肝泡型包蟲病特異microRNA的篩選及初步研究

任 賓，樊海寧，王海久，任 利

青海大學(xué)附屬醫(yī)院 肝膽胰外科，西寧 810001

肝泡型包蟲病(alveolar echinococcosis, AE) 是由多房棘球絳蟲(Echinococcus multilocularis, Em) 幼蟲寄生于人體而引起的一種疾病。該病原發(fā)于肝臟，呈侵入性、腫瘤樣生長(zhǎng)，有“蟲癌”之稱[1]。AE具有潛伏期長(zhǎng)、感染初期無明顯癥狀、后期易轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)[2]。

目前棘球蚴病的診斷主要依靠傳統(tǒng)的診斷方法，如臨床診斷、影像學(xué)診斷以及免疫學(xué)診斷。傳統(tǒng)診斷方法存在一定的不足，且患者間差異較大[3]，而影像學(xué)與免疫學(xué)在檢測(cè)靈敏性與特異性上存在欠缺[4]。分子生物學(xué)等技術(shù)的發(fā)展為棘球蚴病的診斷提供了更多的空間，也使包蟲病患者在早期診斷上有了重大突破。

微小RNA(miRNA)是一類內(nèi)源性的，長(zhǎng)度約為22 nt的小分子非編碼RNA，能夠通過靶向剪切mRNA或者翻譯抑制的方式在基因的轉(zhuǎn)錄后水平進(jìn)行調(diào)控，進(jìn)而影響多種生理和病理過程[5-6]。通過深入測(cè)序和miRNA微陣列技術(shù)，發(fā)現(xiàn)宿主細(xì)胞或組織中的miRNA在寄生蟲感染過程中被調(diào)控，并在宿主對(duì)病原體的反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[7-8]。Jin等[9]研究發(fā)現(xiàn)，感染多房棘球絳蟲會(huì)打亂小鼠肝臟中40%與miRNA合成相關(guān)的基因，例如ago1、ago4、tarbp2和xrn2等基因，由此通過深度測(cè)序分析發(fā)現(xiàn),而在泡球蚴感染寄主的過程中，miRNA也起著至關(guān)重要的作用[10]，對(duì)其功能性的預(yù)測(cè)顯示，其中一些miRNA參與了對(duì)寄生蟲感染的免疫和炎癥反應(yīng)[11]。由此可見，加深miRNA對(duì)寄生蟲侵染寄主過程中的調(diào)控這方面的研究，可針對(duì)特異miRNA調(diào)控的代謝途徑開發(fā)治療性藥物；也可針對(duì)病原相關(guān)的miRNA進(jìn)行檢測(cè)，提高前期診斷的靈敏性和特異性[12]。循環(huán)miRNA是一類在血清、血漿等體液中穩(wěn)定存在的分子，可感染蠕蟲的人和動(dòng)物的血液或體液中穩(wěn)定地檢測(cè)到[7,13-14]。循環(huán)miRNA已在各種腫瘤、心臟病、肝損傷等疾病中作為潛在生物標(biāo)志物，成為早期診斷、分型和預(yù)后判斷的重要指標(biāo)[15-19]。循環(huán)miRNA在寄生蟲感染中作為生物標(biāo)志物也有相關(guān)的報(bào)道，循環(huán)sja-miRNA-223是日本血吸蟲感染的潛在生物標(biāo)志物[20]。

基于以上推測(cè),肝泡型包蟲可能會(huì)導(dǎo)致血漿中miRNA的改變。所以本實(shí)驗(yàn)通過高通量小分子RNA芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn),患者病灶區(qū)組織和血漿中的miRNA表達(dá)譜與正常組織差異明顯，其中一些miRNA具有顯著性差異可作為檢測(cè)標(biāo)志物的候選分子，再通過熒光定量實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證這些潛在的miRNA檢測(cè)標(biāo)志物的候選分子是否存在差異性。探索血漿樣本和組織樣本的miRNA表達(dá)異質(zhì)性，確定血漿循環(huán)miRNA作為一種新的生物標(biāo)志物的可行性。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 納入2016年6月—2018年5月在本院確診的AE患者，選取其中2例患者的病灶邊緣組織、3例患者的臨近病灶邊緣的正常組織、3例患者的血漿樣本進(jìn)行microRNA芯片檢測(cè)，另隨機(jī)選取15例患者設(shè)為AE組進(jìn)行驗(yàn)證。納入同期于本院進(jìn)行體檢的健康者，選取其中3例健康體檢者的血漿樣本進(jìn)行microRNA芯片檢測(cè)，另隨機(jī)選取15例設(shè)為健康組進(jìn)行驗(yàn)證。AE診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《肝兩型包蟲病診斷與治療專家共識(shí)(2015版)》[21]。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)血清學(xué)包蟲病抗體IgG檢驗(yàn)、超聲檢查、肝臟三期動(dòng)態(tài)掃描、3.0T MRI動(dòng)態(tài)增強(qiáng)檢查完整者；(2)接受外科手術(shù)治療，術(shù)后病理亦確診為肝泡球蚴病。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并有慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎者；(2)既往有結(jié)核病史者；(3)合并其他病史并接受過肝臟手術(shù)治療者。

