副豬嗜血桿菌4型分離株耐藥表型及耐藥基因分析研究

王治方，徐引弟，張青嫻，朱文豪，焦文強(qiáng)，李海利，白紅杰，許 峰，王克領(lǐng)

（1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，河南 鄭州 450002；2.河南省畜禽繁育與營養(yǎng)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450002；3.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，鄭州 450002）

副豬嗜血桿菌病是當(dāng)前規(guī)?；i場常見的細(xì)菌病之一，由副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis, HPS）引起的，各種年齡階段的豬均可感染，主要發(fā)生在斷奶后和保育階段，主要感染2周齡到4月齡的豬，發(fā)病率一般在10%～15%，嚴(yán)重時死亡率可達(dá)50%[1-3]，該病已成為近年來斷奶仔豬、保育豬死亡的主要原因之一，是臨床混合感染的主要細(xì)菌性病原。該病臨床癥狀主要表現(xiàn)為咳嗽、呼吸困難、消瘦、跛行和被毛粗亂；病理變化以纖維素性胸膜炎、心包炎、腹膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎等為主要特征[4]。副豬嗜血桿菌血清型較多，目前共鑒定了15種血清型，臨床上還有15%～20%的不可分型菌株[5-6]，該病原呈世界性分布，各地流行菌株血清型不一，世界范圍內(nèi)包括日本、德國、加拿大、美國、西班牙、丹麥、中國，流行的主要血清型為4、5和13型[7-8]。

目前抗生素仍然是臨床上預(yù)防和治療副豬嗜血桿菌病的常用方法?？股氐牟灰?guī)范使用及長期濫用，使得副豬嗜血桿菌對各類抗生素的耐藥性逐漸增強(qiáng)，甚至出現(xiàn)多重耐藥，給臨床治療帶來了困難[9-10]。副豬嗜血桿菌病已成為影響全球養(yǎng)豬業(yè)的典型細(xì)菌性疾病，該病的發(fā)生已嚴(yán)重影響了全球養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展，造成了較大的經(jīng)濟(jì)損失。

研究表明從不同國家或地區(qū)分離獲得的副豬嗜血桿菌菌株，對抗生素耐藥性表現(xiàn)不同。由于細(xì)菌受到抗生素強(qiáng)大的選擇，逐漸產(chǎn)生了不同的耐藥機(jī)制。研究表明，同一種抗生素可能存在多種耐藥機(jī)制，一種耐藥機(jī)制也可能在不同種抗生素中發(fā)揮作用[11]。副豬嗜血桿菌的耐藥機(jī)制產(chǎn)生的因素較多，主要包括遺傳因素、化學(xué)因素及環(huán)境因素等。因此了解副豬嗜血桿菌的耐藥性及耐藥機(jī)制，從根源減少耐藥菌株的產(chǎn)生具有重要意義。

本試驗(yàn)對10株2019年分離獲得副豬嗜血桿菌4型菌株，通過紙片擴(kuò)散法和PCR技術(shù)檢測了菌株的耐藥性及相關(guān)耐藥基因，以期為副豬嗜血桿菌4型的預(yù)防和臨床治療提供參考，減少或延緩耐藥菌株的出現(xiàn)。

1 材料與方法

1.1 菌株

本試驗(yàn)的副豬嗜血桿菌菌株，是2019年1—12月由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所傳染病研究室從河南省多個地區(qū)規(guī)?；i場采集疑似副豬嗜血桿菌病例的發(fā)病豬只肺臟、氣管、心血樣品，分離純化、生化鑒定、PCR鑒定及分型，獲得4型副豬嗜血桿菌10株。菌株信息見表1。

表1 菌株來源

1.2 主要儀器與試劑

Thermo 5020 PCR擴(kuò)增儀、Thermo 1300SERIES A2生物安全柜購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；電泳儀（DYY-6型）購自北京市六一儀器廠；凝膠成像系統(tǒng)購自沙船（天津）生物科技發(fā)展有限公司；TK-15臺式高速冷凍離心機(jī)購自SIGMA公司。胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）購自美國Difco公司；新生犢牛血清購自生工生物工程（上海）股份有限公司；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（輔酶Ⅰ，NAD）購自Roche公司；微生物DNA提取試劑盒、Tap PCR master mix、DL 2 000 DNA Marker等PCR試劑均購自北京擎科新業(yè)生物科技有限公司。常用抗生素標(biāo)準(zhǔn)藥敏片[頭孢他啶（CAZ）、阿莫西林（AML）、青霉素（P）、卡那霉素（KAN）、新霉素（NEO）、阿米卡星（AMK）、壯觀霉素（SPT）、紅霉素（E）、替米考星（TIL）、阿奇霉素（AZM）、四環(huán)素（TE）、強(qiáng)力霉素（DO）、諾氟沙星（NOR）、左氟沙星（LEV）、氧氟沙星（OFL）]，購自杭州濱河微生物試劑有限公司；頭孢噻呋（EFT）、土霉素（OT）、氟苯尼考（FFC）藥敏片購自Sigma公司。

