牦牛骨膠原蛋白肽的制備及其抗凍性能研究

譚 楊，陳曉宇，郭 文，吳嘉穎，阿提坎·吾斯曼，曹 慧

（上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093）

抗凍蛋白（antifreeze proteins，AFPs）亦可稱作冰結(jié)合蛋白（Ice binding proteins，IBPs）、冰結(jié)構(gòu)蛋白（ice structuring proteins，ISPs）[1]，是一類具有提高生物抗凍能力的蛋白質(zhì)類化合物的總稱，不僅能夠降低生物體液的冰點(diǎn)，抑制冰晶的形成，還能改變冰晶的生長(zhǎng)規(guī)律，抑制重結(jié)晶[2]，因此其在動(dòng)植物組織以及細(xì)胞低溫保存、食物的貯藏等方面具有良好的市場(chǎng)前景[3-5]。到目前為止，國(guó)內(nèi)外研究人員已經(jīng)從植物、魚類、陸地昆蟲、細(xì)菌等各類生物體中分離出多種抗凍蛋白[6-9]。由于較低的產(chǎn)率及較高的成本，科研工作者仍然試圖從各種資源中尋找新的AFP分子，篩選活性更強(qiáng)的組分。我國(guó)是畜禽生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó)，由于加工技術(shù)的落后，產(chǎn)生了大量下腳料，研究發(fā)現(xiàn)，畜禽下腳料富含的膠原蛋白中具有高活性的抗凍組分[10]，可能成為AFP的主要來(lái)源之一。目前，常采用多種色譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)AFP進(jìn)行不同程度的篩選，該篩選過(guò)程繁瑣耗時(shí)，難以實(shí)現(xiàn)快速、高效篩選目的。近年來(lái)，隨著對(duì)AFP功能性質(zhì)研究的日益重視，已見(jiàn)一些利用冰晶吸附AFP的研究報(bào)道，如Kuiper等[11]通過(guò)“cold finger”吸附的冰晶分離AFP。與傳統(tǒng)的分離方法相比冰晶特異性親和吸附法有明顯優(yōu)勢(shì)。不足的是，該法對(duì)抗凍組分的吸附量小，產(chǎn)量很低?；诖?，本研究以高寒地區(qū)的牦牛骨為原料制備酶解膠原蛋白，并采用改良的可大面積吸附抗凍組分的冰親和吸附法對(duì)其中的抗凍組分進(jìn)行高效吸附，同時(shí)研究其抗凍性能。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)中的原料為新鮮的牛大骨，由上海申宏冷藏儲(chǔ)運(yùn)有限公司提供；重組抗凍蛋白，購(gòu)自武漢華美生物工程有限公司；市售抗凍蛋白，購(gòu)自上海聚鑫生物科技有限公司；胃蛋白酶（酶活力為37200 U/g）、羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品等其他試劑均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥試劑集團(tuán)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HP-1100高效氨基酸分析儀，北京Agilent公司；J-715圓二色譜儀，上海Jasco公司；UV-6000 PC型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司；J-20XP型冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；LD85B3型真空冷凍干燥機(jī)，美國(guó)millrock科技公司。

1.3 方法

1.3.1 牛骨脫鈣以及鈣含量的測(cè)定

選取10倍體積的0.25M EDTA·2Na作為脫鈣液對(duì)粉碎后的牛骨粉進(jìn)行脫鈣，每8 h更換一次脫鈣液。鈣含量測(cè)定依據(jù)《GB 5009.92—2016 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中鈣的測(cè)定》。

1.3.2 牛骨膠原的制備及提取率測(cè)定

脫鈣結(jié)束后過(guò)濾去掉脫鈣液，加入10倍體積0.5M醋酸溶液浸泡12 h；在醋酸浸泡后的骨粉溶液中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的胃蛋白酶酶解48 h，離心沉淀，收集上清液；將上清液蒸發(fā)濃縮凍干，保存?zhèn)溆谩?/p>

