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    巨細胞病毒感染患兒細胞免疫應答反應及臨床意義①

    2021-01-26 07:37:38李雪茹徐衛(wèi)華范曉晨
    中國免疫學雜志 2021年1期
    關(guān)鍵詞:載量亞群尿液

    李雪茹 徐衛(wèi)華 范曉晨

    (安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院兒科,合肥 230022)

    巨細胞病毒(cytomegalovirus,CMV)屬于皰疹病毒β亞科,可以長期潛伏于人體的血液、尿液、乳汁等體液中,通過輸血、呼吸道、垂直途徑等多種方式傳播[1]。CMV在人群中存在普遍感染,且大多數(shù)感染呈隱性感染或潛伏感染,當機體免疫功能低下時,再活化感染[2]。然而,嬰幼兒CMV感染常表現(xiàn)出肺、肝、腦等多臟器損傷,且年齡越小,顯性感染患者所占比例越多,這可能與嬰幼兒的免疫系統(tǒng)尚不完善有關(guān)[3]。多項研究顯示,CMV感染可引起宿主免疫器官損傷,機體免疫力下降,激活潛伏病毒,引起多臟器功能損傷[4-5]。T淋巴細胞亞群是介導細胞免疫應答的主要細胞群,可分泌多種細胞因子,參與了CMV感染的發(fā)生發(fā)展,但T淋巴細胞亞群變化與CMV感染患兒臨床癥狀及載毒量之間的關(guān)系研究報道較少[6]。因此,本研究采用流式細胞技術(shù)分析了CMV感染患兒的T淋巴細胞亞群,旨在探討細胞免疫與CMV感染發(fā)病之間的關(guān)系,為CMV感染患兒的治療提供一定的理論依據(jù)。

    1 資料與方法

    1.1資料

    1.1.1一般資料 選擇2015年6月至2019年5月在本院確診的97例CMV感染患兒。納入標準:均符合2012年《兒童巨細胞病毒性疾病診斷和防治的建議》中CMV感染的診斷標準[7],尿液聚合酶鏈式反應顯示CMV DNA陽性;均獲得患兒家屬知情同意,經(jīng)本院醫(yī)學倫理委員會通過。排除標準:先天氣道發(fā)育畸形、呼吸道異物等疾病。CMV感染組根據(jù)有無癥狀分為癥狀組(60例)和無癥狀組(37例),癥狀組男32例,女28例,年齡1~12個月,平均(5.89±1.76)個月,臨床癥狀:28例表現(xiàn)為肺炎,23例表現(xiàn)為單純肝功能損害,3例表現(xiàn)為黃疸合并肝功能損害,4例表現(xiàn)為聽力受損,2例表現(xiàn)為血小板減少;無癥狀組男20例,女17例,年齡1~12個月,平均(5.94±1.78)個月,表現(xiàn)為無癥狀性感染。選擇同期健康體檢嬰兒48例為對照組,對照組男26例,女22例,年齡1~12個月,平均(5.92±1.80)個月。3組年齡、性別等一般資料無顯著差異(P>0.05)。

    1.1.2儀器和試劑 FACSCanto Ⅱ流式細胞儀由美國BD Biosciences公司提供;淋巴細胞亞群檢測抗體抗CD3-FITC、CD4-APC、CD8-PE購自美國BD Multitest公司;IL-6、IL-10、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)檢測試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司;CMV病毒定量PCR擴增檢測試劑盒購自上海羽朵生物科技有限公司。

    1.2方法

    1.2.1RT-PCR檢測尿液CMV DNA 取所有患兒的1 ml尿液標本,離心(15 000 r/min,15 min),采用煮沸法提取尿液DNA,CMV檢測試劑盒進行RT-PCR反應,嚴格按照說明書進行操作。

    1.2.2外周血標本采集 清晨采集CMV感染患兒以及健康體檢者靜脈血2 ml,用乙二胺四乙酸抗凝,一份離心(3 000 r/min,10 min),取血漿置-80℃冰箱凍存,采用ELISA法用于檢測IL-6、IL-10、TNF-α水平;另一份直接用于流式細胞儀分析。

