基于熒光定量PCR 技術(shù)分析滇池沉積物產(chǎn)甲烷菌空間分布特征*

陳 悅 ，羅明沒(méi)，李尚磷，李春艷，冉玉芳，李 瑋 ，胡 斌

(1.云南大學(xué) 生態(tài)與環(huán)境學(xué)院，高原湖泊生態(tài)與治理研究院，云南 昆明 650091；2.云南省高原山地生態(tài)與退化環(huán)境修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650091)

甲烷是重要的溫室氣體，對(duì)全球變暖有重要的作用，其變暖潛力是CO2的25 倍，同時(shí)會(huì)導(dǎo)致平流層臭氧層破壞加劇[1-2]。自工業(yè)革命以來(lái)，大氣中的甲烷濃度已經(jīng)增加了1 倍，并且在持續(xù)增加。許多生態(tài)系統(tǒng)中都有甲烷排放，如泥炭地[3-5]、垃圾填埋場(chǎng)[6]、水稻土[7-8]、湖泊沉積物[9]和內(nèi)陸湖泊[10-11]等。凈甲烷產(chǎn)生通常來(lái)自于沉積物以及底部水體中，沉積物中大部分甲烷排放可能是由于產(chǎn)甲烷菌利用H2產(chǎn)生，即利用H2/CO2的氫營(yíng)養(yǎng)型途徑[12-13]。產(chǎn)甲烷菌在甲烷的循環(huán)中起主導(dǎo)作用，是唯一已知主要利用H2/CO2、甲酸鹽和乙酸作為底物、并將其分解代謝得到甲烷的生物[14-15]。產(chǎn)甲烷菌的所有底物代謝途徑都是為了使初級(jí)底物轉(zhuǎn)化為甲基或甲基化化合物，接著將甲基轉(zhuǎn)移至輔酶M，形成中間甲基輔酶M (甲基-COM)，然后由產(chǎn)甲烷古菌中特有的關(guān)鍵酶?甲基輔酶M 還原酶(methyl-coenzyme M reductase，MCR)催化產(chǎn)甲烷最終步驟[16-18]。產(chǎn)甲烷古菌跨越了廣古菌門7 個(gè)目[19]，即甲烷桿菌目(Methanobacteriales)、甲烷球菌目(Methanococcales)、甲烷微菌目(Methanomicrobiales)、甲烷八疊球菌目(Methanosarcinales)、甲烷火菌目(Methanopyrales)、甲烷胞菌目(Methanocellales)和馬賽球菌目 (Methanomassiliicoccales)[20]。這些目都含有種類繁多的類群，它們?cè)谛螒B(tài)和生理特征上有很大的差異，所需底物不同，生存環(huán)境各異，但都含有催化產(chǎn)甲烷最終步驟的特征酶?MCR，且都具有厭氧產(chǎn)甲烷的功能[17,21-22]。因此在鑒定產(chǎn)甲烷菌的過(guò)程中，利用mcrA基因進(jìn)行PCR 檢測(cè)是穩(wěn)定且有效的方法[23]。

