胰高血糖素樣肽1受體激動(dòng)劑在非酒精性脂肪性肝病治療中的作用及相關(guān)機(jī)制

俞曉菡，王雨露，許笑陽(yáng)，平 鍵，1b，2，3，趙長(zhǎng)青，1b，2，3

1 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院 a.肝病研究所, b.肝病二科，上海 201203； 2 上海市中醫(yī)臨床重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201203； 3 肝腎疾病病證教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201203

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一種無過量飲酒史，以肝細(xì)胞脂肪變性和脂質(zhì)貯積為特征的臨床病理綜合征。隨著對(duì)疾病的深入認(rèn)識(shí)，國(guó)際專家組建議以代謝相關(guān)脂肪性肝病(metabolic associated fatty liver disease, MAFLD)代替現(xiàn)有命名[1]。NAFLD影響了全世界超過25%的普通人群，也是美國(guó)進(jìn)行肝移植的主要指征之一[2-4]。研究表明，NAFLD與代謝綜合征關(guān)系密切，由于中國(guó)人群調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的基因更易發(fā)生非同義突變，NAFLD在中國(guó)人群中具有更高的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。在過去10年中，NAFLD發(fā)病率從18%急劇增加到29%，增長(zhǎng)速度是西方的2倍[5]。NAFLD的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，近年“多重打擊”學(xué)說逐漸取代經(jīng)典的“二次打擊”學(xué)說以解釋NAFLD的發(fā)病機(jī)制[6]。NAFLD的發(fā)病過程與胰島素抵抗、脂毒性、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和肝臟因子等多種因素有關(guān)，但在機(jī)制間的相互作用以及在NAFLD發(fā)生發(fā)展中的變化規(guī)律有待進(jìn)一步明確。迄今為止，針對(duì)NAFLD尚無公認(rèn)的藥物療法，因此尋找新治療方案十分迫切。NAFLD是一種代謝紊亂相關(guān)的多系統(tǒng)疾病[7]，在2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus, T2DM)和肥胖患者中更為常見[8]。鑒于胰高血糖素樣肽1(Glucagon-like peptide-1, GLP-1)受體激動(dòng)劑已成功用于臨床治療T2DM和肥胖癥[9]，故近年來，GLP-1對(duì)NAFLD的影響也成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。本文綜述GLP-1受體激動(dòng)劑在NAFLD中的治療作用及相關(guān)機(jī)制。

1 胰高血糖素樣肽1(GLP-1)

20世紀(jì)初，研究發(fā)現(xiàn)正常體質(zhì)量者和肥胖者在口服葡萄糖后均刺激了胰島素的分泌，稱該作用為腸降血糖素作用。GLP-1被發(fā)現(xiàn)是腸降血糖素之一，攝入食物后通過刺激胰島β細(xì)胞分泌胰島素克服餐后高血糖癥[10]。GLP-1可以通過與B類家族中結(jié)構(gòu)相似的G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合，促進(jìn)其生物學(xué)作用，GLP-1是GLP-1受體(GLP-1R)的內(nèi)源性配體，可激活腺苷酸環(huán)化酶提高環(huán)磷酸腺苷水平。GLP-1R在人體中分布廣泛[11]，近年研究[12]表明，GLP-1R在肝門附近的門靜脈壁上表達(dá)，可能位于門靜脈神經(jīng)末梢。并且，在肝臟中，GLP-1于肝門靜脈循環(huán)中被釋放，在門靜脈中達(dá)到其最高靜脈內(nèi)濃度[13]。雖然，未在肝臟中發(fā)現(xiàn)大量GLP-1R，但是與其同源的胰高血糖素受體在人肝細(xì)胞中大量表達(dá)，也介導(dǎo)了GLP-1的肝效應(yīng)[13]。因此，肝臟也是GLP-1的潛在靶標(biāo)。GLP-1具有許多促新陳代謝作用，包括葡萄糖依賴性的胰島素分泌刺激，胃排空減少，食物攝取抑制，利尿以及調(diào)節(jié)嚙齒動(dòng)物胰島β細(xì)胞增殖。并且，還可抑制嚙齒動(dòng)物和人類的餐后乳糜微粒分泌并降低循環(huán)甘油三酯水平[14-15]，參與減輕局部或全身炎癥。GLP-1R激動(dòng)劑已成功用于臨床治療T2DM，其中長(zhǎng)效GLP-1R激動(dòng)劑利拉魯肽[16]是目前臨床T2DM一線用藥之一，幾種基于GLP-1的藥物療法正在臨床治療肥胖癥。