    1.2.3流式細胞儀分析T淋巴細胞亞群 取20 μl抗凝血,加入紅細胞裂解液溶解紅細胞,離心(1 000 r/min,5 min),棄上清,加 PBS 重懸細胞,分別加入5 μl熒光標記抗體FITC anti-human CD3、熒光標記抗體anti-human CD4 APC、熒光標記抗體anti-human CD8 PE,分別以FITC、APC和PE作為同型對照,振蕩混勻,室溫避光孵育15~20 min,加入PBS 2 ml,離心(1 000 r/min,5 min),棄上清,加PBS重懸細胞,取200 μl置于流式細胞儀檢測和數(shù)據(jù)分析。

    2 結(jié)果

    2.1CMV感染患兒尿液中CMV DNA載量 癥狀組CMV感染患兒尿液中CMV DNA載量明顯高于無癥狀組CMV感染患兒(P<0.05),見表1。

    2.2CMV感染患兒外周血T淋巴細胞亞群 與對照組相比,CMV感染患兒有癥狀組和無癥狀組外周血CD3+T、CD3+CD4+T和CD4+/CD8+細胞水平均明顯降低 (P<0.05), 有癥狀組外周血CD3+CD8+T細胞水平明顯升高(P<0.05);與CMV感染患兒無癥狀組相比,CMV感染患兒有癥狀組外周血CD3+T、CD3+CD4+T和CD4+/CD8+水平均明顯降低(P<0.05),CD3+CD8+T明顯升高(P<0.05),見圖1,表2。

    表1 CMV感染患兒尿液中CMV DNA載量

    2.3CMV感染患兒血漿細胞因子水平 與對照組相比,CMV感染患兒有癥狀組和無癥狀組血清IL-6、IL-10和TNF-α水平均明顯升高(P<0.05),與CMV感染患兒無癥狀組相比,有癥狀組血清IL-6、IL-10和TNF-α水平均明顯升高(P<0.05),見表3。

    2.4CMV感染患兒外周血T淋巴細胞亞群與細胞因子之間的相關(guān)性 CMV感染患兒外周血CD3+T、CD3+CD4+T和CD4+/CD8+細胞水平均與IL-6、IL-10和TNF-α水平呈顯著的負相關(guān)(P<0.05),CD3+CD8+T細胞水平均與IL-6、IL-10和TNF-α水平呈顯著的正相關(guān)(P<0.05),見表4。

    2.5CMV感染患兒外周血T淋巴細胞亞群與CMV DNA載量之間的相關(guān)性 CMV感染患兒外周血CD3+T、CD3+CD4+T和CD4+/CD8+細胞水平均與CMV DNA載量呈顯著的負相關(guān)(r=-0.295,-0.443,-0.328,P<0.05),CD3+CD8+T細胞水平與CMV DNA載量呈顯著的正相關(guān)(r=0.224,P<0.05),見圖2。

    圖1 CMV感染患兒外周血T淋巴細胞亞群Fig.1 T lymphocyte subsets in peripheral blood of children with CMV infectionNote:A.Symptom group;B.Asymptomatic group;C.Control group.

    表2 CMV感染患兒外周血T淋巴細胞亞群

    表3 CMV感染患兒血漿細胞因子水平

    表4 CMV感染患兒外周血T淋巴細胞亞群與細胞因子之間的相關(guān)性(r,n=97)

    圖2 CMV感染患兒外周血T淋巴細胞亞群與CMV DNA載量之間的相關(guān)性Fig.2 Correlation between peripheral blood T lymphocyte subsets and CMV DNA load in children with CMV infection

    3 討論

    CMV感染在大部分人群中呈陰性感染,但在部分免疫功能低下者(胎兒和新生兒、先天性免疫缺陷病等)中可引起危及生命的病變,嚴重危害了患兒的生命健康[8]。本研究分析了CMV患兒的病毒載量與臨床癥狀之間的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)CMV感染有癥狀的患兒尿液中的載毒量明顯高于無癥狀患兒,提示CMV患兒的病毒載量直接影響了病情發(fā)展和臨床癥狀。目前,CMV感染的治療主要采用營養(yǎng)支持、抗病毒治療以及對癥治療,但其治療效果并不十分滿意[9]。分析CMV感染的發(fā)病機制,對CMV感染的預防和治療具有重要意義。