1.2 研究方法

1.2.1 miRNA的提取 手術(shù)取下0.5～250 mg組織標(biāo)本，在15 min內(nèi)用液氮浸沒迅速降溫保存。使用EDTA抗凝采血管新鮮收集AE患者和健康體檢者的全血標(biāo)本，4 ℃ 1500 r/min離心10 min收集上層血漿標(biāo)本。利用 mirVanaTM RNA Isolation Kit(Invitroge，AM1561)提取組織和血漿樣品的總RNA，提取的RNA樣本利用NanoDrop ND-2000 (Thermo Scientific)定量并經(jīng)Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies)檢測(cè)RNA完整性。

1.2.2 miRNA芯片檢測(cè)組織miRNA表達(dá)水平 RNA質(zhì)檢合格后，參照Agilent Human miRNA Microarray (8*60K，Design ID: 070156)芯片標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行樣本的標(biāo)記、芯片的雜交以及洗脫。首先，取100 ng total RNA起始，定容到2 μl，總RNA經(jīng)過去磷酸化；樣本在37 ℃ PCR儀上變性30 min，再進(jìn)一步用Cyanine-3-CTP(Cy3)標(biāo)記。標(biāo)記好的RNA純化后和芯片雜交，洗脫后利用Agilent Scanner G2505C(Agilent Technologies)掃描得到原始圖像。

1.2.3 miRNA數(shù)據(jù)分析 采用Feature Extraction 軟件 (version10.7.1.1, Agilent Technologies)處理原始圖像提取原始數(shù)據(jù)。接著利用Genespring軟件(version 12.5; Agilent Technologies)進(jìn)行quantile標(biāo)準(zhǔn)化和后續(xù)處理。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，用于比較的每組樣本中至少有1組75%標(biāo)記為Detected的探針留下進(jìn)行后續(xù)分析。 利用t檢驗(yàn)的P值和倍數(shù)變化值進(jìn)行差異miRNA篩選，篩選的標(biāo)準(zhǔn)為:log2(差異倍數(shù))絕對(duì)值>1.2、P<0.05。接著，利用3個(gè)數(shù)據(jù)庫(Targetscan、microRNAorg、PITA)共同對(duì)差異miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，對(duì)靶基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析，以判定差異miRNA主要影響的生物學(xué)功能或者通路。最后，對(duì)差異miRNA進(jìn)行非監(jiān)督層次聚類，利用熱圖的形式展示差異miRNA在不同樣本間的表達(dá)模式，為后續(xù)研究miRNA的篩選做準(zhǔn)備。

1.2.4 miRNA表達(dá)驗(yàn)證 利用實(shí)時(shí)PCR驗(yàn)證芯片檢測(cè)結(jié)果，(1)選擇在AE患者肝臟病灶邊緣帶組織差異顯著性表達(dá)的hsa-miRNA-4644，hsa-miRNA-136-5p，hsa-miRNA-483-3p。(2)血漿RNA提取與反轉(zhuǎn)錄：提取200 μl血漿至干凈的1.5 ml離心管中，加入1 ml QIAzol?Lysis Reagent，渦旋混勻，室溫靜置5 min，然后每管加入350 μl miRNeasy Serum/Plasma Spike-In Control (1.6×108拷貝/μl working solution)渦旋混勻，洗滌，從而收集總RNA溶液并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。應(yīng)用ABI7500定量PCR儀運(yùn)用SYBR Green實(shí)時(shí)PCR方法驗(yàn)證選擇的差異表達(dá)miRNA，采用公式: 2-△△ Ct計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量,△Ct=Ct(目的基因)-Ct(β-Actin)，△△Ct=△Ct(實(shí)驗(yàn)樣本)-△Ct (對(duì)照樣本)。檢測(cè)引物由天根生化科技(北京)有限公司合成，miRNeasy Serum/Plasma Spike-In Contro(miR39)由QIAGEN公司合成。

