杏山梨醇脫氫酶基因克隆及其在果實(shí)發(fā)育過程中的表達(dá)與酶活性分析

聶佩顯 王來平 韓雪平 路 超 薛曉敏

(山東省果樹研究所，山東 泰安 271000)

山梨醇不僅是薔薇科果樹葉片光合作用的主要產(chǎn)物，而且還是韌皮部碳水化合物的主要運(yùn)輸物質(zhì)[1-2]，與植物的生長(zhǎng)、果實(shí)品質(zhì)與產(chǎn)量等密切相關(guān)[3]，在響應(yīng)生物脅迫和非生物脅迫過程中具有重要作用[4]。山梨醇在薔薇科植物源葉中生成，經(jīng)韌皮部運(yùn)輸卸載至庫器官[1]。盡管韌皮部運(yùn)輸?shù)纳嚼娲妓急壤芨?，但是多?shù)薔薇科植物的果實(shí)并不積累山梨醇[4-5]。很大一部分山梨醇通過韌皮部卸載進(jìn)入果實(shí)后，在山梨醇脫氫酶(sorbitol dehydrogenase，SDH)和山梨醇氧化酶(sorbitol oxidase，SOX)的催化下轉(zhuǎn)化為果糖和葡萄糖[3]。其中SDH 已被證明是薔薇科植物果實(shí)轉(zhuǎn)化山梨醇的最主要酶[5]。SDH 主要有兩種:一種是依賴NAD＋的山梨醇脫氫酶(NAD＋-dependent sorbitol dehydrogenase，NAD＋-SDH)，其主要作用是催化山梨醇與果糖的相互轉(zhuǎn)化；另一種是依賴NADP＋的山梨醇脫氫酶(NADP＋-dependent sorbitol dehydrogenase，NADP＋-SDH)，其主要作用是催化山梨醇與葡萄糖的相互轉(zhuǎn)化[3]。NAD＋-SDH 在催化山梨醇和果糖相互轉(zhuǎn)化時(shí)，伴隨著酶活性增強(qiáng)，果實(shí)中碳水化合物含量逐漸積累，并促進(jìn)果實(shí)發(fā)育[3]。因此，NAD＋-SDH 在調(diào)控“庫”強(qiáng)過程中起著關(guān)鍵作用[5]。此外，基于擬南芥突變體的研究發(fā)現(xiàn)，SDH 能夠調(diào)節(jié)植物體內(nèi)多元醇的水平，進(jìn)而影響植物對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)[6]。因此，研究SDH基因表達(dá)和酶活性變化的調(diào)控機(jī)制具有重要的意義。

Yamada 等[7]首先從蘋果果實(shí)中克隆得到NAD＋-SDH基因，通過原核表達(dá)研究證明該基因編碼的蛋白具有NAD＋-SDH 活性。目前已有在蘋果[8]、梨[9]、桃[10]及枇杷[11]等薔薇科植物中克隆該基因的報(bào)道。杏(Prunus armeniacaL.)作為薔薇科李屬的重要經(jīng)濟(jì)樹種，起源于中國(guó)[12]，現(xiàn)研究多集中在種質(zhì)資源創(chuàng)新利用[13-15]、經(jīng)濟(jì)性狀分析[16]、抗寒生理[17-19]等方面，鮮見有關(guān)杏NAD＋-SDH 的相關(guān)研究。本研究選用同源克隆的方法從金太陽杏中分離得到NAD＋-SDH基因，并結(jié)合生物信息學(xué)方法，初步分析其基因序列特征及編碼蛋白結(jié)構(gòu)特征，并研究其在杏果實(shí)發(fā)育過程中的表達(dá)特性及酶活性變化，旨在為進(jìn)一步驗(yàn)證和解析杏NAD＋-SDH基因的功能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料金太陽杏取自山東省果樹研究所苗圃(山東省泰安市，北緯36°11′，東經(jīng)117°6′，海拔153 m)。選取生長(zhǎng)相對(duì)一致的3 株8年生成年樹，每棵樹在4 個(gè)方位隨機(jī)采取。果實(shí)自盛花后7 d 開始取樣，每隔2 周取一次，直至商品成熟期，即在花后7、21、35、49 和56 d 采樣，每次采樣20 個(gè)果實(shí)，取果肉液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 RNA 提取和反轉(zhuǎn)錄cDNA

利用HiPure Plant RNA Maxi Kit (美基生物Magen，廣州)試劑盒提取供試材料總RNA。cDNA 第一鏈的合成按5X All-In-One RT MasterMix(艾可莘生物科技有限公司，北京)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟進(jìn)行，反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 NAD+-SDH 基因的克隆