    已有多項研究顯示,CMV感染可引起T細胞亞群及輔助性T細胞1(helper T cells 1,Th1)和Th2細胞分泌的細胞因子比例失衡,從而引起機體的免疫系統(tǒng)功能紊亂,導致各臟器功能出現(xiàn)一系列損傷[10-11]。本研究分析了CMV患兒的T淋巴細胞亞群水平,發(fā)現(xiàn)CMV感染患兒的CD3+T、CD3+CD4+T和CD4+/CD8+水平均明顯降低,且有癥狀組較無癥狀組下降更為明顯,提示CMV感染患兒的T淋巴細胞亞群變化與CMV感染的病情發(fā)展有關(guān)。T淋巴細胞亞群是機體細胞免疫的主要細胞群體,按功能可分為輔助性T細胞(T helper cells,Th)、記憶T細胞、調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cells,Treg)、細胞毒性T細胞(cytotoxic T cells,Tc)和抑制性T細胞(suppressor T cell,Ts)[12]。CD4+T 細胞主要為Th細胞,CD8+T分布于Tc細胞及Ts細胞表面,共同調(diào)節(jié)細胞的免疫功能[13-14]。Th細胞包括Th1、Th2、Th17等,可以分泌IL-6、IL-10、TNF-α/TNF-β等多種細胞因子,促進其他T細胞的分化成熟,還可以輔助B細胞分化為抗體分泌細胞,參與細胞免疫和體液免疫的調(diào)節(jié),Tc細胞可以直接清除病毒、腫瘤等靶細胞,Ts細胞則能抑制Th細胞,負向調(diào)節(jié)細胞的免疫功能[15]。徐玲等[16]的研究顯示,CMV感染患兒存在細胞免疫功能紊亂,本研究結(jié)果與其基本一致,提示細胞免疫功能下降與CMV感染的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

    Th1細胞主要分泌IL-2、IFN- γ和TNF-α/TNF-β等細胞因子,介導細胞免疫反應,Th2細胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL-13等細胞因子,調(diào)節(jié)體液免疫反應[17]。本研究中,CMV感染患兒的血清IL-6、IL-10和TNF-α水平均明顯升高,且有癥狀組較無癥狀組升高更為明顯。ORCIANI等[18]的研究顯示,IL-6和IL-10是由Th2細胞分泌的細胞因子,在維持機體正常的免疫應答中發(fā)揮著重要的作用,當其水平升高可拮抗Th1功能,抑制細胞免疫。TNF-α是由Th1細胞分泌的一種細胞因子,可以激活T細胞,刺激B淋巴細胞產(chǎn)生抗體,當其水平升高可影響全身炎癥反應,引起機體各組織器官損傷[19]。LIMAYE等[20]的研究顯示,CMV感染患兒體內(nèi)的細胞因子分泌紊亂可推進CMV感染病情發(fā)展,進一步引起肝腎等組織臟器損傷的主要因素,提示CMV感染的發(fā)生與細胞因子失衡密切相關(guān)。本研究中,CMV感染患兒的外周血CD3+T、CD3+CD4+T和CD4+/CD8+水平均與血清IL-6、IL-10和TNF-α有關(guān),提示CMV感染患兒的病情發(fā)展主要由于細胞免疫功能下降引起的細胞因子分泌異常,臨床需根據(jù)提高CMV感染患兒的細胞免疫功能,糾正細胞因子分泌異常。本研究中,CMV感染患兒的外周血CD3+T、CD3+CD4+T和CD4+/CD8+水平與患者的CMV DNA病毒載量呈顯著的負相關(guān)關(guān)系,提示CMV感染患兒的外周血CD3+T、CD3+CD4+T和CD4+/CD8+水平與患者的病情發(fā)展和臨床癥狀有關(guān),臨床可根據(jù)患者的外周血CD3+T、CD3+CD4+T和CD4+/CD8+水平,正確評估患者的病情發(fā)展,及早做好預防和治療措施。

    綜上所述,CMV感染患兒的外周血CD3+T、CD3+CD4+T和CD4+/CD8+水平明顯下降,且其下降水平與細胞因子水平和CMV DNA病毒載量顯著相關(guān),有望應用于指導臨床預防和治療工作的進行。

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