1.3 培養(yǎng)基的配制

TSA瓊脂平板：稱取TSA瓊脂粉4 g，溶于100 mL超純水中，于121 ℃高壓滅菌15 min，冷卻至約45 ℃左右，添加新生犢牛血清5 mL和1 mL的0.01%NAD，充分混勻后傾倒平皿，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 菌株培養(yǎng)

將10株凍存的副豬嗜血桿菌4型菌株分別接種TSA平板，于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～36 h后，再分別挑選單個典型菌落傳代接種于TSA平板，37 ℃5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～36 h，備用。

1.5 藥物敏感性試驗(yàn)

參考文獻(xiàn)[12-13]采用瓊脂擴(kuò)散法（K-B法）分別對HPS4每個菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。挑取復(fù)壯純化過的TSA平板上若干單個菌落，置于0.9%滅菌生理鹽水中，制成菌懸液，濃度為0.5麥?zhǔn)蠁挝唬ū壬珒x比色），用滅菌的棉拭子或棉簽蘸取制成細(xì)菌懸液，均勻涂布于TSA平板上，稍干后，用滅菌鑷子分別取藥敏紙片均勻貼于TSA平板上，并用鑷子輕按紙片中心，使藥敏紙片與平板培養(yǎng)基附著緊密，放置于5% CO2培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)36 h。取出觀察并記錄藥敏片抑菌圈直徑。判斷標(biāo)準(zhǔn)參照藥敏紙片說明書。

1.6 耐藥基因檢測

1.6.1 引物設(shè)計 參考文獻(xiàn)[14]，設(shè)計10個耐藥基因包括氨基糖苷類[aadA1、aadA2、strA、strB、aadB、aacC2、aac（3）-IV、aphA1]和喹諾酮類（gyrA、parC）的引物，用于每個菌株的耐藥基因檢測擴(kuò)增，10對耐藥基因引物序列及相關(guān)信息見表2。

表2 耐藥基因引物序列及相關(guān)信息

1.6.2 模板DNA的提取 用接種環(huán)挑取傳代復(fù)蘇好的HPS4典型菌落放入裝有50 μL純水的EP管中，按照DNA提取試劑盒上的步驟嚴(yán)格操作，DNA于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.3 反應(yīng)體系 反應(yīng)體系為25 μL：2×Taq Mix 13 μL，10 μM/L上、下游引物各1 μL，模板DNA 2 μL，加ddH2O至25 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性1 min，適宜溫度下（表2）退火1 min，72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，PCR產(chǎn)物4 ℃保存?zhèn)溆?。?0 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像系統(tǒng)中比照DNA Marker DL 2 000確定條帶大小。

2 結(jié)果

2.1 藥物敏感性檢測結(jié)果

10株HPS4菌株的藥物敏感性檢測結(jié)果如表3所示，試驗(yàn)菌株對氨基糖苷類（卡那霉素、阿米卡星）、喹諾酮類（諾氟沙星、左氟沙星、氧氟沙星）耐藥均在60%以上；對大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類、氟苯尼考敏感；對β-內(nèi)酰胺類藥物較敏感，但對β-內(nèi)酰胺類的阿莫西林、青霉素G的耐藥性不容樂觀，分別是30%、40%。

表3 10 株 HPS4 型菌株藥敏統(tǒng)計

2.2 菌株耐藥譜

10株HPS4菌株對18種常用抗生素藥物敏感性結(jié)果顯示，10菌株均表現(xiàn)出多重耐藥現(xiàn)象，共表現(xiàn)出9種耐藥譜，其中有2株耐受3種藥物（諾氟沙星、左氟沙星、氧氟沙星），為3重耐藥；1株表現(xiàn)出8重耐藥，同時對頭孢他啶、頭孢噻呋、阿莫西林、青霉素、卡那霉素、阿米卡星、新霉素和壯觀霉素表現(xiàn)耐藥。結(jié)果如表4所示。

表4 HPS4 菌株耐藥譜

2.3 耐藥基因檢測結(jié)果

用10對耐藥基因引物分別對10株HPS4進(jìn)行耐藥基因檢測，其中有1株未檢測到耐藥基因，其余9個菌株檢測出了4種耐藥基因，分別是strB、aphA1、gyrA、parC耐藥基因，其中有8個菌株都檢測出喹諾酮類耐藥基因gyrA、parC陽性，檢出率達(dá)80%（圖1、圖2）；有6個菌株檢測出氨基糖苷類耐藥基因aphA1陽性，檢出率60%（圖3），有5個菌株檢測出氨基糖苷類耐藥基因strB陽性，檢出率50%（圖4）。