滇池是中國(guó)西南云貴高原的40 個(gè)湖泊之一，也是第六大淡水湖，位于亞熱帶或溫帶氣候區(qū)，在為鄰近的城市和農(nóng)村地區(qū)提供淡水資源和發(fā)展水產(chǎn)養(yǎng)殖方面發(fā)揮著非常重要的作用，具有很高的生態(tài)經(jīng)濟(jì)價(jià)值；隨著人口增長(zhǎng)對(duì)清潔水的需求日益增長(zhǎng)，其水質(zhì)變化越來(lái)越受到政府及公眾的關(guān)注[24]。滇池作為高原湖泊，與其他湖泊相對(duì)隔離，極易富營(yíng)養(yǎng)化[25]。由于地處城市邊緣，人口密集，工業(yè)和生活污水未經(jīng)處理就向滇池及其支流排放，有機(jī)碳、氮磷負(fù)荷大，富營(yíng)養(yǎng)化已成為滇池最大的威脅，是制約周邊城市經(jīng)濟(jì)發(fā)展的首要問(wèn)題[26]。在全球變暖的背景下，湖泊富營(yíng)養(yǎng)化程度會(huì)影響湖泊碳平衡，嚴(yán)重富營(yíng)養(yǎng)化可能還會(huì)加劇湖泊CH4排放[27]。湖泊沉積物是富營(yíng)養(yǎng)化水體大量營(yíng)養(yǎng)素的來(lái)源及其儲(chǔ)存空間，且厭氧產(chǎn)甲烷主要來(lái)源于湖泊沉積物中的厭氧產(chǎn)甲烷菌，因此，研究沉積物產(chǎn)甲烷菌對(duì)于富營(yíng)養(yǎng)化湖泊碳循環(huán)研究具有重要的理論指導(dǎo)意義。微生物群落豐度與樣地的物理化學(xué)性質(zhì)和甲烷產(chǎn)量顯著相關(guān)，而湖泊營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)、沉積物基質(zhì)的物理和化學(xué)特性，如土壤水分、溫度、海拔、pH 和鹽度等對(duì)產(chǎn)甲烷菌群落豐度有影響[28-33]。研究表明：滇池的產(chǎn)甲烷潛力變化以及甲烷菌的豐度和群落結(jié)構(gòu)與沉積物層深度相關(guān)[34]，但對(duì)產(chǎn)甲烷菌空間水平的分布特征缺乏探討。本研究以滇池沉積物為對(duì)象，采用熒光定量PCR 方法研究產(chǎn)甲烷菌豐度及分布特征，以期為高原富營(yíng)養(yǎng)化湖泊生物甲烷排放潛力估算提供一定的理論指導(dǎo)作用。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

滇池位于云南省昆明市區(qū)，沿湖全長(zhǎng)308.6 km，平均水深5.03 m，最大水深11.35 m。水溫變化范圍為9.8～24.5 ℃，年平均水溫16 ℃[35]。隨著城市化進(jìn)程，大量的生活與工業(yè)污水排放逐年增加，導(dǎo)致滇池成為典型的高原富營(yíng)養(yǎng)化湖泊。滇池分為草海與外海兩部分，其污染程度各不相同，草海富營(yíng)養(yǎng)化程度明顯高于外海[26]。本研究在滇池草海和外海選取存在明顯環(huán)境差異的4 個(gè)代表性區(qū)域采樣，分別為A1：草海，滇池北部排污密集區(qū)；A2：外海北，水華嚴(yán)重區(qū)；A3：外海中，農(nóng)業(yè)污染排放密集區(qū)；A4：外海南，靠近磷礦和鉀肥廠區(qū)，磷鉀污染排放密集區(qū)(圖1)。

圖1 滇池采樣點(diǎn)(A1～A4)分布Fig.1 The distribution of sampling sites (A1-A4)in Dianchi Lake

1.2 樣品采集與保存

分別在采樣點(diǎn)A1～A4 用沉積物采樣器采集深度0～10 cm 的沉積物底泥，每個(gè)樣點(diǎn)4 個(gè)重復(fù)，共16 個(gè)樣品。采集后立即將沉積物轉(zhuǎn)移至厭氧瓶中，用硅膠塞塞住，迅速轉(zhuǎn)移至4 ℃便攜式恒溫箱中。帶回實(shí)驗(yàn)室后立即存放于?20 ℃冰箱，用于后續(xù)熒光定量PCR 分析。

1.3 產(chǎn)甲烷菌豐度檢測(cè)

用Omega 試劑盒提取16 個(gè)沉積物樣品中的DNA，然后通過(guò)1%凝膠電泳來(lái)檢測(cè)提取效果后放于?20 ℃冰箱中保存，以備后續(xù)使用。以提取沉積物中的總DNA 為模板，利用mcrA基因特異性引物進(jìn)行PCR，同時(shí)設(shè)置陰性空白對(duì)照(CK，不加DNA 模板)。擴(kuò)增體系為25 μL：Master Mix 12.5 μL，DNA 1 μL，10 μmol/L 引物F 1 μL，10 μmol/L 引物R 1 μL，ddH2O 9.5 μL。擴(kuò)增引物和程序[36]見(jiàn)表1。

