不同茬次和高度熱研四號王草的乳酸菌分布及青貯發(fā)酵品質(zhì)

陳鑫珠，張建國

（1.華南農(nóng)業(yè)大學南方草業(yè)研究中心，廣東 廣州510642；2.福建省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，福建 福州350013）

熱研四號王草（Pennisetum purpereum×P.typhoideumcv.Reyan No.4）屬禾本科狼尾草屬多年生草本植物，由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院從國際熱帶農(nóng)業(yè)中心引進并經(jīng)多年試驗選育而成［1］，是我國南方種植面積最大的優(yōu)良牧草之一，但其生產(chǎn)具有鮮明的季節(jié)性，因此在產(chǎn)草旺季對其加工貯存尤為重要［2?3］。刈割是牧草管理的常規(guī)方式，刈割時期、次數(shù)、頻次對牧草產(chǎn)量與品質(zhì)的影響有較多研究報道［4?12］。高赟等［4］研究表明，飼用玉米（Zea mays）刈割次數(shù)增加，其粗蛋白（crude protein，CP）、粗纖維（crude fiber，CF）、干物質(zhì)（dry matter，DM）、磷、鈣的含量下降，鮮草胡蘿卜素含量呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，但刈割次數(shù)不影響粗灰分和粗脂肪含量。陳曉東等［5］報道，大麥（Hordeum vulgare）第1 茬飼草產(chǎn)量與品質(zhì)均高于第2 茬。雷荷仙等［6］報道，茬次對多花黑麥草（Lolium multiflorum）的營養(yǎng)成分及細胞壁各物質(zhì)含量有明顯影響，其粗灰分、中性洗滌纖維（neutral detergent fiber，NDF）和酸性洗滌纖維（acid detergent fiber，ADF）含量隨刈割茬次的增加而增加，而粗蛋白則隨刈割茬次的增加而降低。呂仁龍等［7］報道，青貯前和青貯后，王草中葉綠素和葉綠醇含量均隨著刈割高度的增加而顯著降低。多花黑麥草第2茬青貯效果優(yōu)于第1 和3 茬［8］。綜上所述，茬次和高度對牧草的營養(yǎng)成分和青貯發(fā)酵品質(zhì)有顯著影響，然而關(guān)于刈割茬次和高度對牧草乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）分布的研究卻鮮有報道。有研究表明牧草刈割茬次改變了土壤細菌群落結(jié)構(gòu)［13］，但對地上部分牧草植株細菌群落是否影響未見研究報道。本研究旨在研究刈割茬次和高度對熱研四號王草的乳酸菌分布和青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響，以便為我國南方地區(qū)熱研四號王草合理利用和大規(guī)模青貯推廣應用提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及其種植管理概況

熱研四號王草2011 年2 月28 日種植于華南農(nóng)業(yè)大學增城寧西試驗基地，N 23°14′，E 113°38′。該地屬亞熱帶季風氣候，年平均氣溫為21.6 ℃，7 月最熱，平均氣溫達33.7 ℃，極端最高氣溫39.1 ℃；最冷為1 月，平均氣溫為14.9 ℃，極端最低氣溫4 ℃。全年積溫7910.9 ℃，年平均降水量為1801.2 mm，年平均太陽輻射值為4367.2～4597.3 MJ·m?2，年平均日照時數(shù)為1707.2 h。試驗區(qū)土壤類型為水稻土，土壤基礎肥力為有機質(zhì)10.2 g·kg?1，全氮0.85 g·kg?1，全磷0.62 g·kg?1，全鉀14.82 g·kg?1，速效氮32.35 mg·kg?1，速效磷76.19 mg·kg?1，速效鉀85.42 mg·kg?1，pH 為5.40。于2011 年5 月25 日采集第1 茬1.0、1.5 和2.0 m 樣本，2011 年8 月23 日采集第2 茬1.0、1.5 和2.0 m 樣本，2011 年11 月5 日采集第3 茬1.0、1.5 和2.0 m 樣本。

