Bcl-2 和LC3 對(duì)膀胱癌發(fā)生發(fā)展及預(yù)后的相關(guān)性分析

周萬(wàn)里 張建平▲ 潘永昇 徐衛(wèi)東

1.南通大學(xué)附屬海安醫(yī)院泌尿外科，江蘇南通 226600；2.江蘇省南通市第一人民醫(yī)院泌尿外科，江蘇南通 226300

膀胱癌發(fā)病率在世界范圍內(nèi)居惡性腫瘤第九位，死亡率排名第十三位，為泌尿系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤[1]，且其發(fā)病率呈上升趨勢(shì)[2]，其中最常見(jiàn)的為膀胱尿路上皮癌[3-4]。非肌層浸潤(rùn)性尿路上皮癌患者多采用經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)（TURBT），而晚期患者則需輔助全身放化療[5-6]。研究膀胱癌的發(fā)病機(jī)制是國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的重要課題[6]。細(xì)胞的凋亡與惡性增殖參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[7]，其中Bcl-2 發(fā)揮抗凋亡作用，參與細(xì)胞癌變[8]。細(xì)胞自噬與細(xì)胞的癌變密切相關(guān)[9]。LC3 是自噬相關(guān)基因，參與自噬的調(diào)控[10-11]。本課題通過(guò)核酸干擾技術(shù)下調(diào)膀胱尿路上皮癌中Bcl-2 的表達(dá)，并研究細(xì)胞中LC3 表達(dá)及其對(duì)膀胱腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，分析其與臨床病理的相關(guān)性，從而探討B(tài)cl-2 與LC3 的表達(dá)與膀胱癌臨床病理和預(yù)后的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 試劑

真核細(xì)胞表達(dá)載體pGenesil-1 購(gòu)自上海生工，大腸桿菌DH5α 和人膀胱癌細(xì)胞株T24 為本實(shí)驗(yàn)室保存，高糖DMEM 培養(yǎng)基（貨號(hào)：12800082）購(gòu)自Gibco公司；RNA 抽提試劑盒購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司（貨號(hào)：SK1322）；MTT 購(gòu)自Sigma（貨號(hào)：M5655-1G）；DMSO 購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司（貨號(hào)：DN3039A）；Lipofectamine2000 購(gòu)自Invitrogen（貨號(hào)：11668-027）；LC3 和Bcl-2 兔抗人抗體購(gòu)自Abcam（貨號(hào)：ab192890、ab32124）；SP 免疫組化試劑盒（貨號(hào)：SP0041）購(gòu)自福州邁新公司。

1.2 體外實(shí)驗(yàn)

1.2.1 在膀胱尿路上皮癌細(xì)胞 （T24） 中轉(zhuǎn)染siRNA在高糖DMEM 培養(yǎng)基中于37℃、5%二氧化碳條件下培養(yǎng)T24 細(xì)胞，以5×105個(gè)/孔的密度接種在6 孔板中，使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，Lipofectamine2000 與重組質(zhì)粒的比例為5∶1。對(duì)照組為空質(zhì)粒和NC 質(zhì)粒。

1.2.2 RT-PCR 檢測(cè)Bcl-2 和LC3 mRNA 表達(dá) 收集細(xì)胞，Trizol 法提取RNA，分光光度計(jì)檢測(cè)純度，80 V恒壓下電泳進(jìn)行完整性檢測(cè)。RNA 樣品經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA 第1 鏈，然后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，β-actin 作為內(nèi)參。擴(kuò)增條件：50 μL 反應(yīng)體系，cDNA 2 μL，10×PCR buffer 5 μL，dNTP mix 4 μL，二價(jià)鎂離子（50 mmol/L）1.5 μL，上游引物（20 μmol/L）1 μL，下游引物（20 μmol/L）1 μL，Taq 酶0.5 μL，加DEPC 水至50 μL。反應(yīng)條件：95℃5 min；95℃30 s，55℃30 s，72℃30 s，這部分重復(fù)30 個(gè)循環(huán)；72℃5 min。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR 產(chǎn)物，圖像使用Quantity One 軟件（Bio-Rad）進(jìn)行定量分析。