依據(jù)《GBT 9695.23—2008肉與肉制品 羥脯氨酸含量測(cè)定》測(cè)定膠原蛋白含量。膠原蛋白提取率為提取獲得膠原蛋白總質(zhì)量與牛骨原料中膠原蛋白的總質(zhì)量之比。具體換算公式為

式中：A為羥脯氨酸的百分含量；M1為羥脯氨酸的質(zhì)量，ug；M2為樣品質(zhì)量，mg；B為膠原蛋白提取率。

1.3.3 膠原抗凍肽的制備

圖1 冰親和吸附裝置Fig. 1 Ice affinity adsorption device

在Knight等[12]，Zhang等[13]及阮功成等[14]的研究基礎(chǔ)上，搭建了由低溫恒溫槽、磁力攪拌器、酶反應(yīng)器及絕熱盒組成的冰親和吸附裝置，如圖1所示。具體吸附流程如下：先取一定量的純凈水倒入酶反應(yīng)器中，用低溫恒溫槽將溫度降到?4 ℃并恒溫20 min，預(yù)先在酶反應(yīng)器內(nèi)壁獲得2～4 mm厚的冰層，倒出酶反應(yīng)器中多余的水，將冰層在?4 ℃恒溫2 h。再將已降溫到0 ℃的酶解液倒入內(nèi)壁制備好冰層的酶反應(yīng)器中，開(kāi)啟磁力攪拌器在相應(yīng)溫度下吸附一定時(shí)間。吸附完畢后，倒出吸附后的液體，然后將恒溫槽升溫至2 ℃，使酶反應(yīng)器內(nèi)壁上含有抗凍肽的冰晶充分溶解得到多肽溶液。在此基礎(chǔ)上，考察了吸附時(shí)間（2，4，6，8 h）、吸附溫度（?3，?2.5，?2，?1 ℃）和吸附濃度（1，2，3，4 mg/mL）對(duì)熱滯活性值的影響。

1.3.4 熱滯活性的測(cè)定

稱取約10 mg多肽溶液于鋁皿內(nèi)，并置于DSC儀器內(nèi)。當(dāng)儀器充滿液氮并穩(wěn)定后，首先以10 ℃/min的速率降溫至?30 ℃保持10 min，再升溫至10 ℃保持 5 min，獲得樣品溶液的熔融熱△Hm和熔點(diǎn)Tm。再以10 ℃/min將樣品降溫至?20 ℃保持5 min；然后以5 ℃/min升溫至樣品呈固液共存狀態(tài)，即到達(dá)其保留溫度Th，保持5 min；再將溫度以1 ℃/min的速率從Th降至 ?20 ℃。重復(fù)上述升降溫程序，在不同的Th下保持5 min，分別記錄樣品的起始結(jié)晶溫度T0以及結(jié)晶熱△Hr[15]，并分別按照式（1）計(jì)算熱滯活性THA值。

1.3.5 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）

采用SDS-PAGE電泳方法鑒定提取的牛骨膠原的純度，電泳條件如下：

分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%；濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%；電極緩沖液1 L：3 g Tris，14.4 g甘氨酸，1 g SDS，加蒸餾水至1 L；樣品緩沖液10 mL：0.6 mL 1 mol/L Tris-HCl（pH 值6.8），5 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%甘油，2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù) 10%的SDS，0.5 mL β-巰基乙醇，1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的溴酚藍(lán)，0.9 mL雙蒸水；固定液：質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%的三氯乙酸；染色液：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%的考馬斯亮藍(lán)R-250溶液；脫色液：75 mL冰醋酸+50 mL甲醇+875 mL蒸餾水混合；直流穩(wěn)壓電源：電流10 mA；電泳時(shí)間3 h。

