茵陳蒿湯調(diào)控lncRNA PVT1/miRNA-30a-5p信號(hào)通路對(duì)重癥急性胰腺炎大鼠模型的保護(hù)作用

項(xiàng) 紅，胡鳳林,2，陶旭鋒，齊 心,2，張金楠,2，尚 東,1b,2

1 大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 a.中西醫(yī)結(jié)合臨床重點(diǎn)學(xué)科實(shí)驗(yàn)室, b.普外三科，遼寧 大連 116011；2 大連醫(yī)科大學(xué) 中西醫(yī)結(jié)合研究院，遼寧 大連 116044； 3 大連理工大學(xué) 化工學(xué)院，遼寧 大連 116024

重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP)是以胰腺局部壞死和臟器功能衰竭為主要特征的消化系統(tǒng)疾病，其發(fā)病率和死亡率逐年升高[1]。SAP病理研究[2-3]表明，胰蛋白酶原的過度激活導(dǎo)致胰腺腺泡損傷和細(xì)胞壞死在SAP的發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。細(xì)胞凋亡維持細(xì)胞膜的完整性而無炎癥反應(yīng)，但SAP胰腺腺泡細(xì)胞的凋亡延遲導(dǎo)致腺泡細(xì)胞晚期凋亡和壞死增加并釋放多種炎癥因子誘導(dǎo)炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)SAP重癥化演變[4]。因此，誘導(dǎo)受損的腺泡細(xì)胞從晚期凋亡向早期凋亡轉(zhuǎn)變可能減輕SAP的嚴(yán)重程度。近年來，細(xì)胞凋亡與自噬的相互調(diào)控引起了廣泛關(guān)注；研究[5]發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬和凋亡的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)是高度相互關(guān)聯(lián)的。最新研究[6-8]表明miRNA在細(xì)胞凋亡和自噬之間的相互作用中起著重要的調(diào)控作用；長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)可以作為一種miRNA競(jìng)爭(zhēng)性的內(nèi)源性RNA，參與生物調(diào)節(jié)過程[9]。然而，近年來關(guān)于lncRNA的研究大多集中在腫瘤上，在SAP中的作用研究還很少。茵陳蒿湯(YCHT)是由茵陳蒿、梔子和大黃組成的經(jīng)典中藥復(fù)方，在亞洲作為抗炎和利膽藥已有數(shù)百年的歷史[10]。本課題組前期通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)發(fā)現(xiàn)YCHT通過誘導(dǎo)凋亡、抗炎、抗氧化和血脂調(diào)節(jié)發(fā)揮對(duì)SAP的保護(hù)作用[11]，但具體的分子機(jī)制還不明確。

1 材料和方法

1.1 材料 牛磺膽酸鈉購(gòu)自Solarbio (中國(guó)，北京)；酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)(ELISA)試劑盒購(gòu)自Lengton (中國(guó)，上海)；TUNEL檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美侖(中國(guó)，大連)；各類抗體購(gòu)自Abcam (英國(guó)，劍橋)。RNA提取試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定理PCR試劑盒購(gòu)自TIANGEN(中國(guó)，北京)。

1.2 YCHT制備 YCHT由大連醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科提供，其制備經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)量控制。方法如下：將茵陳蒿在10倍于其質(zhì)量的蒸餾水中浸泡1 h，然后煎煮40 min，加入梔子和大黃，煮沸15 min。收集濾液后，將殘?jiān)菰?倍于其質(zhì)量的蒸餾水中，另外煎煮20 min。最后，將這兩次濾液混合并濃縮至0.25 g/ml。茵陳蒿∶梔子∶大黃的質(zhì)量比為2∶1∶1。

1.3 分組及實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒⒎椒?SD大鼠(雄性，200±20 g)購(gòu)自大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證編號(hào)：SCXK(遼)2018-0003；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證編號(hào)：SYXK(遼)2018-0007]。將30只SD大鼠隨機(jī)分為3組：假手術(shù)(Sham operation,SO)組(n=10)、SAP模型組(n=10)和YCHT (4.0 g/kg)治療組(n=10)。根據(jù)既往方法建立實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚚12]：大鼠禁食12 h，自由飲水，然后通過腹腔注射0.3%戊巴比妥鈉(1 ml/100 g)進(jìn)行麻醉，經(jīng)胰膽管逆行注射5.0%牛磺膽酸鈉(0.1 ml/100 g)建立SAP模型。模型建立成功后，治療組待大鼠麻醉蘇醒后每間隔6 h灌胃給予YCHT (4.0 g/kg)治療1次。SO組僅打開腹部作為對(duì)照。造模后24 h，取腹主動(dòng)脈血進(jìn)行生化分析，取胰頭標(biāo)本固定在4%多聚甲醛中進(jìn)行后續(xù)的組織病理學(xué)和免疫熒光分析；其他胰腺組織保存在-80 ℃，進(jìn)行后續(xù)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western Blot等分析。

