩選以及保鮮包裝盒的設(shè)計研發(fā)提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃甜竹筍，5月初上午6:00 左右采收于浙江省麗水市農(nóng)林科學(xué)研究院的黃甜竹林。

L-苯丙氨酸、愈創(chuàng)木酚、三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA)、硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid，TBA)、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone，PVP)、鄰苯二酚、乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)、TritonX-100、β-巰基乙醇，均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；松柏醇、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(氧化態(tài))，美國Sigma 公司；PureLink?plant RNA Extraction Kit、PrimeScriptTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit、SYBR?Premix Ex TaqTM(Tli Rnase Plus)，日本TaKaRa Bio InC 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

VSE-5 型減壓貯藏小型實驗設(shè)備，寧波象山食品設(shè)備有限公司；DDS-307 臺式電導(dǎo)率儀，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；3-30K 冷凍離心機(jī)，德國Sigma公司；TYI-3016F 便攜式紅外CO2分析儀，上海唐儀電子科技有限公司；UV-2355 紫外可見分光光度計，尤尼柯(上海)儀器有限公司；LHS-350SC 恒溫恒濕箱，上?？瞥綄嶒炘O(shè)備有限公司；TA-XT2i 質(zhì)構(gòu)儀，英國Stable Micro Systems 公司；CHROMA METER CR-400 色差儀，日本柯尼卡公司；iQTM5 多重實時熒光定量PCR 儀，美國Bio-Rad 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 預(yù)處理 現(xiàn)場采挖黃甜竹筍，揀選基部切口平整、筍體其他部位無機(jī)械損傷、無病蟲害且粗細(xì)和長短相近的筍，置于采樣盒中，采用空調(diào)車3 h 內(nèi)運回實驗室。切除自基部切口向上長度約3 ～4 cm 部分，剝?nèi)スS殼，自來水沖洗干凈后于陰涼通風(fēng)處晾干，隨機(jī)取180 根筍，分成6 組，其中1 組用于測定貯藏初期(0 d)的各項指標(biāo)；另外4 組置于減壓貯藏設(shè)備的貯藏室(減壓貯藏實驗設(shè)備結(jié)構(gòu)原理如圖1 所示)，進(jìn)行預(yù)試驗，分別于85±5、70±5、55±5 和40±5 kPa 減壓環(huán)境下，6±1℃、相對濕度80%～85%條件下貯藏10 d；最后1 組在101 kPa 空氣環(huán)境下同溫濕度冷藏作為預(yù)試驗對照(CK1)。通過測定硬度、L*值、木質(zhì)子和纖維素含量篩選出最適處理參數(shù)。

圖1 減壓貯藏實驗設(shè)備結(jié)構(gòu)原理圖Fig.1 Structure schematic diagram of the hypobaric storage test equipment

1.3.2 試驗方法 將剩余360 根筍，分成2 組，一組貯藏于1.3.1 篩選出的最適氣壓條件，另一組貯藏于空氣中(對照，CK)，于6±1℃、80%～85%(相對濕度)條件下貯藏10 d。貯藏期間，每2 d 隨機(jī)取樣，每組每次取30 根筍，檢測基部切面的色差、測定呼吸速率，選取自基部切口往上2 ～4 cm 的一段，檢測該段筍肉組織的相對電導(dǎo)率、丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量、硬度、木質(zhì)素和纖維素含量以及苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase，PAL)、過氧化物酶(peroxidase，POD)、肉桂醇脫氫酶(cinnamyl alcohol dehydrogenase，CAD)、 多 酚 氧 化 酶( polyphenol oxidase，PPO)的活性及其編碼基因的相對表達(dá)量，試驗重復(fù)3 次。

1.3.3 呼吸速率和失重率的測定 取6 個密封良好且潔凈的干燥器(其中3 個連接真空泵維持減壓狀態(tài))，分別在相應(yīng)的貯藏溫度(6 ±1℃)下，先用便攜式紅外線CO2分析器檢測各自干燥器中CO2濃度(C0)，然后將CK 和減壓貯藏的去殼黃甜竹筍放入各自對應(yīng)的干燥器中，密封后兩組筍在各自對應(yīng)的常壓和減壓環(huán)境下放置2 h，再檢測干燥器中CO2濃度(C1)，根據(jù)前后兩次CO2濃度變化、干燥器的容積(V干)與筍的體積(V筍)以及筍的質(zhì)量(m筍)計算呼吸速率。