將maker和提取的牛骨膠原蛋白配制成1 mg/mL的溶液，置于沸水浴中煮沸 3 min，10000 r/min 離心1 min，取上清液待上樣，上樣量為10 μL。在120 V電壓下電泳完畢之后，用0.1%的考馬斯亮藍(lán)R-250溶液染色過(guò)夜，加水脫色至背景沒(méi)有顏色后拍照。

1.3.6 原子力顯微分析

將40 μg/mL的5 μL的膠原溶液吸移到新剝離的云母板的中心，讓液滴自然鋪平，放入干燥器中自然涼干30 min 以上。將制備好的云母板置于樣品臺(tái)上進(jìn)行原子力顯微鏡觀察[16]，測(cè)試參數(shù)為：針尖為125 μL蝕刻硅，彈性常數(shù)20-80 Nm?1，掃描頭為A型，諧振頻率范圍200～400 Hz，成像模式為輕敲模式（tapping mode），所有圖像經(jīng)過(guò)自動(dòng)平滑處理以消除慢掃描導(dǎo)致的低頻噪音。

1.3.7 氨基酸組成分析

將約200 mg左右膠原樣品稱入水解管中，加入6 mol/L HCL，抽真空并封口，并在110 ℃下水解24 h。將水解后的樣品轉(zhuǎn)移定容后過(guò)濾，取濾液在加NaOH的真空干燥器中蒸干，再加鹽酸復(fù)溶后，取樣上機(jī)測(cè)定。色譜條件：4.0×125 mm C18柱；柱溫40 ℃；流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)338 nm，262 nm（Hypro）；流動(dòng)相A為20 mmol醋酸鈉液，流動(dòng)相B為20 mmol醋酸鈉液∶甲醇∶乙腈 =1∶2∶2。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組數(shù)據(jù)至少重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用Excel及Origin處理作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 脫鈣工藝的優(yōu)化

2.1.1 脫鈣劑濃度對(duì)脫鈣率以及膠原蛋白提取率的影響

牛骨中無(wú)機(jī)礦物質(zhì)含量高達(dá)53%，這些鈣質(zhì)緊緊附著于骨膠原之上，若不進(jìn)行脫鈣處理，牛骨難以被蛋白酶酶解，導(dǎo)致膠原蛋白溶出率低[17-18]。因而本研究考察了EDTA·2Na濃度（0.05，0.15，0.25 ，0.35 mol/L）對(duì)牛骨脫鈣率及膠原蛋白提取率的影響，脫鈣時(shí)間為48 h。由圖2可見(jiàn)，隨著脫鈣劑濃度的升高，脫鈣率逐漸增加。當(dāng)脫鈣劑濃度為0.25 mol/L時(shí)，脫鈣率可以達(dá)到91.88%；當(dāng)脫鈣劑濃度達(dá)到0.15 mol/L以上時(shí)，膠原蛋白的提取率達(dá)到比較穩(wěn)定的狀態(tài)。

采用原子力顯微鏡對(duì)不同濃度脫鈣劑脫鈣后的牛骨膠原蛋白的微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，結(jié)果如圖3所示。其中，圖3（a）、（c）、（e）為膠原微觀結(jié)構(gòu)平面圖，圖3（b）、（d）、（f）為膠原微觀結(jié)構(gòu)三維圖?？梢钥闯?，經(jīng)0.15 mol/L的脫鈣劑脫鈣后，牛骨中膠原結(jié)構(gòu)與其他兩組明顯不同，這可能是由于低濃度的脫鈣劑無(wú)法完全去除骨中的鈣質(zhì)，牛骨中鈣質(zhì)與蛋白緊密結(jié)合，在原子力測(cè)定過(guò)程中膠原蛋白難以聚集。因此在原子力顯微鏡結(jié)果中只能看到較小的聚集體。經(jīng)0.25 mol/L和0.35 mol/L的脫鈣劑脫鈣后，在原子力圖譜中明顯看到較大的聚集體，這可能是由于較高濃度的脫鈣劑使膠原蛋白從骨中完全游離出來(lái)，當(dāng)采用原子力顯微鏡觀察時(shí)，多肽鏈上疏水氨基酸殘基的疏水作用占優(yōu)勢(shì)，分子內(nèi)和分子間的氫鍵作用增強(qiáng)，分子聚集成球形，從而形成較大的聚集體[16]。