1.4 HE染色 取多聚甲醛固定后的胰腺組織進(jìn)行石蠟包埋，并對(duì)切片進(jìn)行蘇木精和伊紅(HE)染色，并在放大200倍的顯微鏡(Olympus BX53，日本)下進(jìn)行觀察。

1.5 ELISA分析 采用ELISA試劑盒檢測(cè)血漿淀粉酶、TNFα和IL-1β水平。在450 nm處采用酶標(biāo)儀(BioTek，美國(guó))測(cè)量吸光度。

1.6 免疫熒光染色 胰腺切片脫蠟水合后，在4 ℃下與稀釋的兔源LC-3抗體(1∶100)孵育過夜，然后在37 ℃下與TRITC結(jié)合的山羊抗兔IgG(H+L)孵育1 h，并采用DAPI (5 μg/ml)復(fù)染5 min。最后在熒光顯微鏡(Olympus BX63，日本)200倍的視野下觀察拍照。根據(jù)LC-3蛋白的熒光強(qiáng)度和定位判斷胰腺組織的自噬情況。

1.7 TUNEL染色 采用TUNEL檢測(cè)試劑盒，按照說明書的方案進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)。將胰腺組織切片與熒光素(紅色)標(biāo)記的dUTP溶液在37 ℃的濕盒室中孵1 h，然后在熒光顯微鏡(Olympus BX63，日本)下觀察拍照。熒光圖像中陽(yáng)性細(xì)胞(紅色)的數(shù)量代表細(xì)胞凋亡。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量qPCR 采用總RNA提取試劑盒從細(xì)胞和胰腺組織中提取總RNA樣品，并測(cè)定提取RNA的純度，然后采用PrimeScript RT試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。最后按照試劑盒說明書，采用SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ (TliRNaseH Plus)試劑盒進(jìn)行基因的相對(duì)定量，以GAPDH和U6分別作為lncRNA PVT1和miRNA-30a-5p的內(nèi)參，并計(jì)算基因的表達(dá)變化?；蛞镄蛄幸姳?。

表1 引物序列

1.9 Western Blot 采用含1 mmol PMSF的預(yù)冷裂解緩沖液提取細(xì)胞和胰腺組織中的總蛋白樣品，并使用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒定量蛋白濃度。采用SDS-PAGE(10%～15%)法分離蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉，采用兔LC-3、Beclin-1、XIAP、Caspase-3和NF-κB抗體(1∶1000)在4 ℃下孵育過夜，并用山羊抗兔IgG在室溫下孵育2 h (1∶2000)。最后，采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法在凝膠成像儀下檢測(cè)相應(yīng)的蛋白表達(dá)。

1.10 倫理學(xué)審查 本研究方案經(jīng)由大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批，批號(hào)：AEE18072，符合實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物管理與使用準(zhǔn)則。

2 結(jié)果

2.1 YCHT減輕SAP誘導(dǎo)的大鼠胰腺損傷和炎癥反應(yīng)

HE染色顯示SO組大鼠胰腺未見明顯病理?yè)p傷，而SAP模型組大鼠胰腺出現(xiàn)水腫、壞死、出血及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；YCHT可明顯改善SAP誘導(dǎo)的胰腺病理?yè)p傷(圖1)。與形態(tài)學(xué)變化一致，胰腺組織病理學(xué)評(píng)分也顯示YCHT顯著減輕SAP誘導(dǎo)的胰腺損傷。ELISA結(jié)果表明，SAP模型組大鼠血漿淀粉酶、以及炎癥因子TNFα和IL-1β水平較SO組明顯升高，而YCHT可顯著降低其水平(表2)。這些結(jié)果證明YCHT能夠減輕SAP誘導(dǎo)的大鼠胰腺損傷和炎癥反應(yīng)。

圖1 YCHT對(duì)SAP大鼠胰腺病理的影響(HE染色，×200)

2.2 YCHT誘導(dǎo)SAP大鼠胰腺細(xì)胞凋亡 如圖2所示，SAP模型組大鼠TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞(紅色)數(shù)量多于SO組，并且YCHT治療組的紅色熒光進(jìn)一步增強(qiáng)，提示YCHT可增加TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量，誘導(dǎo)損傷胰腺細(xì)胞發(fā)生凋亡。

