2018—2019年汨羅市豬群豬繁殖與呼吸綜合征血清抗體及病原學(xué)檢測與分析

戴正強(qiáng)

（湖南省汨羅市畜牧水產(chǎn)局，湖南 汨羅 414400）

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）又稱豬藍(lán)耳病，該病是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）感染所引起的一種高度接觸性傳染病，其中繁殖母豬感染該病主要表現(xiàn)為流產(chǎn)、早產(chǎn)或死胎等繁殖障礙疾病，仔豬則出現(xiàn)呼吸困難、高熱甚至神經(jīng)癥狀等，并伴隨高死亡率，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。

PRRSV可通過空氣、水源和飼料等感染健康豬群，也可以通過胎盤垂直傳播給仔豬。目前我國已經(jīng)將PRRS納入強(qiáng)制免疫計(jì)劃，雖然在一定程度上抑制了PRRS的流行與傳播，但近年來湖南省仍然有豬場發(fā)生PRRS疫情，給當(dāng)?shù)仞B(yǎng)殖場（戶）造成較大的經(jīng)濟(jì)損失[3-4]。本研究于2018—2019年對(duì)汨羅市豬群PRRS血清學(xué)和病原學(xué)進(jìn)行檢測與數(shù)據(jù)歸納，旨在為該地區(qū)PRRS的防控提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

本研究于2018年1月至2019年12月從汨羅市部分地區(qū)隨機(jī)采集豬血清樣品1 200份，其中2018年和2019年分別收集樣品640份和560份。采用頸靜脈（成年豬）或前腔靜脈（仔豬和保育豬）方式進(jìn)行采血，將血液樣品于室溫靜置6～8 h，吸取上清液后置于新的離心管內(nèi)，分別標(biāo)記后保存于-20 ℃，待檢。

對(duì)部分豬場的發(fā)病豬群進(jìn)行剖檢，取病變組織（如肺臟、腎臟、淋巴結(jié)等）樣品共107份，將樣品分別標(biāo)記后低溫送至汨羅市畜牧水產(chǎn)局，保存于-20 ℃，待檢。

1.2 檢測方法

采用間接ELISA法（酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)）檢測被調(diào)查血清樣品中PRRSV抗體，其中試劑盒購自于美國IDEXX公司，操作步驟及判定標(biāo)準(zhǔn)均按照試劑盒提供說明書進(jìn)行；采用Trizol法提取組織RNA，對(duì)RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄后生成cDNA，采用Real time-PCR法對(duì)組織樣品中PRRSV核酸進(jìn)行檢測，并對(duì)陽性樣品PRRSV毒株的Nsp2基因部分序列進(jìn)行擴(kuò)增與分析，其引物序列、擴(kuò)增體系及條件均如文獻(xiàn)[5]所示。

2 調(diào)查結(jié)果

2.1 2018—2019年汨羅市部分地區(qū)PRRSV血清抗體檢測結(jié)果

本研究采用間接ELISA法對(duì)汨羅市部分豬場共1 200份血清樣品檢測PRRS抗體水平，所有豬場均已經(jīng)免疫接種PRRSV滅活或弱毒疫苗。由表1可知，共有1 108份樣品為PRRS抗體陽性，平均陽性率為92.33%，其中2018年和2019年調(diào)查樣品PRRS陽性率分別為89.53%和95.54%。此外，本試驗(yàn)在2018年調(diào)查的640份樣品中來源于小型養(yǎng)殖場和大型養(yǎng)殖場，樣品數(shù)量分別為224份和416份，調(diào)查結(jié)果如表2所示，小型養(yǎng)殖場和大型養(yǎng)殖場血清樣品PRRS抗體平均陽性率分別為80.80%和94.23%。

表1 不同年份汨羅市部分地區(qū) PRRS 血清抗體檢測結(jié)果

表2 2018 年不同養(yǎng)殖規(guī)模豬場 PRRS 血清抗體檢測結(jié)果

2.2 2018—2019年汨羅市發(fā)病豬群PRRSV感染情況調(diào)查結(jié)果

為初步調(diào)查汨羅市發(fā)病豬群PRRSV感染情況，本試驗(yàn)于2018和2019年從汨羅市被調(diào)查豬場收集發(fā)病或病死豬組織樣品數(shù)量分別為59份和48份，合計(jì)107份，采用Real time-PCR法對(duì)樣品中PRRSV核酸進(jìn)行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，107份樣品中共有9份檢測為PRRSV陽性，平均陽性率為8.41%，其中2018年收集發(fā)病豬群組織樣品PRRSV陽性率（10.17%）高于2019年（6.25%），見表3。

