響鈴草薄層鑒別研究

石洋 王慧娟 彭禮軍 郝永佳 張 敏*

1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州大學(xué)貴州省藥食同源植物資源開(kāi)發(fā)工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽(yáng) 550025

響鈴草是云南白族常用的民間藥材，為豆科豬屎豆屬條葉豬屎豆C.linifoliaL. f. 或假地藍(lán)CrotalariaferrugineaGrah.的根或全草，又名馬鈴草、狗響鈴、響鈴子、黃花野百合等[1]。響鈴草史載于明代《滇南本草》，其味苦、微酸，性寒，具有補(bǔ)脾腎、斂肺氣、利水、解毒之功效。主要用于久咳痰血、耳鳴耳聾、頭暈?zāi)垦！?mèng)遺、慢性腎炎、膀胱炎、腎結(jié)石、扁桃體炎、淋巴腺炎、惡瘡、月經(jīng)不調(diào)等[2]。

響鈴草的主要化學(xué)成分為黃酮、生物堿、香豆素、有機(jī)酸和甾醇等，其中黃酮類(lèi)物質(zhì)芹菜素、金合歡素、染料木素和山柰素通常作為評(píng)價(jià)該藥材質(zhì)量的重要指標(biāo)[3-5]。目前，從響鈴草質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中關(guān)于黃酮類(lèi)物質(zhì)薄層色譜鑒別的研究中發(fā)現(xiàn)僅存在對(duì)染料木素的鑒別，尚未見(jiàn)對(duì)于其他黃酮類(lèi)成分的薄層鑒別報(bào)道。因此，本文以云南省景谷縣威遠(yuǎn)鎮(zhèn)產(chǎn)響鈴草為研究對(duì)象，對(duì)其進(jìn)行薄層鑒別方法研究，建立響鈴草的薄層鑒別方法，為響鈴草的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立提供支持。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 DK-98型電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)；HZY-A200型電子分析天平(福州華志科學(xué)儀器有限公司)；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；QY-20三用紫外分析儀(上海奧瑞德精密儀器有限公司)；DGG-9246A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海齊欣科學(xué)儀器有限公司)；FW-400A傾斜式高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)。

1.2 試藥 對(duì)照品芹菜素(Q-002-180131)、金合歡素(J-066-180517)、染料木素(R-001-181216)和山柰素(S-004-180911)，均購(gòu)于成都瑞芬思生物科技有限公司；9批響鈴草藥材樣品購(gòu)于藥材市場(chǎng)，分別產(chǎn)于四川、青川、四川成都、云南省景谷縣威遠(yuǎn)鎮(zhèn)、廣西、貴州省安順、福建、云南、貴州，經(jīng)貴陽(yáng)中醫(yī)藥大學(xué)魏升華教授鑒定為豆科植物假地藍(lán)CrotalariaferrugineaGrah.的根或全草。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備 參照文獻(xiàn)總黃酮的提取方法[6]: 稱取樣品粉末用95%乙醇1∶10倍量水浴回流提取2 h，過(guò)濾；再用95%乙醇1∶6倍量水浴回流提取2次，每次1.5 h；合并3次濾液，水浴減壓回收至無(wú)醇味，稠膏趁熱用5%碳酸鈉溶液溶解，過(guò)濾；再用濃鹽酸調(diào)pH=2～3，過(guò)濾，將沉淀干燥即得黃酮粗品。考慮到提取時(shí)間較長(zhǎng)，故將提取時(shí)間減為2 h，其余條件不變，與提取時(shí)間為5 h對(duì)比，發(fā)現(xiàn)不同的提取時(shí)間對(duì)供試液展開(kāi)效果影響不大，考慮到節(jié)省時(shí)間，故將提取時(shí)間定為2 h。另外，還考察了不同堿性處理和酸性條件對(duì)供試液的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)原條件5%的碳酸鈉溶液和pH=2～3處理的供試液展開(kāi)效果最優(yōu)。

響鈴草供試品溶液的制備方法：稱取樣品粉末2 g，加乙醇20 mL，回流提取2 h，過(guò)濾，減壓蒸至無(wú)醇味，稠膏趁熱用5%碳酸鈉溶液溶解，過(guò)濾，再用濃鹽酸調(diào)pH=2～3，靜置沉淀；然后用乙酸乙酯萃取兩次，最后用0.5 mL乙酸乙酯溶解得供試品溶液。

2.2 薄層色譜展開(kāi)條件考察 按2.1下供試品溶液的制備方法制備響鈴草供試品溶液，取適量供試品溶液點(diǎn)于硅膠GF254薄層板上，分別在下展開(kāi)系統(tǒng)中展開(kāi)：①乙酸乙酯-三氯甲烷-水(4∶9∶1)；②環(huán)己烷-乙酸乙酯-水(5∶4∶1)；③乙酸乙酯-氯仿-環(huán)己烷-水(4∶3∶2∶1)，展開(kāi)后，取出晾干，置紫外光燈(254 nm)下檢視。結(jié)果見(jiàn)圖1，在展開(kāi)系統(tǒng)②環(huán)己烷∶乙酸乙酯∶水=5∶4∶1條件下，色譜圖斑點(diǎn)清晰，分離效果最好。在此基礎(chǔ)上，將各組成分間的比例進(jìn)行微調(diào)，考察不同的展開(kāi)劑比例對(duì)分離效果的影響(圖2～4)，最終確定了響鈴草供試品TLC展開(kāi)劑為環(huán)己烷-乙酸乙酯-水(8∶5∶1)。