1.2.3 Western blot 檢測(cè)Bcl-2 和LC3 蛋白表達(dá) 收取細(xì)胞，PBS 洗滌2 次，加入裂解液，冰上孵育20 min，4℃條件，13 000 r/min 離心10 min，收集上清。使用BCA 試劑盒進(jìn)行蛋白定量，取10μg 蛋白進(jìn)行SDS-PAGE。使用濕轉(zhuǎn)電轉(zhuǎn)膜儀（BIO-RAD）100 V 恒壓60 min 條件下將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)到NC 膜。使用含5%脫脂奶粉的TBST 室溫封閉1 h，TBST 洗滌。Bcl-2 單抗（或LC3 單抗）4℃孵育過(guò)夜，TBST 洗滌。使用HRP 二抗室溫孵育1 h，TBST 洗滌后加入ECL 試劑，使用GE 成像系統(tǒng)拍攝，使用Quantity One 軟件進(jìn)行定量分析。

1.2.4 細(xì)胞生長(zhǎng)活力檢測(cè) 將轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒的T24 細(xì)胞接種到96 孔板中，設(shè)置PBS 空白對(duì)照組。加入MTT溶液后培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)基，加入DMSO，室溫振蕩10 min，測(cè)定570 nm 處的吸光度，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 采用Annexin-V 與PI 雙染法流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后的T24 細(xì)胞細(xì)胞凋亡。胰蛋白酶消化細(xì)胞后，分別加入Annexin-V 和PI，進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)定量檢測(cè)。

1.3 在人體組織中研究Bcl-2 與LC3 的表達(dá)

1.3.1 組織樣本 收集2017 年1 月—2020 年5 月在南通大學(xué)附屬海安醫(yī)院泌尿外科進(jìn)行經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切手術(shù)及膀胱鏡活檢的部分標(biāo)本65 例，其中正常膀胱組織10 例，膀胱尿路上皮癌55 例，所有研究對(duì)象術(shù)前均未接受任何輔助治療。55 例膀胱癌標(biāo)本中，男48 例，女7 例；年齡28～88 歲，中位年齡67 歲；按國(guó)際抗癌聯(lián)盟（UICC）的2002 年TNM 分期標(biāo)準(zhǔn)：Ta期26 例，T1期9 例，T2期14 例，T3期2 例，T4期4 例；42 例不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，13 例伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。入組患者均簽署知情同意書(shū)，本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.3.2 石蠟固定 切取4 mm×4 mm×4 mm 的標(biāo)本，以10%甲醛進(jìn)行固定，然后石蠟包埋，進(jìn)行41 μm 厚度連續(xù)切片并將其裱于APES 打底玻片。

1.3.3 免疫組化染色 采用免疫組化（SP 法），將組織芯片進(jìn)行常規(guī)脫蠟至水，以及微波抗原修復(fù)，然后滴加過(guò)氧化物酶阻斷液，37℃下孵育10 min，加入非免疫動(dòng)物血清，37℃下孵育l0 min，加入一抗工作液，37℃孵育1 h，加入生物素標(biāo)記的二抗，37℃下孵育10 min，然后DAB 顯色10 min，進(jìn)行蘇木精復(fù)染，脫水透明后，進(jìn)行中性樹(shù)膠封固。陰性對(duì)照中以PBS 代替一抗。

1.3.4 結(jié)果判斷 Bcl-2 和LC3 蛋白的染色信號(hào)主要位于細(xì)胞質(zhì)中。由兩名病理醫(yī)師閱片，隨機(jī)選取每張切片的5 個(gè)視野（40×），各對(duì)100 個(gè)細(xì)胞進(jìn)行鏡檢，然后進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞百分率和細(xì)胞染色強(qiáng)度評(píng)估，陽(yáng)性細(xì)胞百分率4 個(gè)等級(jí)。0 分：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞；1 分：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜20%；2 分：陽(yáng)性細(xì)胞為20%～75%；3 分：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＞75%。染色度4 個(gè)等級(jí)：0 分為無(wú)染色，1 分為淡黃色，2 分為黃色，3 分為棕黃至棕褐色?？偡e分為二者分值的乘積：0 分（-），l～3 分（-/+），4～6 分（+），7～9 分（+++）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0 軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用t 檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分比表示，采用χ2檢驗(yàn)。以P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體外實(shí)驗(yàn)

2.1.1 Bcl-2 和LC3 mRNA 的表達(dá)情況 轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pGenesil-1 Bcl-2 siRNA 之后，Bcl-2 mRNA 表達(dá)量及LC3 mRNA 的表達(dá)發(fā)生了下調(diào)。見(jiàn)圖1。