2 GLP-1R激動(dòng)劑在NAFLD中的臨床研究

2.1 減輕胰島素抵抗 Khoo等[17]將24例NAFLD肥胖患者分為2組分別接受利拉魯肽(3 mg/d)或等量生理鹽水治療26周。治療后，治療組患者總脂肪含量和胰島素抵抗水平均明顯降低；血清ALT、AST、肝脂肪分?jǐn)?shù)和肝硬度也較基線水平顯著改善。分析表明，GLP-1R激動(dòng)劑可通過降低體質(zhì)量、肝酶活性和肝臟脂肪分?jǐn)?shù)進(jìn)而降低患者胰島素抵抗水平。

Armstrong團(tuán)隊(duì)[18]每天用1.8 mg利拉魯肽或等量安慰劑分別治療14例非酒精性脂肪性肝炎(NASH)患者12周。發(fā)現(xiàn)利拉魯肽可以提高肝臟胰島素敏感性，改善患者空腹血糖水平；增加全身脂肪組織(尤其是皮下組織)胰島素敏感性，降低NASH中功能異常脂肪組織的脂毒性，加強(qiáng)胰島素抑制脂解的能力。

2.2 調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝 Petit等[19]開展了一項(xiàng)臨床研究，接受6個(gè)月1.2 mg/d的利拉魯肽注射治療后，57例NAFLD合并T2DM患者肝臟脂肪含量較基線水平下降了33%，該作用與肝酶活性的改善明顯相關(guān)。GLP-1R激動(dòng)劑誘導(dǎo)的體質(zhì)量減少也是引起肝脂肪含量降低的重要因素，同時(shí)促進(jìn)了HbA1c和甘油三酯指標(biāo)的改善。

Armstrong等[18]還發(fā)現(xiàn)利拉魯肽降低了脂肪胰島素抵抗指數(shù)和INS-1/2-max非酯化脂肪酸，減少了循環(huán)中脂毒性代謝和促炎介質(zhì)的數(shù)量，明顯抑制了肝臟脂肪的從頭合成。

Shao等[20]納入60例NAFLD合并T2DM的肥胖癥患者，分別用GLP-1R激動(dòng)劑艾塞那肽或強(qiáng)化胰島素治療12周后，發(fā)現(xiàn)經(jīng)GLP-1R激動(dòng)劑可通過降低肥胖患者的體質(zhì)量而減輕患者肝損傷。此外，肝活檢發(fā)現(xiàn)經(jīng)艾塞那肽治療后，脂肪肝的逆轉(zhuǎn)率高達(dá)93.3%，GLP-1R激動(dòng)劑有效逆轉(zhuǎn)了肝細(xì)胞脂肪變性。

2.3 改善肝臟組織學(xué) Armstrong等[21]在一項(xiàng)Ⅱ期臨床試驗(yàn)中，將52例NASH患者按1∶1比例隨機(jī)接受1.8 mg/d利拉魯肽或等量生理鹽水注射治療48周，經(jīng)藥物治療的9例患者消除了NASH且無纖維化惡化，3例T2DM和6例非T2MD患者肝組織學(xué)得到改善。與安慰劑相比，經(jīng)利拉魯肽治療的患者肝纖維化明顯好轉(zhuǎn)，并且肝細(xì)胞脂肪變性和氣球樣變性改善的比例更高。