根據(jù)NCBI 登記的蘋果、梨、桃等薔薇科果樹的NAD＋-SDH基因序列，設(shè)計(jì)全長(zhǎng)引物。

NAD＋-SDH-F(5′-CACGGGGGACTCTAGAATGGGC AAGGGAGGGATGT-3′)；

NAD＋-SDH-R(5′-GACCACCCGGGGATCCCAAATT AAACATGACTTTTATGGCA-3′)。

以杏果實(shí)cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)體系50 μL:模板1 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各1.5 μL，dNTP(2.5 mmol·L-1)4 μL，酶(2.5 U·μL-1)0.5 μL，5×buffer 10 μL，ddH2O 補(bǔ)足至50 μL。PCR 反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性2 min；98℃變性10 s，55℃退火5 s，72℃延伸100 s，35 個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。利用1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，使用美基生物公司(廣州)凝膠回收試劑盒回收目的基因，回收目的產(chǎn)物連接到克隆載體pTOPO-Blunt 上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH52 感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性克隆，提取質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序(上海生工生物工程有限公司北京測(cè)序部)。

1.4 生物信息學(xué)分析

使用DNAMAN 軟件對(duì)該基因編碼蛋白進(jìn)行氨基酸序列的分析，并將氨基酸序列提交NCBI，利用BLAST 進(jìn)行序列比對(duì)，分析與其他物種的相似性及其功能保守結(jié)構(gòu)域，利用MEGA-X 鄰近法構(gòu)建進(jìn)化樹，將自展循環(huán)次數(shù)(No.of Bootstrap Replications)設(shè)為1 000； 將目的氨基酸序列提交ExPASy 網(wǎng)站(https:/ /web.expasy.org/protparam)進(jìn)行在線分析預(yù)測(cè)該蛋白的理化性質(zhì)；在SOPMA 和Phyre2 網(wǎng)站對(duì)目的蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行在線分析[20]。

1.5 NAD+-SDH 基因在杏果實(shí)發(fā)育過程中的表達(dá)分析

分別提取金太陽杏果實(shí)5 個(gè)發(fā)育時(shí)期的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 備用。根據(jù)從金太陽杏中擴(kuò)增的NAD＋-SDH的開放閱讀框架(open read frame，ORF)序列設(shè)計(jì)特異性實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative realtime PCR，RT-qPCR)引物，如下所示:

PaNAD＋-SDH-F(5′-ACATTGTTCTTAGTGGTGGGT C-3′)；

PaNAD＋-SDH-R(5′-GCTCACATCTACTCCACCTTT C-3′)。

以Actin作為內(nèi)參基因[21]，如下所示:

ACTIN-F(5′-ACATTGTTCTTAGTGGTGGGTC-3′)；

ACTIN-R(5′-AGATTCGTCATACTCTGCCTTT-3′)。

RT-qPCR 采用Trans Start Top Green qPCR Super Mix 熒光定量試劑盒(全式金生物技術(shù)有限公司，北京)，使用20 μL 體系于7500 型PCR 儀(Applied Biosystems，美國(guó))檢測(cè)NAD＋-SDH基因表達(dá)水平。反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性30 s；94℃變性5 s，58℃退火15 s，35 個(gè)循環(huán)。每樣品重復(fù)3 次，采用2-ΔΔCt的方法分析相對(duì)表達(dá)量。

1.6 SDH 酶活性測(cè)定

NAD＋-SDH 酶液的提取及活性測(cè)定參考梁東等[22]的方法，所有操作均在4℃下進(jìn)行。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)采用Microsoft Office Excel 2010 和SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PaNAD+-SDH 基因的克隆及序列分析

以金太陽杏果實(shí)cDNA 為模板，通過PCR 擴(kuò)增，電泳后得到一條約1 100 bp 的單一條帶(圖1)，與預(yù)期長(zhǎng)度一致。測(cè)序結(jié)果顯示，該擴(kuò)增片段包含一個(gè)長(zhǎng)度為1 104 bp 的ORF，編碼367 個(gè)氨基酸(圖2)。比對(duì)結(jié)果顯示，該基因堿基序列與薔薇科李屬梅、桃和李的NAD＋-SDH基因cDNA 序列相似性達(dá)98%以上，表明該基因?yàn)樾拥腘AD＋-SDH基因，命名為PaSDH。