1.2 試驗設計

采用雙因素分析熱研四號王草3 個茬次（第1、2 和3 茬）和3 個高度（1.0、1.5 和2.0 m）的乳酸菌的數(shù)量和種類分布、營養(yǎng)特性及青貯發(fā)酵品質(zhì)。

材料采集：每個樣品戴無菌手套距地面10 cm 用滅菌后的剪刀剪取2 份試驗所需材料，裝入無菌封口袋（一份約100 g 用于微生物分析，一份約500 g 用于青貯調(diào)制），放置冷藏箱中冷藏，帶回實驗室立即分析。

1.3 分析方法

取備好的微生物分析樣本，在超凈工作臺內(nèi)每個樣本稱取50 g，用無菌剪刀剪成10 cm 左右，放入無菌聚乙烯袋中，加入250 mL 無菌洗脫液（0.1 mol·L?1磷酸鉀?0.1%吐溫緩沖液，pH 7.0），將空氣排盡封口，在200 r·min?1搖床中振蕩30 min。開封后，先取10 mL 洗脫液預留做劃板培養(yǎng)，其余洗脫液用50 mL 離心管收集，采用高速冷凍離心機（臺式高速冷凍離心機H1850R，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）14000 r·min?14 ℃離心10 min，收集沉淀，?20 ℃冰箱保存［14］。

取青貯調(diào)制樣品，每個樣本稱取3 份150 g 用無菌剪刀剪至1～2 cm 混合均勻的原料，裝入聚乙烯袋中，抽真空、密封。常溫條件下貯存60 d 后開封，取樣分析青貯料發(fā)酵品質(zhì)和化學成分。

將每個樣品預留的10 mL 洗脫液進行101～106梯度稀釋后，分別采用MRS 瓊脂培養(yǎng)基（MRS agar medium，MRS）、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（nutrient agar，NA）、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）進行乳酸菌、好氧性細菌、酵母菌和霉菌劃板培養(yǎng)后計數(shù)［14］。乳酸菌用厭氧箱（YQX-Ⅱ型，上海新苗）37 ℃培養(yǎng)2 d；好氧性細菌、酵母菌和霉菌在有氧條件下30 ℃培養(yǎng)2 d。

MRS 組成及配制：蛋白胨10.0 g、牛肉膏10.0 g、酵母提取物5.0 g、葡萄糖5.0 g、吐溫80 1.0 mL、乙酸鈉5.0 g、檸檬酸二胺2.0 g、磷酸氫二鉀2.0 g、MgSO4·7H2O 0.1 g、MgSO4·7H2O 0.05 g、瓊脂15.0 g、蒸餾水1.0 L，pH 調(diào)至6.8，121 ℃高壓滅菌25 min。

NA 組成及配制：蛋白胨10.0 g、牛肉膏5.0 g、氯化鈉5.0 g、瓊脂15.0 g、蒸餾水1.0 L，pH 調(diào)至7.0，121 ℃高壓滅菌25 min。

PDA 組成：葡萄糖20.0 g、馬鈴薯浸出液粉4.0 g、瓊脂15.0 g、蒸餾水1.0 L，121 ℃高壓滅菌25 min，再用滅菌酒石酸調(diào)pH 至3.5。

不同刈割高度和茬次所取樣品按常規(guī)方法放置105 ℃烘箱殺青30 min 后，置65 ℃烘箱干燥48 h 測得干物質(zhì)（DM）；緩沖能（buffer capacity，BC）采用鹽酸、氫氧化鈉滴定法測定［15］；參考《飼料分析及飼料質(zhì)量檢測技術(shù)》［16］測定風干樣本的粗蛋白質(zhì)（CP）、中性洗滌纖維（NDF）、酸性洗滌纖維（ADF）和半纖維素（hemi-cellulose，HC）含量；可溶性碳水化合物（water soluble-carbohydrate，WSC）采用Anthrone 比色法定量［17］，同時取10 mL 的浸提液，在浸提液中加入少量陽離子交換樹脂，離心機12000 r·min?1離心10 min，用0.22 μm 微孔濾膜過濾后，采用LC-20AT高效液相色譜儀測定棉子糖、蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、木糖、半乳糖和果糖，色譜條件：色譜柱（SUGAR P0810，日本），流動相為超純水，流速0.8 mL·min?1，柱溫75 ℃，檢測器為RID-10A 紫外檢測器［14］。