失重率采用稱重法測定。失重率=(貯藏前質(zhì)量-貯藏后質(zhì)量)/貯藏前質(zhì)量×100%

1.3.4 色差的測定 采用色差儀測定黃甜竹筍基部切面的L*值，3 次重復(fù)，取平均值。

1.3.5 相對電導(dǎo)率和MDA 含量的測定 相對電導(dǎo)率的測定參照曹建康等[17]的方法稍作修改:測定樣品為10 片直徑1 cm、厚度1 mm 左右的筍肉組織圓片；MDA 含量的測定參照曹建康等[17]的方法。

1.3.6 硬度的測定 從黃甜竹筍基部切口往上2 ～4 cm 部位切下約1.0 ～1.4 cm 厚筍肉，切成約1 cm×1 cm 的正方形，然后用質(zhì)構(gòu)儀P/2 平頭柱形探頭檢測筍肉的硬度，探頭測試深度為4 mm，穿刺速度為0.5 mm·s-1，單位為N。

1.3.7 纖維素和木質(zhì)素的測定 參照Zeng 等[18]的方法，結(jié)果以占筍肉鮮重質(zhì)量百分比計。

1.3.8 PAL、POD、CAD、PPO 活性測定 PAL、POD、PPO 活性的測定參照曹建康等[17]的方法，CAD 活性的測定參照Zeng 等[18]的方法。

1.3.9 黃甜竹筍木質(zhì)素代謝和褐變相關(guān)酶基因表達(dá)的測定 參照文獻(xiàn)[19-20]的方法并稍作修改，用PrimeScriptTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄試驗。

Real-time PCR 檢測:用多重實時熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，引物及條件見表1，反應(yīng)體系共16 μL，包括:6.6 μL ddH2O、8 μL SYBR Green qPCR mix(2×)、0.2 μL PCR-F(10 μmol·L-1)、0.2 μL PCR-R(10 μmol·L-1)、 1.0 μL 模板cDNA。

反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性1 min；50 個循環(huán)(95℃變性10 s，60℃退火25 s，收集熒光)；在55～95℃之間進(jìn)行熔解曲線分析。

表1 定量PCR 引物序列及反應(yīng)條件Table 1 Real-time PCR primers and conditions

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 16.0 軟件中的one-way ANOVA 方法對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性檢驗分析，用Duncan 進(jìn)行多重比較分析(P＜0.05)，用Excel 2010 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃甜竹筍減壓貯藏參數(shù)的預(yù)試驗篩選

由表2 可知，與0 d 的去殼黃甜竹筍相比，常壓處理(101 kPa)和各減壓處理組竹筍的硬度和筍肉木質(zhì)素含量均明顯上升。與常壓處理組相比，4 組減壓處理均顯著抑制了竹筍硬度和木質(zhì)素含量的上升，然而85 和70 kPa 減壓貯藏去殼黃甜竹筍的失重率顯著升高；另外70、55 和40 kPa 減壓貯藏顯著抑制了筍肉組織中纖維素含量的上升和L*值的下降，而85 kPa 減壓貯藏雖然抑制了筍肉組織中纖維素含量含量上升和L*值下降，但未達(dá)到顯著水平；此外，55 kPa 減壓貯藏在抑制筍肉硬度和失重率上升方面略好于40 kPa 減壓貯藏，但差異不顯著，同時在木質(zhì)素和纖維素含量以及L*值方面差異也不顯著。綜合考慮以上結(jié)果以及減壓設(shè)備運營等因素，確定后續(xù)以55 kPa 減壓貯藏開展試驗。