Eguchi等[22]用0.9 mg/d利拉魯肽治療26例糖耐量異常NASH患者24周后，血清HbA1c水平明顯下降。并在第96周時(shí)，對(duì)10例患者進(jìn)行了重復(fù)肝活檢，其中6例患者NASH活性評(píng)分和Brunt評(píng)分顯示組織學(xué)炎癥程度減輕。另有研究[17，23]表明，GLP-1R激動(dòng)劑可明顯降低受試者肝酶、總脂肪量和肝臟硬度。這些結(jié)果均提示，GLP-1R激動(dòng)劑可安全有效的改善肝組織學(xué)變化。

3 GLP-1R激動(dòng)劑影響NAFLD病程進(jìn)展的實(shí)驗(yàn)研究

3.1 在糖脂代謝中的作用 Rahman等[24]用利拉魯肽(200 μg/kg)治療高脂肪、果糖和膽固醇(fat, fructose, and cholesterol diet，HFCD)飲食喂養(yǎng)的WT型小鼠4周。發(fā)現(xiàn)用藥小鼠高血糖癥狀和胰島素敏感性得到了改善。機(jī)制研究顯示，利拉魯肽激活了HFCD-WT小鼠中磷酸肌醇依賴激酶、蛋白激酶B和蛋白激酶Cζ，抑制c-Jun氨基末端激酶的激活；同時(shí)下調(diào)了固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(sterol-regulatory element binding proteins，SREBP)-1c和碳水化合物響應(yīng)元件結(jié)合蛋白的表達(dá)(圖1)。提示，GLP-1R激動(dòng)劑通過激活肝細(xì)胞胰島素信號(hào)通路和抑制葡萄糖代謝主要調(diào)控因子改善了葡萄糖代謝。

注：PCSK9,前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin9型;HNF1α,肝細(xì)胞核因子1；ATGL，脂肪甘油三酯脂肪酶；PPARα,過氧化物酶體增值物激活受體α；CPT-1a,肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶-1a;ACOX-1,酰基輔酶A氧化酶-1;SREBP-1c,固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c;FAS,脂肪酸合酶;IRE-1,肌醇需要酶1;PERK, PKR樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶;ER,內(nèi)質(zhì)網(wǎng);NLRP3,富含亮氨酸的重復(fù)序列含受體的吡啶結(jié)構(gòu)域3。

PCSK9主要由肝臟分泌，是膽固醇穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)節(jié)劑[25]。近年來研究[26-27]表明，PCSK9也與葡萄糖代謝相關(guān)。Yang等[28]給7周大的db/db小鼠皮下注射利拉魯肽(200 μg/kg)，2次/d，連續(xù)7周后，肝細(xì)胞內(nèi)脂滴數(shù)量明顯減少，血糖、血脂水平得到改善，并發(fā)現(xiàn)血漿PCSK9與空腹血糖、胰島素之間呈正相關(guān)，抑制了HNF1α表達(dá)。進(jìn)一步研究表明，利拉魯肽以劑量及時(shí)間依賴性方式下調(diào)了PCSK9的蛋白質(zhì)和mRNA水平。并且，用高劑量利拉魯肽處理HepG2細(xì)胞24 h后，HNF1α的蛋白質(zhì)和mRNA的表達(dá)均降低。相反，抑制HNF1α的表達(dá)時(shí)，PCSK9的水平增高(圖1)。結(jié)論是在NAFLD中，GLP-1R受體激動(dòng)劑直接通過PCSK9調(diào)節(jié)葡萄糖代謝，而其改善脂質(zhì)代謝的部分作用是通過HNF1α依賴性機(jī)制降低PCSK9得以實(shí)現(xiàn)。