取具代表性青貯樣品20 g 加入80 mL 蒸餾水，放置4 ℃冰箱中8 h 后濾紙過濾收集濾液，測定濾液的pH；取5 mL 濾液加入樹脂經(jīng)12000 r·min?1離心10 min 后取上清液，該上清液再用孔徑0.22 μm 的濾膜過濾后，采用LC-20AT 高效液相分析儀（色譜柱：Shodex Rspak KC-811S-DVB gel Column 30 mm×8 mm；檢測器：SPDM10AVp；流動相：3 mmol·L?1高氯酸）測定乳酸（lactic acid，LA）、乙酸（acetic acid，AA）、丙酸（propionic acid，PA）和丁酸（butyric acid，BA）含量［18］。

1.4 乳酸菌的鑒定

乳酸菌分離與純化參考張慧杰等［19］的方法進行，形態(tài)學和生理生化特性檢測參考凌代文等［20］的方法進行。純化后將不同形態(tài)、生理生化表現(xiàn)的乳酸菌株進行全長DNA 提取，并采用乳酸菌通用引物進行擴增，擴增后的PCR 產(chǎn)物送華大生物科技有限公司（中國，廣州）測序，獲得16S rDNA 序列信息后與GeneBank 基因庫中16S rDNA 序列進行比對［21］。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

用Excel 對數(shù)據(jù)進行整理，采用SPSS 17.0 軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析，采用Duncan 法對均值進行多重比較，對材料特性進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同茬次和高度下熱研四號王草的特性

茬次對熱研四號王草的DM、CP、WSC、pH、BC、ADF、HC、棉籽糖、蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、果糖和乳酸菌數(shù)量均有極顯著（P＜0.01）影響，對NDF 有顯著（P＜0.05）影響；高度對DM、CP、WSC、BC、pH、NDF、ADF、麥芽糖含量均有極顯著（P＜0.01）影響，對蔗糖、葡萄糖和果糖含量有顯著（P＜0.05）影響；茬次和高度對CP、WSC、pH、NDF、蔗糖、麥芽糖和果糖有極顯著（P＜0.01）的交互作用，對BC、ADF、葡萄糖和乳酸菌數(shù)量有顯著（P＜0.05）的交互作用（表1）。

表1 不同茬次和高度下熱研四號王草的特性Table 1 The characteristic of different cutting and height of Reyan No.4 king grass

熱研四號王草第1 茬的pH 值、ADF、棉籽糖、蔗糖、麥芽糖和果糖的含量顯著（P＜0.05）高于第2 和3 茬，NDF、HC 和LAB 數(shù)量顯著（P＜0.05）低于第2 和3 茬；第2 茬的DM、HC 和霉菌的數(shù)量顯著（P＜0.05）高于第1和3 茬，CP 和ADF 顯著（P＜0.05）低于第1 和3 茬；第3 茬的BC、葡萄糖和酵母菌數(shù)量顯著（P＜0.05）高于第1 和2 茬，WSC 顯著（P＜0.05）低于第1 和2 茬。

熱研四號王草1.0 m 高度的CP 和pH 值顯著（P＜0.05）高于、NDF 顯著（P＜0.05）低于1.5 和2.0 m 高度；1.5 m 高度的麥芽糖顯著（P＜0.05）高于、蔗糖和果糖顯著（P＜0.05）低于1.0 和2.0 m 高度；2.0 m 的DM、NDF和ADF 顯著（P＜0.05）高于、pH 值顯著（P＜0.05）低于1.0 和1.5 m 高度。