2.2 減壓貯藏對黃甜竹筍呼吸速率和L*值的影響

由圖2-A 可知，黃甜竹筍呼吸速率隨著貯藏時間的延長逐漸升高，貯藏第2 天時，減壓貯藏組黃甜竹筍的呼吸速率略低于CK 但差異不顯著，貯藏4 ～10 d內(nèi)，減壓貯藏組的呼吸速率均顯著低于CK。

由圖2-B 可知，隨著貯藏時間的延長，黃甜竹筍切面的L*值逐漸降低，在貯藏第2 天，減壓貯藏組黃甜竹筍的L*值略高于CK 但差異不顯著，而貯藏4～10 d內(nèi)，減壓冷藏組黃甜竹筍基部切面的L*值均顯著高于CK。

由圖3 可知，貯藏第10 天時，CK 組黃甜竹筍的切面和筍體發(fā)生較明顯褐變，筍肉和外表面呈明顯的棕褐色且有明顯酸腐味；而減壓貯藏組黃甜竹筍的筍體顏色大部分仍呈淡黃色，切面顏色為淡棕黃色、輕微褐變、筍體比較飽滿且仍然有黃甜竹筍特有的鮮甜味。表明減壓貯藏能夠有效抑制去殼黃甜竹筍貯藏期間呼吸速率的升高并延緩褐變。

表2 不同減壓貯藏參數(shù)對黃甜竹筍硬度、L*值、木質(zhì)素和纖維素含量以及失重率的影響Table 2 Effects of different hypobaric conditions on firmness， L*，lignin and cellulose contents and weight loss of bamboo shoot

圖2 減壓貯藏對黃甜竹筍呼吸速率和L*值的影響Fig.2 Effects of hypobaric storage on respiratory rate and L* value of bamboo shoots

2.3 減壓貯藏對黃甜竹筍MDA 含量和相對電導(dǎo)率的影響

圖4 減壓貯藏對黃甜竹筍MDA 含量和相對電導(dǎo)率的影響Fig.4 Effects of hypobaric storage on MDA content and relative electrical conductivity of bamboo shoots

由圖4-A 可知，黃甜竹筍MDA 含量隨著減壓貯藏時間的延長呈上升趨勢，在貯藏0 ～4 d 內(nèi)，減壓貯藏組黃甜竹筍的MDA 含量略低于CK 但差異不明顯，而貯藏6～10 d 時其含量顯著低于CK。

由圖4-B 可知，黃甜竹筍的相對電導(dǎo)率隨著減壓貯藏時間的延長逐漸升高。貯藏第2 天時，減壓貯藏組黃甜竹筍的相對電導(dǎo)率略低于CK 但差異不顯著，貯藏4～10 d 內(nèi)，顯著低于CK。表明減壓貯藏能夠有效抑制去殼黃甜竹筍組織MDA 的累積和相對電導(dǎo)率的升高，有助于保持細(xì)胞膜的完整性。

2.4 減壓貯藏對黃甜竹筍硬度、木質(zhì)素和纖維素含量的影響

由圖5-A、B 可知，黃甜竹筍筍肉組織的硬度和木質(zhì)素含量均隨著減壓貯藏時間的延長呈逐漸上升趨勢，在貯藏0～4 d 內(nèi)，減壓貯藏抑制筍肉硬度和木質(zhì)素含量上升的效果不顯著，而貯藏6 ～10 d，減壓貯藏顯著抑制了筍肉組織硬度和木質(zhì)素含量的上升。同時，貯藏4～10 d 時，減壓貯藏在也顯著抑制了筍肉組織中纖維素的累積(圖5-C)。表明減壓貯藏能夠有效抑制去殼黃甜竹筍組織中木質(zhì)素和纖維素的累積，并延緩筍肉硬度的上升。

圖5 減壓貯藏對黃甜竹筍硬度、木質(zhì)素和纖維素含量的影響Fig.5 Effects of hypobaric storage on firmness and contents of lignin and cellulose of bamboo shoots