圖3 脫鈣劑濃度對(duì)膠原蛋白的影響Fig.3 Effect of decalcification agent concentration on collagen

2.1.2 脫鈣時(shí)間對(duì)脫鈣率和提取率的影響

進(jìn)一步考察不同脫鈣時(shí)間（24 ，48，72 h）對(duì)骨料脫鈣率及膠原蛋白的提取率的影響，EDTA·2Na濃度初始設(shè)為0.15 mol/L。結(jié)果如圖4所示。由圖可見(jiàn)，隨著脫鈣時(shí)間的增加，脫鈣率也隨之增加，當(dāng)脫鈣時(shí)間為72 h時(shí)，脫鈣率達(dá)到最大，為87.10%。但隨著脫鈣時(shí)間的進(jìn)一步增加，膠原的提取率反而下降，在脫鈣時(shí)間為72 h時(shí)，膠原蛋白的提取率僅為13.54%，這可能是因?yàn)殚L(zhǎng)時(shí)間的脫鈣可能導(dǎo)致骨料中的膠原蛋白發(fā)生流失，并隨脫鈣液一起被過(guò)濾除去。

采用AFM比較了不同脫鈣時(shí)間的膠原蛋白的微觀結(jié)構(gòu)，見(jiàn)圖5。其中圖5（a）、（c）、（e）為膠原微觀結(jié)構(gòu)平面圖，圖5（b）、（d）、（f）為膠原微觀結(jié)構(gòu)三維圖?？梢钥闯觯撯}24 h后獲得的膠原蛋白只能看到細(xì)絲狀的膠原纖維，沒(méi)有形成明顯的聚集體；而脫鈣48 h和72 h后，膠原蛋白能很好地自組裝成高度均勻有序的聚集體。綜合考慮脫鈣率和膠原蛋白提取率，脫鈣時(shí)間選為48 h。

圖4 脫鈣時(shí)間對(duì)脫鈣率的影響Fig. 4 Effect of decalcification time on decalcification rate and extraction efficiency

2.2 酶水解膠原蛋白的制備

圖5 脫鈣時(shí)間對(duì)膠原蛋白的影響Fig.5 Effect of decalcification time on collagen

采用胃蛋白酶對(duì)脫鈣后的物料進(jìn)行處理，考察酶解溫度（10，20，25，37 ℃）和時(shí)間（10，24，48，72 h）對(duì)膠原蛋白提取率的影響，其結(jié)果如圖6所示，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%。由圖6可見(jiàn)，在酶解溫度為25 ℃時(shí)，膠原蛋白的提取率最高，達(dá)到48.53%。隨著酶解時(shí)間的增加，膠原蛋白的提取率增加，在酶解72 h后，膠原蛋白的提取率可以達(dá)到58.38%。這是因?yàn)殚L(zhǎng)時(shí)間的酶解使牛骨中的膠原蛋白充分釋放。但考慮到長(zhǎng)時(shí)間的酶解可能會(huì)使膠原蛋白酶解過(guò)度從而產(chǎn)生較多的短肽鏈，因此本研究選擇酶解時(shí)間為48 h。

圖6 不同酶解時(shí)間以及溫度對(duì)提取率的影響Fig. 6 Effect of enzymolysis time and temperatures on extraction efficiency