1.3 倫理學(xué)審查 本研究經(jīng)新青海大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批號(hào)：P-SE-2016056，患者均簽署知情同意書。

2 結(jié)果

2.1 miRNA表達(dá)譜中差異miRNA篩選 2例(1男1女，平均34.5歲)AE患者病灶邊緣組織和3例(1男2女，平均41.5歲)AE患者臨近病灶邊緣正常組織，以及3例(1男2女，平均47.0歲)AE患者血漿樣本和3例(1男2女，平均44.7歲)健康體檢者的血漿樣本共計(jì)2549個(gè)miRNA中，病灶邊緣組與臨近病灶邊緣正常組比較，以及AE組與健康組比較，存在6個(gè)差異miRNA(hsa-miRNA-136-5p、hsa-miRNA-4698、hsa-miRNA-4644、hsa-miRNA-4306、hsa-miRNA-483-3p、hsa-miRNA-1237-3)，其中上調(diào)表達(dá)有3個(gè)miRNA，下調(diào)表達(dá)有3個(gè)miRNA(表1，圖1)。

表1 AE患者miRNA表達(dá)譜中的差異miRNA

注：a,血漿樣本;b,組織樣本?；疑c(diǎn)，P>0.05的miRNA;綠色點(diǎn)，log2(差異倍數(shù))絕對(duì)值<1.2但P<0.05的miRNA；紅色點(diǎn)，log2(差異倍數(shù))絕對(duì)值>1.2且P<0.05顯著性上調(diào)的差異miRNA；藍(lán)色點(diǎn)，log2(差異倍數(shù))絕對(duì)值>1.2且P<0.05顯著性下調(diào)的差異miRNA。

2.3 熒光定量驗(yàn)證與靶基因的預(yù)測(cè) 驗(yàn)證樣本AE組15例患者中男8例，女7例，平均46.1歲；健康組15例患者中男6例，女9例，平均44.6歲。血漿樣本驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，hsa-miRNA-483-3p和hsa-miRNA-4644上調(diào)表達(dá)(P值均<0.05)，hsa-miRNA-136-5p下調(diào)表達(dá)(P<0.05)(表2)，與表1表達(dá)模式一致；血漿樣本驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，hsa-miRNA-483-3p上調(diào)表達(dá)(P<0.05)(表3)，與表1表達(dá)模式一致。驗(yàn)證結(jié)果顯示,hsa-miNAR-483-3p在血漿中的表達(dá)情況與組織中的表達(dá)情況一致，表明hsa-miR-483-3p可能是AE前期診斷的一個(gè)潛在的標(biāo)志分子。

表2 血漿中差異miRNA水平影響分析

表3 AE組患者組織中差異miRNA水平影響分析

2.4 靶基因的預(yù)測(cè)與GO分析 分別用TargetScan、PITA、microRNAorg數(shù)據(jù)庫對(duì)差異miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，對(duì)3個(gè)數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)到的靶基因取交集，共同擁有137個(gè)靶基因(圖2)。在3個(gè)靶基因(PITA、Targetscan、microRNAorg)預(yù)測(cè)的數(shù)據(jù)庫中，預(yù)測(cè)到hsa-miRNA-483-3p等調(diào)控的靶基因(IL-17A、IL-5、CD40LG、TAP2、TNF、CES1、LBR)，經(jīng)過查詢相關(guān)數(shù)據(jù)庫和文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，靶基因都是調(diào)控參與人體免疫反應(yīng)及與肝臟疾病有關(guān)的基因[22-23]。從圖3 GO分析中可以看出，差異表達(dá)的miRNA所調(diào)控的基因在生物學(xué)過程主要涉及依賴DNA的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，其次是參與多細(xì)胞生物體的發(fā)展調(diào)控以及參與T淋巴細(xì)胞增值相關(guān)的細(xì)胞免疫反應(yīng)等；在分子功能方面主要是與特異性DNA序列結(jié)合活性蛋白、泛素結(jié)合酶、逆向轉(zhuǎn)運(yùn)子、甾類激素等蛋白密切相關(guān)； 而在細(xì)胞成分方面，則與mRNA切割因子復(fù)合物、囊泡膜等多種細(xì)胞成分有關(guān)?？梢愿鶕?jù)GO分析的結(jié)果結(jié)合生物學(xué)意義從而挑選關(guān)于棘球蚴病相關(guān)用于后續(xù)研究的基因。

