西葫蘆PRSV-W 病毒病抗病種質鑒定及抗性遺傳分析

王凱玥 張沙沙 張國裕 田佳星 張 帆 李海真 王建書 耿麗華

(1北京市農林科學院蔬菜研究中心/農業(yè)農村部華北地區(qū)園藝作物生物學與種質創(chuàng)制重點實驗室/農業(yè)農村部都市農業(yè)(北方)重點實驗室，北京 100097；2河北工程大學園林與生態(tài)工程學院，河北 邯鄲 056038)

西葫蘆(Cucurbita pepoL.)是我國普遍栽培的瓜類蔬菜，其栽培面積及產量均居世界第一[1]。西葫蘆產量高，易于管理，可為種植農戶帶來較好的經濟效益。但西葫蘆生產長期受病毒病的危害，其中番木瓜環(huán)斑病毒西瓜株系(papaya ringspot virus-watermelonstrain，PRSV-W) 常單獨侵染，或與黃瓜花葉病毒(cucumber mosaic virus，CMV)、小西葫蘆黃化花葉病毒(zucchini yellow mosaic virus，ZYMV)、西瓜花葉病毒(watermelon mosaic virus，WMV)等復合侵染西葫蘆等葫蘆科作物，田間發(fā)病普遍[2-4]。西葫蘆植株感染PRSV-W 后會出現花葉、泡斑、蕨葉、植株矮化、果實畸形等癥狀，可造成30%～60%的產量損失，甚至絕產，嚴重影響西葫蘆產量與果實的商品性[5-7]。PRSV-W病通過農事操作中的機械摩擦或蚜蟲刺吸等途徑快速傳播，迄今尚無高效的防治藥劑，栽培抗病品種是減少危害最經濟有效的措施[6，8]。

目前，PRSV-W 抗病種質的評價鑒定、抗性性狀遺傳分析及抗病基因連鎖分子標記的研究多集中于黃瓜[9-11]、西瓜[12-13]及甜瓜[14-15]等葫蘆科作物上。有關中國南瓜PRSV-W 抗性的研究也相對較多[16-18]，但有關西葫蘆PRSV-W 抗性鑒定方法、抗病種質的篩查及抗性性狀遺傳分析的研究鮮有報道[19-21]。特別是國內對現存西葫蘆品種及種質資源的PRSV-W 抗性及抗病性狀遺傳特性研究不足，極大限制了西葫蘆抗病種質資源的挖掘利用及抗病育種研究。因此，本研究在前期初步探索的基礎上[22]，進一步完善西葫蘆PRSV-W 苗期接種鑒定方法，對收集的148 份西葫蘆品種及高代自交系進行抗性評價篩查，并通過對六世代群體的抗性研究揭示PRSV-W 抗病性狀的遺傳規(guī)律，旨在為抗病育種提供抗病種質及技術支持，為進一步分離鑒定抗病基因奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試西葫蘆品種及育種材料(86 份主栽品種，62 份高代自交系)均由北京市農林科學院蔬菜研究中心南瓜課題組收集保存，具體見表1。用于抗病性狀遺傳規(guī)律分析的六世代群體包括母本P1(BV21)、父本P2(BV37)和F1(BV21×BV37)各30 株，F2群體192 株，BC1P1(F1×BV21) 150 株，BC1P2(F1×BV37) 150 株。

表1 本試驗用148 份西葫蘆品種Table 1 148 squash varieties in this study

1.2 PRSV-W 苗期接種方法

供試種子先經40℃干燥處理2 h，再65℃高溫處理2 h，浸種4 h 后于30℃LRH250 恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科學儀器有限公司)催芽(濕度70%)24 h，然后播種于滅菌營養(yǎng)缽中，置于防蟲網室內培養(yǎng)(25 ～30℃)。待子葉展平，撒少量600 目金剛砂于子葉上，用質量濃度為0.5 mg·mL-1的病毒接種液(0.02 mol·L-1磷酸緩沖液研磨攜帶PRSV-W 病毒的葉片組織)摩擦接種。接種15～25 d 后，觀察植株第1 ～第4片真葉的發(fā)病情況，記錄并進行抗病分級，然后取葉片保存于-70℃，備用。148 份不同品種西葫蘆及高代自交系，每份種植7 株，設3 次重復，其中2 株作為空白對照；六世代群體進行單株接種鑒定，選擇母本BV21、父本BV37 及F1各5 株作為空白對照。