2.3 SDS-PAGE電泳

采用SDS-PAGE 法鑒定膠原蛋白的分子量及純度，結(jié)果如圖7所示，SDS-PAGE 圖譜上出現(xiàn)了α1，α2，β及γ4個(gè)條帶，其對(duì)應(yīng)的分子量分別約為90，100，110，200 kDa，這是典型的I型膠原蛋白SDS-PAGE圖譜。其中，在分子量約100 kDa附近出現(xiàn)了3個(gè)條帶，它們分別為膠原蛋白的α1，α2鏈，和α鏈的二聚體，即β-鏈；在高于200 KDa出現(xiàn)的條帶是α鏈的三聚體，即γ-鏈。圖譜上雜帶較少，說(shuō)明采用胃蛋白酶法制備的膠原蛋白中小分子多肽較少，可見(jiàn)所獲得牛骨膠原蛋白具有較高的純度。

圖7 膠原蛋白SDS-PAGE 電泳圖（line1，line2重復(fù)）Fig. 7 SDS-PAGE electrophoresis of collagen before and after salting out

2.4 膠原酶解復(fù)合物的氨基酸組成

由表1可見(jiàn)，采用胃蛋白酶法制備的膠原酶解復(fù)合物的氨基酸組成中，Gly，Glu和Pro含量較高，其中每1000個(gè)氨基酸殘基中Gly殘基數(shù)為300，Glu和Pro殘基數(shù)分別為88和146；His、Tyr和Met含量較低；牛骨膠原蛋白中富含Pro、Gly和Hyp，這與膠原三股螺旋區(qū)由連續(xù)的Gly-X-Y重復(fù)序列組成相一致，其中X、Y是除Gly外的其他氨基酸殘基，X為Pro，Y為Hyp或羥賴氨酸。該結(jié)構(gòu)與雪蚤抗凍蛋白[19]的活性結(jié)構(gòu)域相似，因此以膠原蛋白為原料制備抗凍多肽具有可行性。

表1 膠原酶解復(fù)合物的氨基酸組成Tab.1 Amino acid composition of collagen

2.5 不同冰親和吸附條件下膠原抗凍肽的熱滯活性分析

利用抗凍蛋白能特異吸附于冰晶表面的原理，在前人研究基礎(chǔ)上，搭建了可增大吸附面積的冰親和吸附裝置（圖1），并應(yīng)用于酶解復(fù)合物中膠原抗凍肽的吸附。采用DSC法考察了不同吸附時(shí)間（2，4，6，8 h）、吸附溫度（?3，?2.5，?2，?1 ℃）以 及 吸 附 濃 度（1，2，3，4 mg/ml）對(duì)THA值的影響，結(jié)果如表2，圖7～9所示。

本研究首先對(duì)冰親和吸附的時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果如表2和圖8所示。在吸附4 h后蛋白得率達(dá)到最大，為49.30%。隨著吸附時(shí)間的增加，蛋白得率反而降低，這可能是由于過(guò)長(zhǎng)的吸附時(shí)間導(dǎo)致冰晶表層吸附了大量雜質(zhì)，過(guò)長(zhǎng)的吸附時(shí)間也導(dǎo)致抗凍肽的熱滯活性降低，在吸附時(shí)間為4 h時(shí)，獲得的膠原抗凍肽的熱滯活性值最大，為4.77 ℃，因此選擇其為最適吸附時(shí)間。

冰晶對(duì)膠原抗凍肽的吸附，不僅受吸附時(shí)間影響，還與吸附溫度有關(guān)。若吸附溫度過(guò)低會(huì)使得冰晶迅速結(jié)冰，冰層形成時(shí)間較短，從而影響膠原抗凍肽與冰晶的特異性吸附。結(jié)合表2和圖9可以發(fā)現(xiàn)，在?1 ℃時(shí)，所獲得的膠原抗凍肽的熱滯活性值最小，為0.57 ℃。這可能是由于當(dāng)吸附溫度較高時(shí)，水結(jié)冰的速度變慢，酶反應(yīng)器內(nèi)表面不能迅速形成新的吸附層。而此時(shí)酶反應(yīng)器內(nèi)壁事先制備好的冰層面已經(jīng)全部被膠原抗凍肽所飽和，阻隔了水與冰層的接觸，從而抑制了連續(xù)吸附的過(guò)程，導(dǎo)致所獲得的膠原抗凍肽熱滯活性降低。當(dāng)溫度達(dá)到?2 ℃時(shí)，熱滯后活性值達(dá)到最大為5.76 ℃，因此選擇其為最佳吸附溫度。