2.2 不同茬次和高度下熱研四號王草的青貯發(fā)酵品質(zhì)

不同茬次和高度下熱研四號王草的青貯發(fā)酵品質(zhì)及兩因素方差分析見表2。茬次對熱研四號王草青貯料的pH、乙酸和丁酸含量均有極顯著影響（P＜0.01），對青貯料的乳酸有顯著（P＜0.05）影響；高度對青貯料的pH 和乙酸有極顯著（P＜0.01）影響，對青貯料的DM 和氨態(tài)氮有顯著（P＜0.05）影響；茬次和高度對pH 值有極顯著（P＜0.01）的交互作用，對氨態(tài)氮有顯著（P＜0.05）的交互作用。

表2 不同茬次和高度下熱研四號的發(fā)酵品質(zhì)Table 2 The fermentation characteristics of different cutting and height of Reyan No.4 king grass

熱研四號王草青貯料中，第1 茬的丁酸和氨態(tài)氮含量顯著（P＜0.05）高于第2 和3 茬；第2 茬pH 顯著（P＜0.05）低于第1 和3 茬，乳酸含量顯著（P＜0.05）高于第1 和3 茬；第3 茬乙酸含量顯著（P＜0.05）低于第1 茬。

熱研四號王草青貯料中，1.0 m 高度的乙酸含量顯著（P＜0.05）高于1.5 和2.0 m 高度；1.5 m 高度的氨態(tài)氮含量顯著（P＜0.05）高于1.0 和2.0 m 高度；2.0 m 高度DM 含量顯著（P＜0.05）高于1.0 和1.5 m 高度，pH 值顯著（P＜0.05）低于1.0 和1.5 m 高度。

2.3 不同茬次和高度下熱研四號王草乳酸菌的分布

從熱研四號王草3 個茬次的3 個不同高度共分離了122 株乳酸菌，依形態(tài)、生理生化、碳源發(fā)酵特性進行分組，對各組的代表菌株的16S rDNA 測序、分析比較，發(fā)現(xiàn)有5 種乳酸菌存在，分別是Lactobacillus屬的植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）和戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）、Lactococcus屬的乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）和Weissella屬的融合乳桿菌（Weissella confuse）和魏斯氏菌（Weissella cibaria）（表3）。

表3 代表菌株測序NCBI 比對結(jié)果Table 3 NCBI comparison results of the representative strains

表4 不同茬次和高度下熱研四號王草分離乳酸菌的數(shù)量和種類Table 4 The number and kinds of LAB of different cutting and height of Reyan No.4 king grass

其中第1 茬的1.0、1.5 和2.0 m 植株中植物乳桿菌占絕對優(yōu)勢，分別為93.33%、93.55%和83.33%，1.0 m植株中有少量的乳酸乳球菌（6.66%），1.5 和2.0 m 中有少量的戊糖乳桿菌（6.66%和16.67%）；第2 茬中1.0 m植株植物乳桿菌占64.28%，融合乳桿菌和魏斯氏菌分別占28.57% 和7.14%，1.5 m 植株融合乳桿菌占78.55%，植物乳桿菌占21.42%，從2.0 m 植株只分離到融合乳桿菌；第3 茬1.0 m 植株植物乳桿菌占57.14%、乳酸乳球菌7.14%、融合乳桿菌28.57%和魏斯氏菌7.14%，1.5 m 植株只分離到植物乳桿菌和融合乳桿菌，分別占66.66%和33.33%，2.0 m 植株主要是融合乳桿菌（84.61%）和少量的魏斯氏菌（15.38%）（表4）。