西葫蘆對PRSV-W 病的抗性劃分為0 ～4 級(圖1)。其中，0 級:植株無任何癥狀；1 級:少數葉片局部輕微花葉，形態(tài)正常；2 級:多數葉片花葉，形態(tài)正常，個別葉片畸形；3 級:多數葉片嚴重花葉、泡斑，新葉畸形；4 級:幾乎所有葉片嚴重花葉、畸形。按照公式計算植株病情指數(disease index，DI):

DI=100×Σ(各級病株數×各級代表值)/(調查總株數×最高級代表值)。

DI ≤5 為高度抗病(high resistant，HR)；5 ＜DI≤25 為抗病(resistant，R)；25 ＜DI ≤70 為感病(susceptible，S)，DI＞70 為高度感病(high susceptible，HS)。

1.3 DAS-ELISA 及RT-PCR 檢測

使用DAS-ELISA 試劑盒(美國Agdia 公司)進行葉片 PRSV-W 病毒酶聯免疫 ( enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測，具體方法參照試劑盒使用說明。反轉錄PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)分析參照劉勇等[4]的方法。引物:PRSVdF:GACCTACAAGCGTGACTTTAC；PRSVdR:CACCCATG CCATGCATCTTTC。RNA 提取方法參照EasyPure?Plant RNA Kit 試劑盒(北京全式金生物技術有限公司)說明書進行。

1.4 數據統計分析

采用SPSS 13.0 軟件進行試驗數據分析及卡方檢驗。

2 結果與分析

2.1 西葫蘆PRSV-W 抗病種質篩查鑒定

PRSV-W 病毒病接種鑒定結果顯示，在收集的148份西葫蘆材料中，22 份表現為高度抗病(HR)，11 份表現為抗病(R)，抗病總占比為22.3%；12 份表現為感病(S)，103 份表現為高度感病(HS)，感病總占比為77.7%(表2、圖1)。ELISA 與RT-PCR 的檢測結果輔助驗證了表型鑒定結果，但均存在漏檢出材料，其中，ELISA 漏檢出感病材料5 份，RT-PCR 漏檢出3 份。此外，萬盛嬌子與BV23 這2 份種質材料雖然表現抗病，但RT-PCR 也檢測出葉片中存在病毒粒子(表2)。上述結果表明，RT-PCR 檢測結果較ELISA 更為靈敏、可靠。

表2(續(xù))

表3 西葫蘆各世代群體植株PRSV-W 抗性表現Table 3 PRSV-W resistance performance of plants in different generation of Zucchini

2.2 西葫蘆PRSV-W 抗病性狀遺傳分析

抗病種質材料中，高代自交系BV21 表現為非常高的抗性，接種PRSV-W 病毒后未見明顯病癥，由圖3可知，與對照未接種植株無明顯差異；感病自交系BV37 則表現為嚴重感病，新生葉片出現花葉泡斑、嚴重畸形(圖3)。以2 份材料配制六世代群體(P1、P2、F1、F2、BC1P1和BC1P2)，進行PRSV-W 抗性遺傳分析，結果顯示，F2群體中137 株抗病，55 株感病，符合顯性單基因控制性狀的分離比例3 ∶1(χ2=1.36，P=0.24)；回交群體中，與抗性親本BV21 回交，其后代均表現為抗病，與感病親本BV37 回交，其后代的抗、感單株分離比符合1 ∶1(χ2=1.71，P=0.19)(表3)。綜上表明，BV21 的PRSV-W 抗性受1 對顯性抗病基因控制。