圖2 SO組、SAP模型組和YCHT治療組胰腺組織TUNEL染色(紅色)典型圖像(×200)

2.3 YCHT抑制SAP大鼠胰腺細(xì)胞自噬 LC-3是外源性刺激后自噬啟動(dòng)的一種特異性標(biāo)志物。如圖3所示，免疫熒光結(jié)果表明，與SO組相比，SAP大鼠胰腺組織顯示更多的LC-3陽(yáng)性區(qū)(紅色熒光)，但YCHT能夠明顯下調(diào)SAP誘導(dǎo)的LC-3蛋白表達(dá)，提示YCHT能夠抑制SAP大鼠胰腺細(xì)胞自噬。

表2 各組大鼠胰腺組織病理學(xué)評(píng)分以及血漿淀粉酶、TNFα、IL-1β水平的比較

圖3 SO組、SAP模型組和YCHT治療組胰腺組織LC-3蛋白表達(dá)(紅色)典型圖像(×200)

2.4 YCHT調(diào)節(jié)自噬和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá) 與SO組相比，SAP模型組LC-3Ⅱ/LC-3Ⅰ比值及Beclin-1、X連鎖凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein,XIAP)、Caspase-3和NF-κB蛋白表達(dá)明顯上調(diào)。然而，YCHT能夠顯著下調(diào)LC-3Ⅱ/LC-3Ⅰ、Beclin-1、XIAP和NF-κB的表達(dá)水平，并進(jìn)一步提高Caspase-3的表達(dá)水平(表3，圖4)，這些結(jié)果說明YCHT能夠抑制細(xì)胞自噬，同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。

表3 各組自噬和凋亡標(biāo)記蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較

注：1.SO組；2.SAP模型組；3.YCHT治療組

2.5 YCHT調(diào)控lncRNA PVT1/miRNA-30a-5p信號(hào)通路 SAP模型組lncRNA PVT1的表達(dá)水平明顯高于SO組，而miRNA-30a-5p的表達(dá)水平明顯低于SO組，但YCHT能夠顯著下調(diào)lncRNA PVT1以及升高miRNA-30a-5p的表達(dá)水平(表4)。

表4 YCHT對(duì)胰腺組織中l(wèi)ncRNA-PVT1和miRNA-30a-5p相對(duì)表達(dá)量的影響

3 討論

SAP病程復(fù)雜，其特征是胰腺腺泡細(xì)胞壞死，出現(xiàn)局部和全身炎癥[13]。胰腺腺泡細(xì)胞的早期凋亡被認(rèn)為是SAP中的自我保護(hù)機(jī)制，與發(fā)生晚期凋亡的腺泡細(xì)胞相比，早期凋亡的誘導(dǎo)可能會(huì)降低SAP的嚴(yán)重程度[14-15]。研究[16]報(bào)道有利于誘導(dǎo)胰腺腺泡細(xì)胞早期凋亡的干預(yù)措施可以保護(hù)小鼠免受SAP的侵害。

自噬是一個(gè)吞噬自身細(xì)胞質(zhì)蛋白或細(xì)胞器并使其包被進(jìn)入囊泡，并與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內(nèi)容物的過程[17]。細(xì)胞自噬在SAP發(fā)病機(jī)制中是一種保護(hù)機(jī)制還是一種有害機(jī)制仍然是一個(gè)懸而未決的問題[18]。研究[5,19]報(bào)道細(xì)胞凋亡與細(xì)胞自噬之間相互調(diào)控，細(xì)胞自噬可以抑制細(xì)胞應(yīng)激和化療后的細(xì)胞凋亡。此外，胰腺特異性自噬的過度激活引起腺泡細(xì)胞中酶原顆粒的大量積聚，進(jìn)一步增加了SAP損傷[16]。本研究發(fā)現(xiàn)YCHT能夠減輕SAP誘導(dǎo)的大鼠胰腺損傷和炎癥反應(yīng)；此外，采用免疫熒光和TUNEL法發(fā)現(xiàn)YCHT能夠顯著抑制SAP大鼠胰腺組織的細(xì)胞自噬以及增加細(xì)胞凋亡。