圖1 不同展開(kāi)系統(tǒng)薄層色譜圖

圖2 不同環(huán)己烷比例薄層色譜圖

圖3 不同乙酸乙酯比例薄層色譜圖

圖4 不同薄層色譜圖

2.3 薄層色譜鑒別 按2.1下供試品溶液的制備方法制備響鈴草供試品溶，取適量供試品溶液與對(duì)照品溶液山柰素(0.5 mg/mL)、金合歡素(0.5 mg/mL)、染料木素(0.25 mg/mL)和芹菜素(0.5 mg/mL)點(diǎn)于硅膠GF254薄層板上，以環(huán)己烷∶乙酸乙酯∶水=8∶5∶1為展開(kāi)劑，展開(kāi)后，取出晾干，置紫外光燈(254 nm)下檢視。結(jié)果如圖7所示，響鈴草中黃酮類(lèi)成分在紫外光254 nm下與山柰萘素、金合歡素和染料木素在相對(duì)應(yīng)的位置顯相同顏色斑點(diǎn)。

2.4 方法耐用性考察

2.4.1 重復(fù)性考察 分別稱取三份響鈴草粉末，按2. 1下方法制備成三份平行供試液。將三份供試液點(diǎn)于同一薄層層析板上，以環(huán)己烷∶乙酸乙酯∶水=8∶5∶1為展開(kāi)劑，展開(kāi)后，取出晾干，置紫外燈(254 nm)下檢視，結(jié)果顯示重復(fù)性較好。

圖5 響鈴草的薄層色譜圖

2.4.2 不同薄層板分離效果考察 取供試品和對(duì)照品溶液分別點(diǎn)于青島海洋化工廠、煙臺(tái)市芝罘黃務(wù)硅膠開(kāi)發(fā)試驗(yàn)廠以及自制的硅膠薄層板上。除自制硅膠板分離效果稍差外，商品化的預(yù)制板均具有良好的分離效果。

2.4.3 不同溫度對(duì)分離效果影響的考察 將供試品和對(duì)照品溶液點(diǎn)于硅膠薄層板上，分別在4 ℃、室溫(28 ℃)以及37 ℃的環(huán)境下展開(kāi)。結(jié)果表明在上述條件下都能較好分離，斑點(diǎn)清晰，未有明顯差異。

2.4.4 不同濕度對(duì)分離效果影響的考察 將供試品和對(duì)照品溶液點(diǎn)于硅膠薄層板上，在室溫下，相對(duì)濕度分別為18%、32%、58%、72%、88%下展開(kāi)。結(jié)果顯示，在18%～88%相對(duì)濕度條件下分離結(jié)果相似，不同濕度對(duì)響鈴草的薄層鑒別沒(méi)有影響。

2.5 不同批次響鈴草薄層色譜 將產(chǎn)地分別為貴州、云南景谷縣威遠(yuǎn)鎮(zhèn)、四川、四川成都、廣西、貴州安順、福建、云南以及青川共九個(gè)不同批次的響鈴草藥材制備成相對(duì)應(yīng)的的供試品溶液，將其與對(duì)照品溶液點(diǎn)于同一薄層板上，以環(huán)己烷∶乙酸乙酯∶水=8∶5∶1為展開(kāi)劑，展開(kāi)后，取出晾干，置紫外光燈(254 nm)下檢視，結(jié)果如圖6所示。

圖6 不同批次響鈴草薄層色譜圖

9批響鈴草藥材中以云南景谷縣威遠(yuǎn)鎮(zhèn)所產(chǎn)響鈴草的展開(kāi)斑點(diǎn)較為清晰明顯，故而將其作為對(duì)照藥材。不同產(chǎn)地的響鈴草中各黃酮類(lèi)成分稍有不同，含量也有一定差異，但9批響鈴草的薄層色譜圖中除了來(lái)自福建的斑點(diǎn)很不清晰外，均可見(jiàn)與染料木素、金合歡素以及山柰素在其相對(duì)應(yīng)位置顯相同斑點(diǎn)。部分批次供試品與芹菜素在相同位置顯相同顏色斑點(diǎn)。

3 討論

黃酮類(lèi)化合物是響鈴草的主要活性成分之一，其中金合歡素、染料木素和山柰素等具有多種藥理作用，通常是評(píng)價(jià)該藥材質(zhì)量的重要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)研究了響鈴草中黃酮類(lèi)成分薄層色譜鑒別，主要包括對(duì)供試品溶液的制備方法以及TLC展開(kāi)條件的考察，為響鈴草藥材建立安全、易操作、專屬性強(qiáng)的薄層色譜鑒別方法。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)從響鈴草藥材中同時(shí)鑒別出染料木素、金合歡素以及山奈素，進(jìn)一步為評(píng)價(jià)響鈴草的質(zhì)量和響鈴草資源的開(kāi)發(fā)利用提供參考，也為完善響鈴草藥材薄層鑒別方法以及全面評(píng)價(jià)響鈴草藥材提供實(shí)驗(yàn)資料和科學(xué)依據(jù)。