2.1.2 Bcl-2 和LC3 蛋白表達(dá)的變化 轉(zhuǎn)染pGenesil-1 Bcl-2 siRNA 重組質(zhì)粒后，Bcl-2、LC3 蛋白表達(dá)下調(diào)。pGenesil-1 Bcl-2 siRNA 組Bcl-2 和LC3 蛋白表達(dá)低于NC 組及空質(zhì)粒組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 Bcl-2 和LC3 蛋白表達(dá)的變化

2.1.3 T24 轉(zhuǎn)染Bcl-2 siRNA 后細(xì)胞生物學(xué)行為的變化 pGenesil-1 Bcl-2 siRNA 組細(xì)胞活力[（66.8±5.8）%]低于空質(zhì)粒組[（94.2±2.1）%]及NC 組[（92.4±1.9）%]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=15.62，P=0.016）。pGenesil-1 Bcl-2 siRNA 組細(xì)胞凋亡率（56.68%）高于空質(zhì)粒組（5.88%）和NC 組（5.03%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。

2.2 人體組織中Bcl-2 與LC3 的表達(dá)意義

2.2.1 免疫組化檢測(cè)癌與癌旁組織中Bcl-2 與LC3的表達(dá) Bcl-2 和LC3 蛋白的陽(yáng)性表達(dá)（箭頭所指）主要定位在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，偶有胞核染色，為淡黃色或棕褐色。見(jiàn)圖3。正常膀胱組織和膀胱癌中LC3 表達(dá)的陽(yáng)性率分別為27.27%（3/11） 和69.09%（38/55），表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.81，P ＜0.05）。Bcl-2 蛋白在正常膀胱組織及膀胱尿路上皮癌中的表達(dá)的陽(yáng)性率（18.18%、60.00%）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.43，P ＜0.05）。

圖3 Bcl-2 和LC3 在膀胱尿路上皮癌中的陽(yáng)性表達(dá)（40×）

2.2.2 癌組織中Bcl-2 與LC3 的表達(dá)與臨床預(yù)后及病理參數(shù)的關(guān)系 不同分級(jí)、分期的膀胱尿路上皮癌樣本中LC3 蛋白的表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的膀胱尿路上皮癌樣本中Bcl-2 蛋白的表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見(jiàn)表1。

3 討論

細(xì)胞自噬是一個(gè)經(jīng)過(guò)嚴(yán)格控制的降解細(xì)胞內(nèi)生物大分子和內(nèi)源性底物的生理過(guò)程[12-14]。自噬有助于腫瘤細(xì)胞在惡劣條件下的生存，而自噬的過(guò)度又會(huì)引起自噬性死亡[15]，從而抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[16-17]，自噬與腫瘤的關(guān)系可能是雙重的[18]。研究顯示，抗凋亡蛋白Bcl-2 和Bcl-xL 與自噬蛋白前體結(jié)合[19]，LC3 是自噬的標(biāo)志，在囊泡成核過(guò)程中有助于自噬囊泡的形成[20-22]。

表1 膀胱癌組織中LC3 與Bcl-2 的表達(dá)與臨床預(yù)后及病理參數(shù)的相關(guān)性（例）

Bcl-2 基因是細(xì)胞凋亡的重要抑制基因[23-25]。本研究結(jié)果也證實(shí)Bcl-2 蛋白在膀胱尿路上皮癌中抗凋亡作用。Bcl-2 能預(yù)測(cè)膀胱癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況。LC3 蛋白在膀胱尿路上皮癌組織中表達(dá)升高，提示膀胱癌中自噬活性升高[26]，且LC3 的表達(dá)水平隨著膀胱尿路上皮癌分級(jí)和分期的提高而提高。因此Bcl-2 和LC3 的表達(dá)在調(diào)控膀胱癌起協(xié)調(diào)作用，這一作用機(jī)制可能為Bcl-2 作用于自噬蛋白前體結(jié)合調(diào)控LC3 的表達(dá)。因此兩者結(jié)合能判斷膀胱癌的預(yù)后。

本研究對(duì)Bcl-2 作用于LC3 的具體作用機(jī)制沒(méi)有深入了解，且BCL-2 和LC3 在組織樣本驗(yàn)證的例數(shù)偏少，期待以后大樣本及長(zhǎng)時(shí)間隨訪來(lái)綜合判斷膀胱癌患者生存及預(yù)后的情況。