2.5 減壓貯藏對PAL、POD、CAD、PPO 活性的影響

由圖6 可知，CK 與減壓貯藏黃甜竹筍的PAL 和CAD 活性在貯藏期內(nèi)均呈上升趨勢，減壓貯藏組黃甜竹筍的PAL 和CAD 活性在貯藏4 ～10 d 內(nèi)顯著低于CK。CK 與減壓貯藏黃甜竹筍的POD 和PPO 活性變化規(guī)律相似，在貯藏2 ～10 d 內(nèi)減壓貯藏顯著抑制了筍肉組織POD 和PPO 活性。表明減壓貯藏能夠有效抑制去殼黃甜竹筍中木質(zhì)素合成關(guān)鍵酶和褐變關(guān)鍵酶活性的上升。

圖6 減壓貯藏對黃甜竹筍的PAL、POD、CAD、PPO 活性的影響Fig.6 Effects of hypobaric storage on activities of PAL，POD，CAD and PPO of bamboo shoots

2.6 減壓貯藏對黃甜竹筍PAL1、POD、CAD 和PPO基因表達(dá)的影響

CK 與減壓貯藏組黃甜竹筍中PAL1 和CAD基因相對表達(dá)水平在貯藏期內(nèi)總體呈下降趨勢，且伴有一定的波動，減壓貯藏組黃甜竹筍的PAL1 基因相對表達(dá)水平在貯藏第2 天和貯藏6 ～8 d 時顯著低于CK，CAD基因相對表達(dá)水平在貯藏2、6、10 d 顯著低于CK。CK 與減壓貯藏組黃甜竹筍的POD基因相對表達(dá)水平在貯藏期內(nèi)呈先上升而后下降再上升的波動變化，減壓貯藏組黃甜竹筍的POD基因相對表達(dá)水平在貯藏6～10 d 時顯著低于CK。CK 與減壓貯藏組黃甜竹筍的PPO基因相對表達(dá)水平在貯藏期內(nèi)也呈先上升而后下降再較平緩波動的變化趨勢，減壓貯藏組黃甜竹筍PPO基因相對表達(dá)水平在貯藏第2 天和貯藏6～10 d 時顯著低于CK。表明減壓貯藏能夠在大部分貯藏期間有效下調(diào)去殼黃甜竹筍中木質(zhì)素合成關(guān)鍵酶和褐變關(guān)鍵酶的基因表達(dá)水平。

3 討論

呼吸會導(dǎo)致果蔬水分和干物質(zhì)的損失，引起采后果蔬失重失鮮等[18-19]。因此，降低呼吸速率對于延緩采后黃甜竹筍的品質(zhì)下降至關(guān)重要。本研究發(fā)現(xiàn)，55 kPa 減壓貯藏條件下能夠顯著抑制去殼黃甜竹筍冷藏過程中呼吸速率的上升，與An 等[4]和程曦等[12]減壓貯藏草莓和皺葉萵苣以及雙孢菇的研究結(jié)果一致。說明減壓貯藏能夠通過抑制黃甜竹筍的呼吸速率來保持品質(zhì)。

圖7 減壓貯藏對黃甜竹筍PAL1、CAD、POD、PPO 基因表達(dá)的影響Fig.7 Effects of hypobaric storage on relative gene expression levels of PAL1、CAD、POD and PPO in bamboo shoots