2.2 PaSDH 編碼蛋白理化性質(zhì)與結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)分析

圖1 NAD+-SDH 基因ORF 擴(kuò)增Fig.1 The ORF amplification of NAD+-SDH gene

使用在線工具ExPASy 分析顯示該基因編碼蛋白的相對(duì)分子量為39.19 kDa，理論等電點(diǎn)為6.46，不穩(wěn)定系數(shù)為25.34，屬于穩(wěn)定蛋白，其總平均親水性為0.108，屬于疏水性蛋白。InterProScan 分析表明，PaSDH 蛋白具有含鋅乙醇脫氫酶特征，在序列中具有催化鋅結(jié)合位點(diǎn)、結(jié)構(gòu)鋅結(jié)合位點(diǎn)和NAD 結(jié)合位點(diǎn)等功能位點(diǎn)(圖2)。Signal IP3.0 預(yù)測(cè)PaSDH 蛋白氨基酸序列沒有信號(hào)肽。利用SOPMA 對(duì)PaSDH 蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，其含有30.52%的α-螺旋、6.54%的β-轉(zhuǎn)角、23.16%的延伸鏈和39.78%的無規(guī)則卷曲(圖3)。利用Phyre2 對(duì)其三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，以c1pl6A 山梨醇脫氫酶的三維結(jié)構(gòu)為模板，對(duì)349 個(gè)殘基(95%的序列)建模，置信度為100%，結(jié)果如圖4 所示。

圖2 NAD+-SDH 基因的核苷酸序列及其編碼氨基酸序列Fig.2 The nucleotide acid sequence and amino acid sequence of NAD+-SDH gene

圖3 PaSDH 基因編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.3 The secondary structure prediction of PaSDH gene encoding protein

圖4 PaSDH 基因編碼蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.4 Tertiary structure prediction of the PaSDH

2.3 PaSDH 氨基酸多序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

將PaSDH 氨基酸序列與GeneBank 中登錄的薔薇科植物NAD＋-SDH 氨基酸序列進(jìn)行同源性比較，采用MEGA-X 軟件中的鄰接法構(gòu)建進(jìn)化樹(圖5)。從系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系來看，杏PaSDH 氨基酸序列與薔薇科李屬植物梅(Prunus mume，XP ＿008234305.1)、桃(Prunus persica，XP ＿ 007218159.1)、 李(Prunus salicina，ACL18054.1 )、 甜 櫻 桃 (Prunus avium，XP ＿021826929.1)、酸櫻桃(Prunus cerasus，AAK71492.1)和日本櫻花(Prunus yedoensis，PQM34387.1)的NAD＋-SDH 氨基酸序列相似性較高，分別為99.46%、98.91%、98.64%、97.82%、96.20%和94.55%，首先聚為一類。

2.4 杏果實(shí)發(fā)育過程中的SDH 酶活性變化和PaSDH 基因的表達(dá)分析

分別在杏果實(shí)花后7、21、35、49 和56 d 測(cè)定SDH酶活性(圖6)，結(jié)果表明，在杏果實(shí)發(fā)育過程中，SDH酶活性呈現(xiàn)“高-低-高-低”的變化趨勢(shì)，花后7 d，果實(shí)中SDH 酶活性最高，花后21 d，SDH 酶活性顯著降低，在花后35 d，SDH 酶活性出現(xiàn)第二個(gè)小高峰，但明顯低于花后7 d，之后SDH 酶活逐漸降低。

利用RT-qPCR 對(duì)PaSDH在杏果實(shí)花后7、21、35、49 和56 d 的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析。結(jié)果表明，花后7 d，PaSDH表達(dá)量最高，之后隨著果實(shí)的發(fā)育成熟，PaSH相對(duì)表達(dá)量逐漸降低，至花后56 d 時(shí)，PaSDH相對(duì)表達(dá)量最低。

3 討論

NAD＋-SDH 酶催化山梨醇和果糖之間的相互轉(zhuǎn)化，其對(duì)果糖的米氏常數(shù)Km 值高于對(duì)山梨醇的Km值，表明該酶更利于向形成果糖的方向起催化作用，是薔薇科植物中山梨醇代謝的關(guān)鍵酶[5]。植物通過山梨醇脫氫酶活性的變化調(diào)節(jié)山梨醇含量以抵御非生物脅迫(干旱脅迫、鹽脅迫)[23]。本研究成功克隆了杏PaSDH基因的全長(zhǎng)cDNA，該基因編碼區(qū)長(zhǎng)為1 104 bp，可編碼367 個(gè)氨基酸。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)PaSDH 蛋白具有含鋅醇脫氫酶特征性氨基酸序列、結(jié)構(gòu)鋅結(jié)合位點(diǎn)和催化鋅結(jié)合位點(diǎn)(圖2)，表明PaSDH編碼的蛋白屬于含鋅乙醇脫氫酶家族。這與前人在蘋果[24]和草莓[25]中的研究結(jié)果相似。本研究中，NAD＋-SDH 進(jìn)化分析表明，PaSDH編碼氨基酸與梅NAD＋-SDH 的氨基酸序列相似性最高，為99.46%，其與薔薇科李屬桃、李、甜櫻桃、酸櫻桃和日本櫻花的SDH 氨基酸序列相似性較高，達(dá)到98.91%～94.55%，說明在薔薇科植物中NAD＋-SDH 的氨基酸序列是高度保守的。蘋果和梨中NAD＋-SDH基因以基因家族的形式存在，在蘋果中已經(jīng)分離得到超過10 個(gè)編碼NAD＋-SDH基因的全長(zhǎng)cDNA[7-8，26]，在梨中也克隆得到10 個(gè)編碼NAD＋-SDH基因片段[9，27]。本研究得到1個(gè)編碼NAD＋-SDH基因的全長(zhǎng)cDNA，隨著最新杏基因組的公布[12]，還將對(duì)杏NAD＋-SDH 家族其他成員進(jìn)行深入探究。

