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    丹參DNA提取方法的優(yōu)化研究

    2021-01-27 03:07:28吳慧
    智慧健康 2020年35期
    關(guān)鍵詞:改良版pH值離心管

    吳慧

    (1.山東衛(wèi)康醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)有限公司,淄博市精準(zhǔn)基因檢測(cè)關(guān)鍵技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 淄博 255000;2.山東省遺傳性疾病基因檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用示范中心,山東 濟(jì)南 250000)

    0 引言

    目前,提取高質(zhì)量DNA的方法較多,但沒(méi)有一種是被國(guó)際認(rèn)可的高質(zhì)量提取方法[1-2]。本研究以盆栽陜西商洛一年生紫花丹參的葉片為研究對(duì)象,對(duì)比分析了四種高質(zhì)量丹參DNA提取方法的效果,報(bào)告如下。

    1 資料與方法

    1.1 一般資料

    2019年6月至2019年9月,針對(duì)丹參DNA提取方法展開(kāi)了相應(yīng)研究,選取盆栽陜西商洛一年生紫花丹參的葉片為研究材料。

    試劑:(1)SDS緩沖液:Tris-HCl緩沖液、NaCI各有100mmol/L(PH值為8.0),EDTA有50mmol/L(PH值為8.0),濃度為2%的SDS(g/100mL),常規(guī)滅菌后,備用。(2)CTAB緩沖液:Tris-HCl緩沖液有100mmol/L(PH值為8.0),NaCI有4mmol/L,EDTA有20mmol/L(PH值為8.0),濃度為2%的CTAB(g/100mL)。(3)l×TE緩 沖 液:Tris-HCl緩沖液有10mmol/L(PH值為8.0),EDTA有1mmol/L(PH值為8.0)。

    1.2 方法

    SDS法1與SDS法2:取適量新鮮丹參葉片,置入液氮低溫中進(jìn)行研磨,研磨完成后將葉片置入預(yù)冷離心管,將600μLSDS緩沖液預(yù)熱(已預(yù)熱至65℃),然后給予65℃的水?。?-2h),水浴期間輕搖數(shù)次,充分混勻后加入等體積酚/氯仿,離心分離10min,提取上清液,加入預(yù)冷異丙醇,充分混勻后,在-30℃環(huán)境下靜置10min,在4℃環(huán)境下離心3min。祛除上清液,使用濃度為70%的洗滌沉淀,連續(xù)2-3次后,自然干燥。SDS法1:加入50μLl×TE緩沖液在室溫下溶解。SDS法2:加入3μLLRNAase在37℃環(huán)境下保溫1h。然后加入等體積酚/氯仿,充分搖勻后,在4℃環(huán)境下離心10min。取上清液置入另一試管中,置入等體積氯仿,充分搖勻后,在4℃環(huán)境下離心10min。取上清液置入試管中,在試管中加入十分之一NaAc,給予2倍無(wú)水乙醇(冷),充分混勻后靜置,在4℃環(huán)境下離心3min。祛除上清液,使用濃度為70%的洗滌沉淀,連續(xù)2-3次后,自然干燥,加入50μLl×TE緩沖液在室溫下溶解[3-4]。

    CTAB法與改良版CTAB法:將50mg研磨丹參葉片粉置入預(yù)冷離心管,在離心管添加600μLCTAB緩沖液(已預(yù)熱至65℃),然后給予65℃的水浴1h,水浴期間輕搖數(shù)次,充分混勻。在4℃環(huán)境下離心10min,取上清液置入另一離心管,加入等體積異戊醇,持續(xù)輕搖10min,在4℃環(huán)境下離心15min。CTAB法:提取上清液置入另一離心管,加入等體積異戊醇,持續(xù)輕搖10min,在4℃環(huán)境下離心10min,提取上清液置入另一離心管;改良版CTAB法:提取上清液置入另一離心管,添加2μLNAase,給予37℃的水浴,加入等體積異戊醇,持續(xù)輕搖10min,在4℃環(huán)境下離心1,5min,提取上清液置入另一離心管。在新管中添加3mL十分之一體積的NaAc與等體積異戊醇,充分混勻后在4℃環(huán)境下離心5min,祛除上清液,加入濃度為70%的洗滌沉淀,連續(xù)2-3次后,自然干燥,加入50μLl×TE緩沖液在室溫下溶解[5]。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

    2 結(jié)果

    2.1 四種DNA提取方法的電泳檢測(cè)結(jié)果比較

    電泳圖顯示,CTAB法與SDS法1均存在DNA主帶,均能有效提取丹參核總DNA,但提取質(zhì)量存在一定差異。其中CTAB法的電泳圖有較為明顯的彌散,點(diǎn)樣孔比較亮,RNA較多,蛋白質(zhì)污染較多。而SDS法1的電泳圖彌散不明顯,點(diǎn)樣孔的亮度比較低,RNA、蛋白質(zhì)污染相較于CTAB法更少,且DNA主帶亮度更低。由此可見(jiàn)CTAB法的提取質(zhì)量劣于SDS法1。而SDS法2、改良版CTAB法提取的DNA無(wú)明顯彌散,點(diǎn)樣孔的亮度偏低,意味著兩種提取方法均可有效清除RNA、蛋白質(zhì)污染。但是,SDS法2是一種基于SDS法1的提取方法,依然無(wú)法有效祛除酚類氧化物質(zhì)污染,所以DNA產(chǎn)率偏低。而改良版CTAB法可避免RNAase的負(fù)面影響,在有效祛除DNA、蛋白質(zhì)污染的同時(shí),可簡(jiǎn)化提取步驟,可提高DNA產(chǎn)率。因此,改良版CTAB法的DNA提取質(zhì)量大于SDS法2、CTAB法、SDS法1(P<0.05)。

    2.2 四種DNA提取方法的濃度、純度比較

    四種DNA提取方法提取的丹參DNA濃度、純度存在明顯差異(P<0.05),詳情見(jiàn)表1。

    表1 四種DNA提取方法的濃度、純度比較

    3 討論

    DNA分子標(biāo)記是建立在提取高質(zhì)量DNA的前提下,因此需要有效、快速提取植物中的DNA,提取的DNA質(zhì)量也直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)構(gòu)[6]。高質(zhì)量DNA必須高純度、無(wú)降解、高分子量、無(wú)蛋白污染、無(wú)糖類污染、無(wú)鹽類污染等雜質(zhì)污染[7]。而AFLP分子標(biāo)記模板對(duì)DNA有更高的要求。主要是因?yàn)楦哔|(zhì)量DNA可進(jìn)行完全酶切,具有高特異性,高連接效率,高重復(fù)性,獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相對(duì)可靠準(zhǔn)確。臨床有研究[8-9]指出,相較于SDS法1,SDS法2的提取質(zhì)量(DNA產(chǎn)率高,污染少)更優(yōu)。也有研究[4]指出,改良版CTAB法提取丹參葉片DNA的濃度2.345、純度356與CTAB法的濃度2.118、純度706存在顯著差異。從本研究結(jié)果可看出,相較于SDS法2、CTAB法、SDS法1這三種DNA提取方法,改良版CTAB法提取丹參葉片DNA,質(zhì)量最好。

    由上可知,改良版CTAB法可有效提取丹參DNA。

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