擴(kuò)增完成后采用天根 DP219 試劑盒進(jìn)行目的片段回收純化。純化PCR 產(chǎn)物與pGM-T Fast Vector載體連接，取部分連接產(chǎn)物加至50～100 μL DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。在預(yù)先制備預(yù)熱的含有氨芐青霉素終質(zhì)量濃度為100 μg/mL 的LB 瓊脂糖平板進(jìn)行涂布培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，直至可觀察到菌落。

將得到的白色菌落接種至1～5 mL LB (含有終質(zhì)量濃度為50～100 μg/mL 的氨芐青霉素)培養(yǎng)基，37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，保存菌種后提取質(zhì)粒(采用TIANprep Mini Plasmid Kit 質(zhì)粒小提試劑盒提取)。以原有的引物對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，初步驗(yàn)證陽(yáng)性克隆。菌液PCR 擴(kuò)增后，有目的條帶的樣品送至生工生物工程(上海)股份有限公司，通過(guò)一代測(cè)序的方法驗(yàn)證確認(rèn)陽(yáng)性，陽(yáng)性克隆菌液測(cè)序結(jié)果在GenBank 上利用BLAST 進(jìn)行序列的同源性分析。用Nandrop 2000 測(cè)定提取的質(zhì)粒質(zhì)量濃度后，將質(zhì)粒質(zhì)量濃度進(jìn)行10 倍梯度稀釋，然后在羅氏LC96 儀器進(jìn)行熒光定量PCR 擴(kuò)增，建立熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。

在獲得穩(wěn)定和可信度高的標(biāo)準(zhǔn)曲線后，為確定熒光定量PCR 擴(kuò)增的特異性情況，以標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照，以無(wú)菌蒸餾水為陰性對(duì)照(CK)，對(duì)16 個(gè)樣品DNA 的熒光定量PCR 的擴(kuò)增曲線及熔解曲線進(jìn)行特異性評(píng)價(jià)。最終將待測(cè)樣品和標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒同時(shí)擴(kuò)增，根據(jù)建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品產(chǎn)甲烷菌的拷貝數(shù)，并對(duì)熒光定量結(jié)果進(jìn)行分析，揭示滇池的產(chǎn)甲烷菌豐度及分布特征。熒光定量PCR 擴(kuò)增體系為20 μL：2×SybrGreen qPCR Master Mix 10 μL，DNA 0.5 μL，10 μmol/L 引物F 0.5 μL，10 μmol/L 引物R 0.5 μL，ddH2O 8.5 μL，擴(kuò)增引物和程序[36]見(jiàn)表1。

表1 引物序列與擴(kuò)增程序Tab.1 Primer sequence and amplification program

1.4 數(shù)據(jù)分析

(1)絕對(duì)熒光定量分析完成后，用Light Cycler? 96 SW 1.1 軟件分析數(shù)據(jù)。

(2)按照以下公式計(jì)算mcrA基因的拷貝數(shù)和土樣中產(chǎn)甲烷菌的拷貝數(shù)：

標(biāo)準(zhǔn)樣品質(zhì)粒的mcrA基因的拷貝數(shù)(copies/μL)=(6.02×1023)×(質(zhì)粒質(zhì)量濃度×10?9)/[(T 載體長(zhǎng)度+mcrA基因長(zhǎng)度)×660]；

土樣中產(chǎn)甲烷菌的拷貝數(shù)(copies/g)=(樣品中DNA 的拷貝數(shù)×總DNA 稀釋倍數(shù)×總DNA 體積)/土壤質(zhì)量。

式中，質(zhì)粒質(zhì)量濃度單位為ng/μL；T 載體長(zhǎng)度為3 031 bp，來(lái)自天根 DP219 試劑盒的pGM-T Fast Vector 載體；因本試驗(yàn)的目的條帶接近500 bp，故計(jì)算時(shí)mcrA基因長(zhǎng)度取標(biāo)準(zhǔn)范圍464～491 bp中的491 bp；樣品中DNA 的拷貝數(shù)單位為copies/μL；總DNA 體積單位為 μL；土壤質(zhì)量根據(jù)Omega 試劑盒說(shuō)明書稱取0.3 g。