3 討論

刈割是提高牧草飼用價值的有效方式，刈割茬次與飼草品質(zhì)密切相關(guān)［22］，但因不同飼草品種，不同種植管理方式、不同種植地點等因素不同營養(yǎng)指標在不同研究報道中結(jié)果不完全一致。陳曉東等［5］報道，刈割的茬次和高度對飼草的營養(yǎng)成分和青貯品質(zhì)均有影響，隨著飼草高度的增加，其干物質(zhì)、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量逐漸升高，粗蛋白含量逐漸降低，本試驗結(jié)果與此相似。在1.0～2.0 m 高度，熱研四號王草的干物質(zhì)、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量顯著升高，粗蛋白含量和pH 值顯著降低。這與植物的生長發(fā)育和生理特性有關(guān)，植物在幼嫩時期，粗蛋白和水分含量較高，纖維較細較少［23］。蘇曉菲［24］報道，適當增加刈割次數(shù)和有機肥施量可有效提高產(chǎn)量和改善品質(zhì)，但刈割次數(shù)和有機肥施量過多對產(chǎn)量和品質(zhì)的影響不大，不同刈割次數(shù)處理下，紫花苜蓿（Medicago sativa）的產(chǎn)量和粗蛋白含量均隨著有機肥施量的增加而呈上升趨勢，中性及酸性洗滌纖維均隨著有機肥施量增加呈現(xiàn)下降趨勢。楊恒山等［25］和王麗霽［26］的研究表明，隨著生長季中刈割次數(shù)增多，粗蛋白含量及產(chǎn)量均顯著提升，粗纖維含量及產(chǎn)量均顯著下降。于輝等［27］研究表明，隨著刈割次數(shù)的增加，蘇丹草（Sorghum sudanense）的粗纖維水平降低。何振富等［22］研究發(fā)現(xiàn)，中性洗滌纖維含量品種間對刈割茬次的響應程度不一致，酸性洗滌纖維含量品種間對刈割茬次的響應一致，因此表現(xiàn)不同的原因與品種不同有關(guān)。另外，他還發(fā)現(xiàn)對相同品種的營養(yǎng)成分動態(tài)變化中，中性洗滌纖維和酸性洗滌含量均呈“升—降—升”的變化趨勢。董志國等［28］研究表明，新牧1 號紫花苜蓿第1 茬的粗蛋白含量顯著最高，中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維的變化規(guī)律為第3 茬＞第1茬＞第2 茬。羅燕等［8］報道，75%水分多花黑麥草第1 茬的干物質(zhì)和可溶性碳水化合物含量顯著高于第2 和3 茬，第2 茬的粗蛋白含量顯著最高，而65%水分第1 茬的粗蛋白和可溶性碳水化合物顯著高于第2 和3 茬，第3 茬的酸性洗滌纖維最高，其表明第1 茬的多花黑麥草營養(yǎng)成分最高。尉志霞等［29］和Morin 等［30］研究報道，苜蓿第1 茬的營養(yǎng)成分優(yōu)于第2 茬。本試驗與報道結(jié)果不完全一致，熱研四號王草原料中第2 茬的干物質(zhì)含量顯著高于第1 和3 茬，中性洗滌纖維第1 茬顯著最高，酸性洗滌纖維第1 茬顯著最低，這可能與牧草品種、種植區(qū)域和管理方式等不同有關(guān)，但第1 茬的粗蛋白含量和可溶性碳水化合物的含量顯著最高與各報道結(jié)果一致。