表3 2018—2019 年汨羅市發(fā)病豬群 PRRSV 感染情況調(diào)查結(jié)果

2.3 汨羅市PRRSV流行毒株Nsp2基因部分序列分析結(jié)果

為分析本次試驗(yàn)獲得的9個(gè)汨羅市PRRSV流行毒株的基因型與變異情況，采用RT-PCR法對(duì)毒株的Nsp2基因部分序列進(jìn)行擴(kuò)增、測序，并將測序獲得的序列在GenBank上進(jìn)行Blast序列比對(duì)與分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，9個(gè)PRRSV毒株Nsp2基因部分序列擴(kuò)增片段大小基本一致，為422～437 bp，通過在GenBank中數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其中7個(gè)PRRSV毒株與近年來國內(nèi)流行的變異株（如JXA-1株）Nsp2基因核苷酸部分序列同源性最高，為98.7%～99.5%，序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)部分毒株存在堿基插入或缺失現(xiàn)象；而其它2個(gè)PRRSV毒株與國內(nèi)2006年以前流行的傳統(tǒng)毒株（如CH-1a株）同源性最高，為99.2%～99.7%。

3 討論

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）在我國豬場流行廣泛，一度給我國養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。但由于PRRSV屬于RNA病毒，其基因組具有易突變和重組的特點(diǎn)，導(dǎo)致PRRSV在我國基因型較為復(fù)雜，基于不同基因型毒株研發(fā)的疫苗交叉保護(hù)力有限，這為該病的防控帶來了很大的挑戰(zhàn)。近年來，我省豬場暴發(fā)PRRS的案例很多，且在筆者多年疫病診斷與防控過程中也發(fā)現(xiàn)部分豬場即使免疫接種PRRSV疫苗后仍然暴發(fā)PRRS，并導(dǎo)致嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

為了對(duì)汨羅市PRRS進(jìn)行有效防控，并初步分析流行毒株基因變異情況，筆者于2018年1月至2019年12月對(duì)汨羅市部分豬場進(jìn)行PRRSV血清抗體和病原檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2018年和2019年被調(diào)查的血清樣品PRRSV抗體陽性率分別為89.53%和95.54%，符合農(nóng)業(yè)部制定的標(biāo)準(zhǔn)（≥70%），說明疫苗的免疫接種使豬群獲得較高的免疫抗體水平；受非洲豬瘟的影響，我們僅比較2018年小型養(yǎng)殖場和大型養(yǎng)豬場豬群PRRS血清抗體水平，發(fā)現(xiàn)其陽性率存在一定差異，由于小型養(yǎng)殖場可能存在疫苗接種方式不規(guī)范或漏打的可能性，導(dǎo)致其陽性率稍低于大型養(yǎng)殖場。

大量研究結(jié)果表明，PRRSV基因組中Nsp2基因存在高變異的特點(diǎn)，通過知曉Nsp2基因序列變異情況可以初步分析PRRSV毒株遺傳變異情況和具體基因型特點(diǎn)，為該病的防控選擇更加有效的疫苗[5-6]。為此，本試驗(yàn)首先從汨羅市以上被調(diào)查豬場采集?。ㄋ溃┴i組織樣品107份，采用RT-PCR法檢測組織基因組中是否存在PRRSV核酸，結(jié)果發(fā)現(xiàn)共9份樣品檢測為PRRSV陽性，其平均陽性率為8.41%。值得注意的是，這些被調(diào)查豬場均已經(jīng)免疫接種過相應(yīng)疫苗，且已經(jīng)產(chǎn)生了較好的保護(hù)率，為了進(jìn)一步確定此類豬場出現(xiàn)PRRS疫情的原因，我們對(duì)以上9株P(guān)RRSV毒株的Nsp2基因部分序列進(jìn)行擴(kuò)增與分析，發(fā)現(xiàn)大部分毒株屬于變異株，其它則為傳統(tǒng)株。我們對(duì)以上豬場回訪發(fā)現(xiàn)，部分豬場免疫接種的是基于變異株研發(fā)的疫苗，而有少數(shù)豬場仍然免疫接種基于傳統(tǒng)株研發(fā)的疫苗，這可能是導(dǎo)致部分豬場雖然免疫接種PRRSV疫苗，但仍然暴發(fā)疫情的原因。因此，應(yīng)該定期對(duì)豬場PRRS進(jìn)行病原學(xué)監(jiān)測，分析其基因型，以便選擇更加有效的疫苗進(jìn)行防控。