圖2 差異miRNA在不同的數(shù)據(jù)庫中靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果

注：按照P值排序，對(duì)前20位的條目(若總條目不大于20，則全部展示)利用條形圖進(jìn)行展示。

2.5 靶基因的KEGG分析 利用KEGG數(shù)據(jù)庫對(duì)預(yù)測(cè)得到的靶基因進(jìn)行Pathway分析，可以找到富集靶基因的Pathway 條目，在差異miRNA靶基因的 KEGG映射中，對(duì)在前20位的條目利用條形圖進(jìn)行展示(圖4)?？梢园l(fā)現(xiàn)這些靶基因主要在Primary immunodeficiency信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路及TNF信號(hào)通路中起重要作用。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用Agilent Human miRNA Microarray芯片，檢測(cè)病灶邊緣帶組織與臨近病灶的正常肝組織及AE患者和健康體檢者血漿中的miRNA，在2549個(gè)檢測(cè)miRNA中，有6個(gè)差異性的miRNA，分別為hsa-miR-136-5p、hsa-miR-4698、hsa-miR-4644、hsa-miR-4306、hsa-miR-483-3p、hsa-miR-1237-3p。文獻(xiàn)[24]研究表明miRNA與疾病的發(fā)生有關(guān)，比如hsa-miRNA-1237-3p表達(dá)降低與脊索瘤患者生存不良相關(guān)。hsa-miRNA-33b-3p在關(guān)節(jié)炎患者血清中可調(diào)節(jié)代謝過程，可作為評(píng)估關(guān)節(jié)炎風(fēng)險(xiǎn)及進(jìn)展的潛在生物標(biāo)志物[25]。有研究[26]表明，當(dāng)肝癌細(xì)胞在低糖環(huán)境中生長(zhǎng)時(shí)，miRNA-483-3p低表達(dá)，使細(xì)胞凋亡，而當(dāng)細(xì)胞在高糖環(huán)境中生長(zhǎng)時(shí)，miRNA-483-3p水平升高，降低了凋亡率。這表明，根據(jù)葡萄糖的濃度，miRNA-145-5p對(duì)miRNA-483-3p有雙重作用，抑制或刺激。這提示可能存在一種在野生型TP53肝癌細(xì)胞中抵抗細(xì)胞凋亡的新機(jī)制，并提示miRNA-145-5p和miRNA-483-3p可能在肝細(xì)胞癌中作為藥物靶點(diǎn)[27]。而hsa-miRNA-4306是HPV陰性早期頭頸鱗狀細(xì)胞癌患者疾病復(fù)發(fā)和生存的重要標(biāo)記[28]。前期研究可以看出本次芯片實(shí)驗(yàn)篩選出來6個(gè)差異miRNA與人的多種類型的疾病存在密切的相關(guān)性，本研究通過青海區(qū)域內(nèi)人感染AE后的差異miRNA情況，hsa-miRNA-33b-3p、hsa-miRNA-483-3p、hsa-miRNA-4306在AE的病灶邊緣帶這種顯著差異性表達(dá)的現(xiàn)象，預(yù)示著這些miRNA可能在AE中起到非常重要的作用。

注：按照P值排序，對(duì)前20位的條目(若總條目不大于20，則全部展示)利用條形圖進(jìn)行展示。

循環(huán)miRNA是一類在血清、血漿等體液中穩(wěn)定存在的分子，循環(huán)miRNA涉及到細(xì)胞與細(xì)胞之間的信息傳遞，主要作用是靶向調(diào)控靶基因[29-30]；無細(xì)胞循環(huán)miRNA通常存在于核糖核蛋白復(fù)合物或高密度脂蛋白中，或從脂質(zhì)體、微泡、外泌體或凋亡體中釋放出來，因此，循環(huán)的miRNA可以反映機(jī)體的穩(wěn)態(tài)反應(yīng)以及疾病進(jìn)展的跡象。由于其穩(wěn)定性和對(duì)內(nèi)源性RNase活性的抗性，循環(huán)miRNA被認(rèn)為是診斷和判斷治療效果的生物標(biāo)志物，在癌癥、糖尿病和神經(jīng)紊亂等領(lǐng)域具有臨床應(yīng)用的前景[31-33]。目前關(guān)于AE相關(guān)的循環(huán)miRNA的研究還比較少，本研究旨在找到一個(gè)與AE相關(guān)的miRNA作為診斷標(biāo)志物，因此在進(jìn)行了AE組織miRNA的熒光定量驗(yàn)證后，對(duì)于差異的hsa-miRNA-483-3p進(jìn)行了血漿中的表達(dá)檢測(cè)，結(jié)果顯示,hsa-miRNA-483-3p在血漿與組織中顯著性上調(diào)表達(dá)，這表明hsa-miRNA-483-3p可能是AE前期診斷的一個(gè)潛在的標(biāo)志分子。