(3)用Excel 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理，計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。采用SPSS 進(jìn)行單因素方差分析，比較不同采樣區(qū)域間沉積物產(chǎn)甲烷菌豐度的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的片段擴(kuò)增

以樣品總DNA 為模板，運(yùn)用mcrA基因引物PCR 擴(kuò)增的條帶接近500 bp (圖2)，產(chǎn)甲烷菌目的條帶位于464～491 bp，基本吻合?？沙醪脚卸ǎ涸囼?yàn)條件滿足擴(kuò)增產(chǎn)甲烷菌特異性片段的要求。

圖2 沉積物mcrA 基因PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR amplification results of sediment mcrA gene

2.2 重組質(zhì)粒擴(kuò)增、測(cè)序

將目的片段擴(kuò)增后的目標(biāo)條帶回收，連接轉(zhuǎn)化涂布出的菌液提取質(zhì)粒后，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增的目標(biāo)條帶清晰明亮，接近500 bp (圖3)，初步證明目的基因成功克隆。陽(yáng)性克隆菌液測(cè)序結(jié)果在GenBank 上利用BLAST 進(jìn)行序列的同源性分析，結(jié)果表明：產(chǎn)甲烷菌mcrA基因的陽(yáng)性克隆序列與GenBank 上的已知產(chǎn)甲烷菌的菌種相似性為97%。

2.3 熒光定量PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線及可信度分析

測(cè)定的質(zhì)粒質(zhì)量濃度為25.6 ng/μL。將標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒進(jìn)行10 倍梯度稀釋后，選取5 個(gè)稀釋梯度的稀釋質(zhì)粒作為模板進(jìn)行熒光定量PCR 反應(yīng)。標(biāo)準(zhǔn)曲線(表2、圖4) 顯示：每個(gè)稀釋梯度點(diǎn)的3 個(gè)重復(fù)變化不大，變異系數(shù)很小，說(shuō)明標(biāo)準(zhǔn)曲線具有一致的重復(fù)反應(yīng)、高的線性(R2=1)、高的擴(kuò)增率(E=92%) 以及斜率(S=?3.525 0)，是合格的標(biāo)準(zhǔn)曲線，滿足絕對(duì)定量的要求，具有很高的可信度與良好的重復(fù)性。

圖3 重組質(zhì)粒的mcrA 基因PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 PCR amplification results of recombinant plasmid mcrA gene

表2 不同稀釋倍數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒real-time PCR 檢測(cè)精度Tab.2 Precision of standard plasmids of different dilution times detected by real-time PCR

圖4 熒光標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Fluorescence standard curve

2.4 特異性擴(kuò)增評(píng)價(jià)

由圖5 可知：標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒與滇池沉積物土壤DNA 均呈S 型擴(kuò)增曲線，顯示陽(yáng)性。標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA 濃度從6.07×104至6.07×108copies/μL 范圍內(nèi)擴(kuò)增曲線的線形均很好。從整體上看，重復(fù)性都很高。由熔解曲線(圖6)可見(jiàn)：目的產(chǎn)物熔解溫度為90～92 ℃，A1-1 和A2-3 引物二聚體熔解溫度為76～78 ℃。陰性對(duì)照無(wú)檢出目的產(chǎn)物峰值，說(shuō)明擴(kuò)增體系無(wú)污染。目的基因峰值接近，擴(kuò)增產(chǎn)物基本一致，除A1-1 和A2-3 外，基本上無(wú)非特異性峰的出現(xiàn)。

