實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在細(xì)菌布魯氏菌檢驗(yàn)中的應(yīng)用效果

謝曉丹

（江門(mén)市新會(huì)區(qū)第二人民醫(yī)院，廣東 江門(mén) 529100）

0 引言

布魯氏菌是起源上世紀(jì)的人畜共患病癥，布魯氏菌通常具有羊、牛、豬、犬、綿羊以及沙林鼠等6個(gè)種類，其中牛、羊、豬、犬是主要的人畜共患菌種[1]。該病癥會(huì)促使患者產(chǎn)生生殖器官炎癥，造成不孕不育等病癥，并且病菌的影響具有隱匿性，通常情況下無(wú)法迅速探知細(xì)菌的存在[2]。另外，該細(xì)菌無(wú)有效的藥物進(jìn)行清除，僅通過(guò)控制為主。因此早期的診斷對(duì)護(hù)理措施的開(kāi)展有重要作用，檢測(cè)通?？煞譃檠鍣z測(cè)和分子生物監(jiān)測(cè)，本次通過(guò)選用PCR技術(shù)，即分子生物學(xué)檢測(cè)，為探究實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在細(xì)菌布魯氏菌檢驗(yàn)中的應(yīng)用效果，選取疑似帶有細(xì)菌布魯氏菌患者進(jìn)行研究，有以下報(bào)告。

1 資料與方法

1.1 一般資料

通過(guò)選取我院2019年1月至2020年1月的200例疑似帶有細(xì)菌布魯氏菌患者進(jìn)行研究，通過(guò)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)減小檢測(cè)，經(jīng)過(guò)病理檢測(cè)可知受檢測(cè)患者包含86例布魯氏菌患者，17例沙門(mén)菌患者，32例金色葡萄球菌患者，43例副溶血性孤菌患者以及22例輪狀病毒患者。

1.2 檢測(cè)方法

相關(guān)儀器及試劑：采用定量PCR擴(kuò)增儀和其他離心機(jī)以及細(xì)菌基因組提取試劑盒。

方法：常規(guī)PCR測(cè)試方法，選用50μl，10×buffer5μl，同時(shí)引物各取0.25μl，Taq聚合酶0.8μl，dNTPs0.5μl，粗體DNA模板1μl。擴(kuò)增條件：設(shè)定溫度為94℃，對(duì)樣本變性4min，隨后以94℃變性45s后降低至58℃變性40s，后延伸至72℃變性60s，共計(jì)需要經(jīng)32次循環(huán)過(guò)程，最后以72℃保溫5min[3]。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)：①樣本提取：首先采用熱裂解法提取10mL的細(xì)菌培養(yǎng)液置于試管，隨后通過(guò)使用蒸餾水對(duì)其進(jìn)行滅菌洗滌，共2次，最后選用1mL的蒸餾水懸浮，隔水煮沸10min，同時(shí)以8000r/min的離心操作進(jìn)行10min離心，取上清制成DNA模板溶液。②PCR反應(yīng)，于定量擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，根據(jù)說(shuō)明書(shū)對(duì)參數(shù)進(jìn)行設(shè)定，同時(shí)需要對(duì)陽(yáng)性梯度模板和陰性對(duì)照。

1.3 觀察指標(biāo)

觀察實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)在各個(gè)細(xì)菌中的特異性和靈敏度。特異性根據(jù)PCR試劑盒以及引起病癥的細(xì)菌類型進(jìn)行分析，共計(jì)5類病菌；靈敏度以定量對(duì)照模板進(jìn)行10倍系列稀釋，選取一項(xiàng)濃度檢測(cè)結(jié)果體現(xiàn)在2×102～2×107/mL的范圍之間，并體現(xiàn)其靈敏度[5]。

觀察PCR常規(guī)檢測(cè)法與實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的陽(yáng)性率差別。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 18.0對(duì)資料進(jìn)行分析處理，患者的計(jì)量資料（±s）與計(jì)數(shù)資料（%），分別應(yīng)用t、χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各細(xì)菌攜帶者的特異性和靈敏度情況

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)在各個(gè)細(xì)菌中的特異性和靈敏度分別為，特異性：布魯氏菌100.00%，沙門(mén)菌48.64%，金色葡萄球菌72.17%，副溶血性孤菌55.63%，輪狀病毒31.69%。靈敏度布魯氏菌99.9%，沙門(mén)菌42.56%，金色葡萄球菌61.52%，副溶血性孤菌51.91%，輪狀病毒26.48%，詳情見(jiàn)表1。

表1 各細(xì)菌攜帶者的特異性和靈敏度情況[n（%）]

2.2 PCR常規(guī)檢測(cè)法與實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的陽(yáng)性率對(duì)比

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的陽(yáng)性率為43.00%（86/200），高于常規(guī)PCR檢測(cè)法的30.50%（61/200）。

表2 PCR常規(guī)檢測(cè)法與實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的陽(yáng)性率對(duì)比[n（%）]

3 討論

我國(guó)屬于布魯氏菌的高發(fā)國(guó)家，在青海、西藏等地區(qū)具有極高的患病率，由于無(wú)有效的藥物進(jìn)行治療，因此對(duì)病癥的預(yù)防具有重要作用。國(guó)際醫(yī)學(xué)學(xué)者在布魯氏菌的研究中提供了多項(xiàng)診斷操作，主要包含了以下兩大內(nèi)容：①病原學(xué)檢測(cè)，病原體的分離培養(yǎng)是醫(yī)學(xué)目前診斷病癥的黃金標(biāo)準(zhǔn)。也是最有效的細(xì)菌檢測(cè)方式，但由于時(shí)間長(zhǎng)、危險(xiǎn)性高，同時(shí)需要培養(yǎng)活菌，操作人員具有感染的風(fēng)險(xiǎn)，因此無(wú)法廣泛用于檢測(cè)。②血清學(xué)檢測(cè)，該內(nèi)容主要包含平板凝聚試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)以及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)。但由于血清學(xué)檢測(cè)特異性不足，敏感度較差以及操作復(fù)雜等缺點(diǎn)，未能被廣泛推廣。目前有更多的分子生物學(xué)方法進(jìn)行布魯氏菌是檢測(cè)，其中則包含了PCR的應(yīng)用，該方式特異性以及敏感度高，可作用于布魯氏菌的定型試驗(yàn)[6-8]。

本文通過(guò)選取200例攜帶細(xì)菌患者進(jìn)行研究得出結(jié)果：在實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，顯示檢測(cè)帶有布魯氏菌患者86例，特異性100%，靈敏度為99.9%，均高于其他細(xì)菌檢測(cè)；對(duì)比各項(xiàng)常規(guī)PCR技術(shù)的細(xì)菌檢測(cè)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的陽(yáng)性率為43.00%（86/200），高于常規(guī)PCR檢測(cè)法的30.50%（61/200），由此可見(jiàn)布魯氏菌在熒光定量PCR的特異性和靈敏度，同時(shí)在與常規(guī)PCR檢測(cè)對(duì)比中可保持較高的陽(yáng)性率，具有較高的診斷價(jià)值[8-10]。

綜上所述，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)菌布魯氏菌，具有高特異性、高靈敏度以及高陽(yáng)性率，診斷價(jià)值較高。