Fang等[29]給高脂飲食(HFD)的C57雄性小鼠注射利拉魯肽(200 μg/kg)8周后，明顯減輕了HFD-WT小鼠的肝細(xì)胞脂肪變性。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，利拉魯肽也降低了棕櫚酸酯(palmitate，PA)培養(yǎng)的HL-7702細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)水平。但是，過表達(dá)的miR-124a會(huì)抵消利拉魯肽減輕細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積的功能(圖1)?？芍?，GLP-1R激動(dòng)劑可抑制miR-124a，激活自噬以拮抗脂質(zhì)蓄積。

CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(homologous protein，CHOP)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子[30-31]。增加CHOP肝臟表達(dá)可以保護(hù)肝細(xì)胞免脂毒性的影響[32]。Rahman等[24]每天給予HFCD喂養(yǎng)的CHOP基因敲除(CHOP-/-)型和WT型小鼠利拉魯肽(200 μg/kg)或等量生理鹽水治療4周。治療后，2組小鼠的肝臟脂肪變性均有好轉(zhuǎn)，但WT組小鼠好轉(zhuǎn)更加明顯，其PPARα，肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶-1a、?；o酶A氧化酶-1和乙酰輔酶A氧化酶-2表達(dá)減少；SREBP-1c、PPARγ和脂肪酸合酶的表達(dá)水平也明顯下降，說明利拉魯肽可有效抑制WT小鼠新生脂肪的生成和過氧化物酶體的β氧化(圖1)。為進(jìn)一步研究其作用機(jī)制，作者用GLP-1R激動(dòng)劑Exendin-4和PA處理WT和Chop-/-小鼠原代肝細(xì)胞24 h后，比較數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)Exendin-4可通過CHOP分子抑制新生脂肪的合成。

Yu等[33]用無血清的DMEM或PA聯(lián)合脂多糖分別處理人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞，再用不同濃度(0、50、100、200、500 nmol/L)的利拉魯肽作用于HepG2細(xì)胞16 h。結(jié)果顯示，HepG2細(xì)胞的脂肪堆積明顯減輕，并以濃度梯度依賴性方式提高了HepG2細(xì)胞活力。他們還發(fā)現(xiàn)，利拉魯肽可以增加功能性線粒體含量，改善線粒體共定位，增強(qiáng)線粒體中PTEN誘導(dǎo)蛋白酶1前體和帕金蛋白(Parkin)的表達(dá)，并抑制細(xì)胞中NLRP3炎性體的活化(圖1)。表明，GLP-1R激動(dòng)劑可以通過增強(qiáng)線粒體吞噬作用來減少脂質(zhì)蓄積，限制活性氧的產(chǎn)生，并通過抑制NLRP3炎性小體的激活減少肝細(xì)胞的凋亡，以治療NASH。