有學(xué)者指出，采收期間的機(jī)械損傷會誘導(dǎo)竹筍筍肉組織中木質(zhì)素合成代謝加速，促進(jìn)纖維素、木質(zhì)素持續(xù)快速合成并導(dǎo)致筍肉硬度快速增加，使竹筍采后食用品質(zhì)迅速下降[18-19，21]。木質(zhì)素是植物苯丙烷類代謝中一系列酶促反應(yīng)的產(chǎn)物，其中PAL 是該代謝途徑第一個關(guān)鍵限速酶，CAD 是中間步驟的關(guān)鍵酶，而POD 是最后一個關(guān)鍵酶，能催化木質(zhì)素單體聚合生成木質(zhì)素大分子[18，21]。Zheng 等[21]研究發(fā)現(xiàn)，外源草酸處理能夠通過抑制去殼高節(jié)筍中PAL、CAD 和POD等酶的活性進(jìn)而抑制筍肉組織硬度的上升以及木質(zhì)素和纖維素的累積，與Luo 等[22]研究熱處理抑制竹筍組織中木質(zhì)素累積的結(jié)果和所闡述的調(diào)控機(jī)制一致。本研究結(jié)果表明，與CK 相比，55 kPa 減壓貯藏顯著抑制了去殼黃甜竹筍筍肉PAL、CAD 和POD 活性的上升，同時抑制了筍肉硬度的增加以及纖維素和木質(zhì)素的累積，與Gao 等[23]研究減壓貯藏延緩低溫冷藏下枇杷果肉木質(zhì)化的結(jié)果以及所揭示的機(jī)制一致。前人研究發(fā)現(xiàn)，果蔬中木質(zhì)素代謝關(guān)鍵酶的基因表達(dá)也參與調(diào)控木質(zhì)素的累積，如EjCAD1、EjPOD的表達(dá)與枇杷的木質(zhì)化進(jìn)程密切相關(guān)[24]，氯化鈣處理能夠通過下調(diào)梨果肉中PpCAD1 和PpCAD2 的基因表達(dá)抑制木質(zhì)素的合成[25]。本研究結(jié)果表明，與CK 相比，減壓貯藏中后期顯著下調(diào)了PAL1、POD和CAD基因的相對表達(dá)量。說明，減壓貯藏能夠抑制木質(zhì)素合成關(guān)鍵酶的活性及其基因相對表達(dá)量進(jìn)而抑制去殼黃甜竹筍筍肉組織的木質(zhì)化進(jìn)程，從而保持其冷藏期間較好的品質(zhì)。

諸多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，果蔬和鮮切果蔬貯藏期間的褐變主要是由于細(xì)胞膜受損后，有氧條件下酚類底物在PPO 和POD 催化下發(fā)生的酶促氧化反應(yīng)所致，褐變嚴(yán)重降低了果蔬的品質(zhì)和商品價值[26-27]。研究發(fā)現(xiàn)，采后一些預(yù)處理措施輔助冷藏能夠有效抑制竹筍的褐變，如，采后水楊酸和外源草酸處理均能有效抑制細(xì)胞膜的損傷并延緩PPO 和POD 活性上升，進(jìn)而有效抑制了竹筍冷藏期間的褐變[21，28]。本研究發(fā)現(xiàn)，減壓貯藏中后期顯著抑制了去殼黃甜竹筍中MDA 的累積和相對電導(dǎo)率的上升，同時遲滯了PPO 和POD 活性上升，并有效延緩了切面L*值下降，抑制了切面褐變，與Song 等[29]在減壓貯藏水蜜桃中的研究結(jié)果相似。果蔬中褐變關(guān)鍵酶的基因表達(dá)也參與調(diào)控其褐變進(jìn)程，如，UV-C 處理能夠通過下調(diào)雙胞蘑菇的蘑菇柄和菌蓋中AbPPO(AbPPO2，AbPPO3 和AbPPO4)基因的相對表達(dá)量抑制蘑菇柄和菌蓋的褐變[30]。本研究中，與CK 相比，減壓貯藏在大部分貯藏時間內(nèi)顯著下調(diào)了POD和PPO基因的相對表達(dá)量。綜上可知，減壓貯藏能夠有效抑制去殼黃甜竹筍冷藏期間褐變進(jìn)程，延緩其品質(zhì)下降。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，55 kPa 減壓貯藏顯著抑制了去殼黃甜竹筍冷藏期間的呼吸速率，有效維持了細(xì)胞膜的完整性并通過抑制POD 和PPO 活性以及下調(diào)編碼基因的表達(dá)量顯著抑制了黃甜竹筍基部切面的褐變，通過抑制PAL、POD 和CAD 的活性及下調(diào)其編碼基因的相對表達(dá)量顯著抑制了筍肉組織中纖維素和木質(zhì)素含量以及硬度的上升，進(jìn)而延緩了產(chǎn)品感官和食用品質(zhì)的下降。表明減壓貯藏可以作為去殼黃甜竹凈筍采后保鮮的一種新方法。