圖5 杏與其他薔薇科植物NAD+-SDH 氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic tree of NAD+-SDH from apricot and other Rosaceae species

通過RT-qPCR 研究杏果實(shí)發(fā)育過程中NAD＋-SDH基因的表達(dá)，并檢測(cè)了酶活性的變化模式。本研究發(fā)現(xiàn)在花后7 d 杏果實(shí)中NAD＋-SDH 的酶活性及PaSDH基因的相對(duì)表達(dá)量最高。因此，認(rèn)為可能在杏坐果和果實(shí)早期的發(fā)育階段，PaSDH起著重要作用，這與梁東等[22]在蘋果上的研究結(jié)果一致。前人在多種薔薇科植物中對(duì)SDH 酶活性、蛋白與轉(zhuǎn)錄之間的關(guān)系進(jìn)行了研究。Yamada 等[10，28]發(fā)現(xiàn)在蘋果和桃果實(shí)生長(zhǎng)過程中NAD＋-SDH基因相對(duì)表達(dá)量和蛋白含量變化趨勢(shì)與酶活性變化很相似，Li 等[29]發(fā)現(xiàn)枇杷果實(shí)中NAD＋-SDH 活性、蛋白含量與轉(zhuǎn)錄量的積累密切相關(guān)，Kim等[30]在李果實(shí)中也發(fā)現(xiàn)相同現(xiàn)象。以上研究結(jié)果均說明NAD＋-SDH基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控可能是調(diào)節(jié)其酶活性的關(guān)鍵步驟。與之不同的是，梨葉片中的NAD＋-SDH 酶活性在幼葉中較高，而在成熟葉中較低，基因表達(dá)量與酶活性變化呈相反趨勢(shì)[31]；在蘋果葉片和果實(shí)以及梨莖尖和花器官中，SDH 酶活性變化與基因表達(dá)模式也存在不一致的情況，說明SDH基因表達(dá)可能存在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制。此外，這種不一致的情況也可能是基因家族成員共同作用的結(jié)果[32]。本研究中，隨著杏果實(shí)的生長(zhǎng)，NAD＋-SDH 酶活性與基因相對(duì)表達(dá)量總體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，這與杏果實(shí)成熟過程中果糖含量逐漸下降的變化趨勢(shì)一致[16]。但在花后35 d，酶活性出現(xiàn)小幅度升高，此時(shí)基因的相對(duì)表達(dá)量卻依然呈下降趨勢(shì)，同樣觀察到酶活性與基因的轉(zhuǎn)錄水平的變化趨勢(shì)并不完全一致的現(xiàn)象，很可能也是由PaSDH 酶活性變化與SDH 基因家族成員的表達(dá)模式不一致造成的，說明在杏果實(shí)發(fā)育早期NAD＋-SDH 酶活性有可能受PaSDH基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控。此外，酶活性與基因轉(zhuǎn)錄水平變化趨勢(shì)不完全一致說明可能還存在其他層次的調(diào)控機(jī)制。

4 結(jié)論

本研究克隆的杏PaSDH基因cDNA 全長(zhǎng)1 104 bp，編碼367 個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)分子量為39.19 kDa。PaSDH基因相對(duì)表達(dá)水平和PaSDH 酶活性在杏果實(shí)發(fā)育早期最高，在果實(shí)成熟過程中呈總體下降趨勢(shì)。但在花后35 d 存在酶活性和基因表達(dá)水平變化不一致的現(xiàn)象，說明可能存在SDH基因家族成員表達(dá)不一致的模式，或是存在除轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控外的其他層次的調(diào)控機(jī)制。本研究為解析杏SDH基因表達(dá)模式及調(diào)控機(jī)制奠定了分子生物學(xué)基礎(chǔ)。