3.2 對(duì)肝臟炎癥反應(yīng)的抑制作用 ER應(yīng)激是導(dǎo)致肝臟脂肪變性、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的重要環(huán)節(jié)，而CHOP蛋白是ER應(yīng)激介導(dǎo)凋亡的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)器。Rahman等[24]每日給HFCD喂養(yǎng)后出現(xiàn)輕度脂肪性肝炎表現(xiàn)的Chop-/-型和WT型小鼠利拉魯肽(200 μg/kg)或等量生理鹽水治療4周。經(jīng)治療，2組小鼠肝臟炎癥表現(xiàn)減輕，HFCD-WT小鼠ER應(yīng)激調(diào)節(jié)因子PKR樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶和肌醇需要酶1活性減弱。但是HFCD-Chop-/-小鼠體內(nèi)肌醇需要酶1的表達(dá)未被抑制(圖1)?？芍狦LP-1R激動(dòng)劑還通過CHOP抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激以減輕HFCD所誘導(dǎo)的肝損傷，最終改善NASH的癥狀。脂肪甘油三酯脂肪酶(adipose triglyceride lipase, ATGL)是一種肝脂酶，主要通過沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1(silencing information regulator1, Sirt1)激活自噬/脂質(zhì)吞噬作用來調(diào)節(jié)肝內(nèi)脂質(zhì)分解和脂肪酸氧化[34]。Fang等[29]將HFD干預(yù)12周的C57BL/6J雄性小鼠分組后給予腹腔注射利拉魯肽(200 μg/kg)或等量生理鹽水治療8周。經(jīng)治療后發(fā)現(xiàn)，ATGL和Sirt1蛋白水平顯著升高。體外實(shí)驗(yàn)中，利拉魯肽增加了Sirt1的蛋白質(zhì)水平，降低體外炎癥反應(yīng)，減少肝細(xì)胞核中NF-κB p65的存在。他們還發(fā)現(xiàn)，GLP-1可抑制HFD-WT小鼠肝臟和PA處理的人肝細(xì)胞中miR-124a的表達(dá)，導(dǎo)致ATGL表達(dá)增加。各項(xiàng)數(shù)據(jù)顯示，抑制miR-124a會(huì)破壞炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞中ATGL和Sirt1的表達(dá)(圖1)。GLP-1R激動(dòng)劑能有效抑制miR-124a,上調(diào)ATGL/Sirt1途徑以減輕NAFLD中的炎癥。

Saad等[35]發(fā)現(xiàn)用40 μg/kg(體質(zhì)量)艾塞那肽治療HFD喂養(yǎng)的Wistar大鼠，能最有效地減輕肝細(xì)胞脂肪變性和門靜脈炎癥。研究表明，艾塞那肽降低了肝脂質(zhì)過氧化物水平，脂肪變性程度，使肝實(shí)質(zhì)再生。同時(shí)，顯著下調(diào)Toll樣受體4的肝含量，其下游信號(hào)通路NF-κB的表達(dá)也受到了抑制，其減少了TNFα誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，還調(diào)節(jié)了線粒體pH值，避免肝細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激和線粒體功能障礙(圖1)。GLP-1R通過Toll樣受體4抑制NF-κB信號(hào)，不僅使促炎基因的表達(dá)下調(diào)，還改善了線粒體功能，最終減輕了NAFLD炎癥反應(yīng)。

4 小結(jié)

目前，由于NAFLD復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制和臨床代謝表現(xiàn)，至今沒有靶向治療藥物。大量臨床和機(jī)制研究結(jié)果表明，鑒于T2DM與NAFLD的緊密關(guān)聯(lián)，降糖藥GLP-1R激動(dòng)劑可能是NAFLD的潛在藥物，其通過激活GLP-1R，提高體內(nèi)GLP-1水平。GLP-1R激動(dòng)劑主要在改善胰島素抵抗、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和抗肝纖維化三個(gè)方面發(fā)揮治療作用。對(duì)GLP-1R激動(dòng)劑影響NAFLD病程進(jìn)展的機(jī)制研究表明，GLP-1R激動(dòng)劑可以通過各種機(jī)制減少肝細(xì)胞凋亡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，促進(jìn)肝臟糖脂代謝，抑制炎癥反應(yīng)，緩解了肝纖維化進(jìn)程,預(yù)防NAFLD發(fā)展。目前，GLP-1R激動(dòng)劑在NAFLD的臨床研究主要集中在小樣本量的臨床試驗(yàn)，且對(duì)非T2DM的NAFLD臨床療效觀察甚少，以及對(duì)GLP-1如何在肝臟中發(fā)揮作用的探索不夠深入，故仍需進(jìn)一步研究，以期為治療NAFLD提供更多依據(jù)。

作者貢獻(xiàn)聲明：俞曉菡負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)，資料分析，撰寫論文；王雨露、許笑陽(yáng)參與收集數(shù)據(jù)；平鍵、趙長(zhǎng)青負(fù)責(zé)擬定寫作思路，修改論文，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。