圖1 西葫蘆PRSV-W 病苗期鑒定抗性分級Fig.1 Identification and resistance classification of PRSV-W disease in Summer squash

3 討論

3.1 西葫蘆PRSV-W 抗病種質的評價鑒定

準確、高效簡便的PRSV-W 抗性鑒定方法及抗病種質資源的篩查是西葫蘆抗病育種的重要組成部分。Barbosa 等[6]利用性狀觀察結合ELISA 檢測，篩查獲得8 份中等抗性的南瓜種質材料；Nogueira 等[19]利用兩次病毒子葉摩擦接種法對16 份西葫蘆雜交種及8份自交系進行了PRSV-W 抗性接種鑒定，獲得了1 份抗病雜交種材料。本研究經過對收集的西葫蘆種質資源進行廣泛的PRSV-W 接種試驗，建立了簡便高效的苗期抗性鑒定技術，并利用ELISA 及RT-PCR 技術驗證了抗性性狀分級的科學性，同時對國內主要西葫蘆栽培品種進行了統一的抗性篩查評價，獲得22 份高抗

圖2 部分西葫蘆育種材料PRSV-W 病毒病的RT-PCR 分析Fig.2 RT-PCR analysis of PRSV-W virus disease of part of Zucchini breeding material

圖3 西葫蘆PRSV-W 病毒病抗、感親本材料Fig.3 Symptom expressions on the resistant and susceptible parent lines of squash to PRSV-W infection

種質資源，這對我國西葫蘆生產中的品種選擇及PRSV-W 抗病育種具有較高的利用價值。

3.2 西葫蘆PRSV-W 病毒病的抗性遺傳規(guī)律

不同葫蘆科作物對PRSV-W 抗性的遺傳規(guī)律不同，甚至同一作物不同種質材料間的抗性控制基因也存在差異。黃瓜對PRSV-W 的抗性既存在顯性控制基因也有隱性控制基因[9-11，23-24]；西瓜則受1 個隱性[13]或2 個具有加性且不完全顯性效應的抗病基因控制[12，25-26]；甜瓜及葫蘆則表現為單顯性抗病基因[14，26-27]。Brown 等[16]研究認為中國南瓜野生近緣種Nigerian Local 攜帶1 個隱性抗病基因prv，是中國南瓜及西葫蘆栽培種中PRSV-W 抗性基因的來源，不過McPhail-Medina 等[17]和Seda-Martinez[18]則認為該材料的抗性至少受1 個顯性抗性基因及1 個顯性上位抑制基因控制。de Oliveira 等[5]研究表明，中國南瓜的PRSV-W 抗性受1 個不完全顯性抗病基因控制。南瓜(C.ecuadorensis)中PRSV 抗性受單顯性基因控制[28]，而印度南瓜的PRSV-W 抗性可能受2 ～3 個基因控制[29]。西葫蘆Whitaker 中的PRSV-W 抗性可能受1個主效基因及多個微效基因的調控[20]。本研究認為西葫蘆BV21 的抗性受單顯性抗病基因控制，以上研究結果之間的差異可能取決于抗性材料的選擇，以及抗、感群體劃分標準的不同。

4 結論

本研究建立并完善了西葫蘆PRSV-W 病的苗期人工接種鑒定方法，并對高代自交系育種材料及國內目前主栽西葫蘆品種進行了系統的抗性評價篩查，獲得了22 份高抗PRSV-W 種質材料，同時揭示了西葫蘆自交系BV21 的PRSV-W 抗性受單顯性基因控制。本研究為西葫蘆PRSV-W 抗病育種提供了種質材料及技術支持，也對生產中抗病品種的選擇及進一步分離鑒定抗病基因具有重要意義。