青貯發(fā)酵主要影響因素有可溶性碳水化合物、含水量、溫度、厭氧條件及其他等［31?32］。在無任何添加劑處理情況下，影響飼草青貯發(fā)酵的主要因素為飼草含糖量和附生的乳酸菌數(shù)量。有報道［21］表明，原料中的含糖量直接影響青貯品質(zhì)。一般而言，青貯原料中的可溶性碳水化合物含量應為鮮重的3%以上或為干物質(zhì)含量的6%以上方可制成優(yōu)質(zhì)青貯飼料，含糖量過低時（低于2%）則難以制成優(yōu)質(zhì)青貯飼料［31，33?34］。本試驗不同茬次和高度間青貯品質(zhì)均有顯著差異，其中第2 茬的pH、乙酸、丁酸和氨態(tài)氮含量較低，干物質(zhì)和乳酸含量最高，青貯品質(zhì)較佳；3個高度中，2.0 m 的干物質(zhì)和乳酸含量較高，pH 值和氨態(tài)氮含量較低，效果較佳。這與蔣利芳等［35］在紫花苜蓿裹包青貯品質(zhì)的研究中認為第2 茬青貯品質(zhì)優(yōu)于第1 茬和羅燕等［8］在黑麥草75%和65%水分青貯中認為第2 茬的青貯發(fā)酵品質(zhì)最優(yōu)的報道結(jié)果相似。這與尉志霞等［29］和Morin 等［30］在紫花苜蓿上報道的第1 茬的青貯品質(zhì)優(yōu)于第2 茬的結(jié)果不同。可能是第2 茬的營養(yǎng)成分高于第3 茬，雖然低于第1 茬，但因第2 茬附生的乳酸菌含量顯著高于第1 茬，其進行了更充分的乳酸發(fā)酵，保留更多的營養(yǎng)物質(zhì)［8］，故第2 茬青貯料的干物質(zhì)含量顯著最高。因此，滿足優(yōu)質(zhì)青貯含糖量的條件下，乳酸菌就成為青貯發(fā)酵的關(guān)鍵因素［36］。糖分是乳酸菌發(fā)酵時的底物，只有充足的底物含量，才能促進乳酸菌的快速、大量繁殖，使乳酸菌產(chǎn)生足夠數(shù)量的乳酸［37］，提高青貯發(fā)酵品質(zhì)，抑制不良菌的生長繁殖，保留較多的青貯料養(yǎng)分［34］。本試驗中第2 茬和2.0 m 高度中乳酸菌含量最高，與本試驗青貯品質(zhì)最佳組的趨勢相符，再一次證明附生乳酸菌在青貯發(fā)酵中的關(guān)鍵作用。

張慧杰［38］報道，不同茬次的苜蓿上附生的乳酸菌數(shù)量上無顯著差異，原料干物質(zhì)升高，苜蓿表面的乳酸菌的數(shù)量逐漸增多，有害菌的數(shù)量逐漸減少。Holden 等［39］發(fā)現(xiàn)在第1 次刈割和第2 次刈割期間，乳酸菌的數(shù)量呈上升趨勢。不同茬次、高度、生育期和部位的植物乳酸菌數(shù)量和種類存在很大差異，且不同植物品種表現(xiàn)不同［40］。因此，不同茬次和高度的飼草表面乳酸菌種類和數(shù)量有一定的差異，但目前關(guān)于這方面深入的研究報道較少，僅有的報道也只是采用劃板培養(yǎng)法研究乳酸菌數(shù)量差異［39］。本研究劃板培養(yǎng)結(jié)果表明，熱研四號王草第2 和3 茬乳酸菌的數(shù)量顯著高于第1 茬，2.0 m 高度乳酸菌數(shù)量較多，但3 個高度統(tǒng)計學上無顯著差異。不同茬次和高度樣本中分離到的乳酸菌進行種類鑒定后發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌和融合乳桿菌是熱研四號王草的高頻乳酸菌，第1 茬的乳酸菌種類較少，第3 茬的乳酸菌種類較多。

4 結(jié)論

1）隨著熱研四號王草刈割高度增加（1.0～2.0 m），DM、NDF 和ADF 含量顯著升高，CP 含量和pH 值顯著降低；第2 茬的DM 含量最高，第1 茬的CP、WSC 和ADF 含量最高，NDF 含量最低。 2）3 茬熱研四號王草青貯料中，第2 茬的青貯效果優(yōu)于第1 和3 茬；3 個高度青貯料中，2.0 m 高度的青貯效果較佳。3）第2 和3 茬乳酸菌的數(shù)量顯著高于第1 茬，第3 茬的乳酸菌的種類高于第1 茬；2.0 m 高度乳酸菌數(shù)量較多。4）植物乳桿菌和融合乳桿菌是熱研四號王草出現(xiàn)頻率最高的乳酸菌。