表2 不同吸附條件對(duì)熱滯活性（THA）以及蛋白得率的影響Tab.2 Effects of different adsorption conditions on thermal hysteresis activity and protein yield

圖8 吸附時(shí)間對(duì)抗凍蛋白熱滯活性的影響Fig. 8 Effect of adsorption time on thermal hysteresis activity of antifreeze proteins

圖9 吸附溫度對(duì)抗凍蛋白熱滯活性的影響Fig. 9 Effect of adsorption temperature on thermal hysteresis activity of antifreeze proteins

在相同吸附溫度及吸附時(shí)間下，考察了吸附濃度對(duì)膠原抗凍肽熱滯活性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在吸附濃度為1 mg/mL時(shí)，蛋白得率較高，但熱滯活性值較小，僅為3.05 ℃；在吸附濃度為3 mg/mL和4 mg/mL時(shí)，熱滯活性值都較高，但蛋白得率有所降低；在吸附濃度為2 mg/ml時(shí)，蛋白得率和膠原抗凍肽的熱滯活性值均較高。這可能是由于在較高濃度的酶解液中，大量抗凍肽迅速吸附到冰晶層表面，延緩了新冰層的形成，從而減少了雜蛋白的吸附，在降低蛋白得率的同時(shí)，提高了熱滯活性。

圖10 吸附濃度對(duì)抗凍蛋白熱滯活性的影響Fig. 10 Effect of adsorption concentration on thermal hysteresis activity of antifreeze proteins

結(jié)合以上結(jié)果可以得出冰親和吸附裝置的最佳吸附條件為：吸附時(shí)間4 h，吸附溫度?2 ℃，吸附濃度2 mg/mL；此條件下的熱滯活性值5.76 ℃，蛋白得率48.1%。根據(jù)熱滯活性大小可將現(xiàn)有的抗凍蛋白分成兩類，即低熱滯活性抗凍蛋白和高熱滯活性抗凍蛋白，低熱滯活性抗凍蛋白的THA值一般在0.2～0.5 ℃之間，高熱滯活性抗凍蛋白的THA值一般在0.5～4.1 ℃之間[20-23]。我們制備的牛骨抗凍肽THA值為5.76 ℃，表現(xiàn)出優(yōu)秀的抗凍性能，將來(lái)可作為一種新型的生物抗凍劑。

3 結(jié) 論

以EDTA·2Na作為脫鈣劑對(duì)牛骨進(jìn)行脫鈣，得到最佳脫鈣工藝：脫鈣時(shí)間為48 h，脫鈣濃度為0.25 mol/L。在此條件下，脫鈣率可達(dá)到87.10%，膠原蛋白提取率可達(dá)到43.99%。牛骨脫鈣后用胃蛋白酶進(jìn)行酶解制備牛骨膠原肽，在酶解時(shí)間為48 h，酶解溫度為25 ℃時(shí)，膠原蛋白提取率可達(dá)48.53%。進(jìn)一步考察了冰親和吸附過(guò)程中，吸附時(shí)間、吸附溫度以及吸附濃度對(duì)膠原肽THA值的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：最佳吸附時(shí)間為4 h，吸附溫度為-2 ℃，吸附濃度為2 mg/ml。在此條件下，熱滯活性值為5.76 ℃，蛋白得率為48.1%。牛骨膠原蛋白營(yíng)養(yǎng)豐富且呈現(xiàn)出良好的抗凍性能，在食品工業(yè)上具有良好的市場(chǎng)前景。