3 討論

本試驗(yàn)針對10株副豬嗜血桿菌4型河南臨床分離菌株進(jìn)行了表型耐藥檢測及耐藥基因檢測研究，發(fā)現(xiàn)10株HPS4菌株對18種臨床常用抗菌藥物均表現(xiàn)出不同程度的耐藥現(xiàn)象?？傮w情況，HPS4菌株對紅霉素、阿奇霉素、替米考星、四環(huán)素、土霉素、強(qiáng)力霉素和氟苯尼考有很好敏感性，耐藥率均為10%；和忽占利等報道的浙江菌株對四環(huán)素耐藥率高達(dá)75%有明顯差異[15]，這可能是菌株區(qū)域性差異引起的。雖然本試驗(yàn)HPS4菌株對β-內(nèi)酰胺類藥物（頭孢噻呋、頭孢他啶）和壯觀霉素較敏感，耐藥率為20%，但和作者2018年檢測30株副豬嗜血桿菌株對頭孢噻呋100%敏感結(jié)果[16]有所不同，說明副豬嗜血桿菌臨床菌株耐藥性在逐漸增強(qiáng)。HPS4菌株對青霉素G和阿莫西林耐藥性不容樂觀，耐藥率分別為40%、30%。HPS4菌株對氨基糖苷類卡那霉素、阿米卡星、新霉素和喹諾酮類諾氟沙星、左氟沙星、氧氟沙星表現(xiàn)出較高耐藥性，耐藥率均在50%以上；與董永軍等[17]、蔣增海等[6]試驗(yàn)分離株對諾氟沙星、氧氟沙星等喹諾酮類高敏有明顯差異。試驗(yàn)菌株對18種常用抗生素均表現(xiàn)出多重耐藥現(xiàn)象，耐藥譜多達(dá)9種，最少為3重耐藥，最多為8重耐藥。充分說明，不同地區(qū)、豬場分離獲得的HPS4菌株耐藥性有一定差異，耐藥現(xiàn)象較普遍，而且有增強(qiáng)擴(kuò)大的趨勢。本試驗(yàn)HPS4菌株的耐藥表型為建立副豬嗜血桿菌河南分離株耐藥譜積累了一定的數(shù)據(jù)材料，為河南省規(guī)?；i場預(yù)防控制副豬嗜血桿菌病臨床選擇藥物提供了科學(xué)依據(jù)。

細(xì)菌的耐藥機(jī)制復(fù)雜，不同細(xì)菌及同一細(xì)菌對不同類藥物均能表現(xiàn)出不同的耐藥機(jī)制。細(xì)菌對氨基糖苷類藥物耐藥的機(jī)制主要有：1）產(chǎn)生一種或多種功能修飾酶，使藥物降低或失去活性，氨基糖苷類修飾酶有乙酰轉(zhuǎn)移酶、磷酸轉(zhuǎn)移酶和核苷轉(zhuǎn)移酶3類；2）藥物作用靶位的核糖體堿基發(fā)生改變或與核糖體結(jié)合的核蛋白編碼基因發(fā)生突變，藥物的結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生改變，無法發(fā)揮抗菌作用；3）改變細(xì)胞膜的通透性，主動外排機(jī)制增強(qiáng)。第一種是氨基糖苷類藥物耐藥的普遍機(jī)制，細(xì)菌能夠產(chǎn)生50多種分別編碼乙酰轉(zhuǎn)移酶，腺苷轉(zhuǎn)移酶和磷酸轉(zhuǎn)移酶的基因[18-19]。耐藥基因aphA1和strB都是與編碼磷酸轉(zhuǎn)移酶有關(guān)的基因，本次試驗(yàn)對10株HPS4菌株進(jìn)行耐藥基因檢測，6株檢測出aphA1基因，5株檢測出strB基因，說明aphA1和strB是HPS4河南分離菌株對氨基糖苷類藥物產(chǎn)生耐藥性的主要原因。

喹諾酮類藥物主要通過與細(xì)菌不同部位上的靶位蛋白結(jié)合，發(fā)揮殺菌、抑菌作用的，DNA回旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ是喹諾酮類藥物的主要作用靶位[20]。耐藥基因gyrA、parC則分別與DNA回旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ的基因編碼有關(guān)。本次試驗(yàn)10株HPS4菌株進(jìn)行耐藥基因檢測，8株都檢測出gyrA、parC基因，表明gyrA、parC是HPS4河南分離菌株對喹諾酮類藥物產(chǎn)生耐藥性的主要原因。

結(jié)合本次研究的耐藥表型結(jié)果和耐藥基因檢測結(jié)果，表明HPS4河南分離菌株對臨床常用藥物耐藥表現(xiàn)明顯；耐藥菌株表型耐藥和其攜帶的耐藥基因表現(xiàn)出很大的相關(guān)性，臨床菌株之間很可能存在耐藥性的遺傳傳遞情況，在臨床防控副豬嗜血桿菌時，盡可能規(guī)范或減少氨基糖苷類和喹諾酮類藥物的使用。