miRNA是一種非編碼的單鏈RNA，通過切割或翻譯抑制在動(dòng)植物中調(diào)控基因表達(dá)[20]；miRNA作為生物過程的關(guān)鍵調(diào)控因子參與了多種疾病的發(fā)生發(fā)展[21-22]。miRNA-30a-5p是miRNA-30家族的成員，在細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和凋亡等過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用[23]。據(jù)報(bào)道，miRNA-30a-5p在Ⅱ型糖尿病和胰腺導(dǎo)管腺癌的發(fā)發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用[24-25]。本組前期研究[12]也發(fā)現(xiàn)SAP胰腺組織miRNA-30a-5p的表達(dá)異常，能夠靶向上調(diào)人絲氨酸蛋白酶(HtrA serine peptidase 1, HTRA1)基因，抑制TGFβ1介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。此外，研究[26-27]發(fā)現(xiàn)miRNA-30a-5p通過直接與腫瘤細(xì)胞的3’-UTR區(qū)域序列結(jié)合，負(fù)性調(diào)節(jié)自噬基因Beclin-1和凋亡調(diào)節(jié)因子Bcl-2的表達(dá)，從而抑制自噬促進(jìn)凋亡。

lncRNA的轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過200個(gè)核苷酸殘基，但不編碼蛋白質(zhì)。最初被認(rèn)為是基因組轉(zhuǎn)錄的“噪音”，是RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)物，沒有生物學(xué)功能[28]。然而，近年來研究發(fā)現(xiàn)lncRNA可以通過直接結(jié)合靶基因來激活或抑制靶基因的表達(dá)，并通過組蛋白修飾或募集轉(zhuǎn)錄因子來參與基因表達(dá)調(diào)控，或者作為一種miRNA競(jìng)爭(zhēng)性的內(nèi)源性RNA，參與生物調(diào)節(jié)過程[9]。本組前期研究中，基于生物信息學(xué)方法和雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)lncRNA PVT1可能是一種內(nèi)源性miRNA-30a-5p的競(jìng)爭(zhēng)抑制劑，通過靶向調(diào)節(jié)lncRNA PVT1/miRNA-30a-5p信號(hào)通路介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和自噬可改善SAP。

中醫(yī)古籍中并無急性胰腺炎的相關(guān)記載，根據(jù)SAP腹痛、嘔吐、便結(jié)、黃疸等主要臨床表現(xiàn)，將其歸屬于中醫(yī)“腹痛”“脾心痛”“結(jié)胸”等范疇?？傮w來說，急性胰腺炎病性多為里、實(shí)、熱證，病機(jī)以肝膽氣機(jī)失調(diào)、濕熱蘊(yùn)阻中焦、脾胃升降失常為要。其中，在急性胰腺炎的發(fā)病過程中，濕、熱、瘀是最關(guān)鍵的病理因素，因此清熱利濕、活血化瘀應(yīng)作為最重要的治療原則貫穿始終。YCHT始見于漢代醫(yī)圣張仲景的《傷寒論》，主要病機(jī)是里熱熾盛、與濕相搏、壅滯中焦、瘀熱在里。通常認(rèn)為，茵陳清熱利濕、疏肝利膽，為君藥；梔子清泄三焦?jié)駸?，為臣藥；大黃瀉熱逐瘀、通降腑氣，為佐藥。近年來針對(duì)YCHT配伍機(jī)理進(jìn)行了更深入的研究，研究認(rèn)為在YCHT中，只有大黃既能清熱瀉火、活血化瘀，又可通利大便導(dǎo)濕熱而出，大黃相對(duì)于茵陳更符合“瘀熱在里”的病機(jī)。因此，在治療急性胰腺炎時(shí)，茵陳蒿湯中大黃可能起君藥作用，而茵陳、梔子對(duì)大黃有協(xié)同或相加效應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，YCHT顯著減輕SAP誘導(dǎo)的胰腺組織病理?yè)p傷，降低SAP大鼠血漿淀粉酶、以及炎癥因子TNFα和IL-1β水平，抑制炎癥反應(yīng)。機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，YCHT可通過抑制自噬和促進(jìn)細(xì)胞凋亡減輕SAP損傷，其機(jī)制可能與調(diào)控lncRNA-PVT1/miRNA-30a-5p信號(hào)通路有關(guān)。這些數(shù)據(jù)也為中藥方劑YCHT的進(jìn)一步開發(fā)提供了依據(jù)。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會(huì)成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突，特此聲明。

作者貢獻(xiàn)聲明：項(xiàng)紅、胡鳳林負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)，資料分析，撰寫論文；陶旭鋒參與收集數(shù)據(jù)，修改論文；齊心、張金楠協(xié)助收集數(shù)據(jù)，整理參考文獻(xiàn)；尚東負(fù)責(zé)擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。