據(jù)報(bào)道[34-37]，hsa-miRNA-483-3p 在傷口愈合和癌癥進(jìn)程中受到調(diào)節(jié)，其也是2型糖尿病患者內(nèi)皮完整性的重要調(diào)節(jié)因子，是2型糖尿病患者修復(fù)內(nèi)皮再生的潛在治療靶點(diǎn)[38]。同時(shí)也在糖尿病相關(guān)的心臟病中起到負(fù)調(diào)控的作用[39]。綜上研究表明，hsa-miRNA-483-3p是一個(gè)病程響應(yīng)分子，在調(diào)控疾病進(jìn)程中扮演著一定的角色。

有研究[40]發(fā)現(xiàn)多房棘球絳蟲感染小鼠之后，高通量測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)差異miRNA的靶基因同一些與宿主的免疫反應(yīng)有關(guān)。同樣地，本研究用TargetScan、PITA、microRNAorg數(shù)據(jù)庫對(duì)差異miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，3個(gè)靶基因預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫中差異miRNA共同擁有137個(gè),hsa-miRNA-1237-3p、hsa-miRNA-483-3p、hsa-miRNA-4306、hsa-miRNA-33b-3p在不同的miRNA靶基因預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫中分別預(yù)測(cè)到不同數(shù)量的靶基因，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AE差異性表達(dá)的3個(gè)miRNA(miR-1237-3p、hsa-miRNA-4306、hsa-miRNA-483-3p)的靶基因均與人體免疫反應(yīng)以及AE有關(guān)，例如hsa-miRNA-4306預(yù)測(cè)與AE相關(guān)的靶基因?yàn)镃D40LG(IMG)、TAP2。CD40LG是腫瘤壞死因子配體家族中的一員，主要表達(dá)于已激活的T淋巴細(xì)胞上，它與B淋巴細(xì)胞上CD40相互作用，促進(jìn)B淋巴細(xì)胞增生和存活、免疫球蛋白類型轉(zhuǎn)換及生發(fā)中心反應(yīng)。CD40/CD40LG在誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞增生分化、產(chǎn)生自身抗體中起關(guān)鍵作用。肺泡棘球蚴病患者IgG、IgA和IgM的平均水平及囊性棘球蚴病患者IgG和IgM的平均水平均明顯高于正常對(duì)照組,而TAP2基因的多態(tài)性在囊性棘球蚴病具有一定的關(guān)系[41]。hsa-miRNA-1237-3p的靶基因 IL-17A、IL-5，囊性棘球蚴病感染后通過增強(qiáng)IL-10和下調(diào)IL-5、IL-17A，顯著減輕卵白蛋白誘導(dǎo)的氣道炎癥的嚴(yán)重程度[42]。hsa-miRNA-483-3p的靶基因?yàn)閘amin B受體，lamin B受體是一種核膜的多跨膜蛋白，常被用作核膜動(dòng)力學(xué)的“報(bào)告者”，有研究[43]表明其表達(dá)與原發(fā)性膽汁性肝硬化有關(guān)。

差異miRNA的靶基因GO分析中可以看出，差異基因在生物學(xué)過程涉及到細(xì)胞免疫反應(yīng)(T淋巴細(xì)胞的增值)等生物學(xué)功能，這可能與多房棘球絳蟲感染后激發(fā)患者體內(nèi)的免疫系統(tǒng)有關(guān)；在差異miRNA靶基因的 KEGG分析可以看到，這些靶基因在Primary immunodeficiency信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路及TNF信號(hào)通路中起重要作用，這些與AE相關(guān)的信號(hào)通路的發(fā)現(xiàn)，將會(huì)對(duì)后期AE的預(yù)防治療具有提示的意義。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會(huì)成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn):任賓、任利負(fù)責(zé)確診病例的收集，RNA的提取和文章的撰寫；樊海寧、王海久負(fù)責(zé)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和文章的修改。