2.5 熒光定量PCR 結(jié)果

由于拷貝數(shù)對(duì)數(shù)與Ct值呈線性關(guān)系，線性方程為y=?3.525 0x?37.24 (R2=1，x為拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值，y為Ct值)，所以Ct值越大，拷貝數(shù)越小。由表3 可知：樣品的Ct值范圍在17.753～31.823之間，產(chǎn)甲烷菌DNA 拷貝數(shù)范圍在3.07×103～1.04×109copies/g 之間?？傮w來(lái)說(shuō)，A2 (外海北部)樣品中Ct值普遍較大，所以DNA 拷貝數(shù)值很低；A3 (外海中) 樣品則反之，Ct值整體都較小，所以DNA 拷貝數(shù)較高。Ct值的變化趨勢(shì)為A2＞A1＞A4＞A3，拷貝數(shù)反之為A3＞A4＞A1＞A2，即沉積物產(chǎn)甲烷菌豐度表現(xiàn)為：外海中＞外海南＞草海＞外海北。此外，產(chǎn)甲烷菌的拷貝數(shù)在各個(gè)采樣區(qū)域差異顯著(F=10.300 6，P=0.001 2＜0.05)，相同采樣點(diǎn)4 個(gè)重復(fù)之間產(chǎn)甲烷菌拷貝數(shù)差異比較大，說(shuō)明空間異質(zhì)性很大，且A3 (外海中)和A4 (外海南部)與A1 (草海)和A2 (外海北部)有顯著性差異(P＜0.05)。

圖5 擴(kuò)增曲線Fig.5 Amplification curve

圖6 熔解曲線Fig.6 Melting curve

3 討論

本研究通過(guò)運(yùn)用熒光定量PCR 技術(shù)成功擴(kuò)增出滇池沉積物中產(chǎn)甲烷菌的特異性條帶，并測(cè)定出產(chǎn)甲烷菌豐度結(jié)果為外海中＞外海南＞ 草海＞外海北，證實(shí)了高原淡水湖泊滇池中存在產(chǎn)甲烷菌，且產(chǎn)甲烷菌豐度在草海和外海4 個(gè)采樣區(qū)域有顯著差異性。BAI 等[35]研究表明：外海的沉積物細(xì)菌群落比草海更容易受到環(huán)境因素的影響，且樣本的空間區(qū)域位置是細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化的主要原因。本研究也發(fā)現(xiàn)：產(chǎn)甲烷豐度存在空間分布特征，可能是環(huán)境因素影響了其分布。外海中部接近農(nóng)業(yè)面源污染即氮磷負(fù)荷超標(biāo)的地區(qū)，微生物生長(zhǎng)旺盛，產(chǎn)甲烷菌含量最為豐富，而外海南接近磷、鉀礦排污富集區(qū)域，這2 個(gè)區(qū)域產(chǎn)甲烷菌含量豐度與草海富營(yíng)養(yǎng)嚴(yán)重區(qū)域有顯著差異。分析其原因主要有以下2 個(gè)方面。

表3 滇池沉積物樣品mcrA 基因的循環(huán)閾值(Ct)與基因拷貝數(shù)Tab.3 Cycle threshold (Ct) and copy number of mcrA gene in the sediments of Dianchi Lake

(1) 化學(xué)氮肥和有機(jī)氮肥聯(lián)合施用能夠改善土壤碳基質(zhì)和產(chǎn)甲烷菌的活性，提高產(chǎn)甲烷菌的mcrA的豐度，從而提高甲烷的產(chǎn)量及通量，平衡的碳氮比有利于甲烷的產(chǎn)生[37-38]，故可推斷農(nóng)田施肥灌溉污水中的氮素及礦廠工業(yè)廢水的磷、鉀等流入滇池，使產(chǎn)甲烷菌的生長(zhǎng)基質(zhì)發(fā)生變化，明顯促進(jìn)了產(chǎn)甲烷菌的生長(zhǎng)。

(2) 有機(jī)質(zhì)來(lái)源會(huì)影響產(chǎn)甲烷菌的豐度和活性。產(chǎn)甲烷菌利用溶解有機(jī)質(zhì)和固體有機(jī)質(zhì)的能力不同[39]，甚至溶解有機(jī)質(zhì)會(huì)抑制甲烷的產(chǎn)生[40]。本研究草海區(qū)域有機(jī)質(zhì)含量高于外海[41]，但產(chǎn)甲烷菌含量低于外海平均，且與外海南部和中部差異顯著。說(shuō)明外海有機(jī)質(zhì)來(lái)源可能更適合于產(chǎn)甲烷菌的生長(zhǎng)，特別是外海南部和中部。滇池水華密集區(qū)域，產(chǎn)甲烷菌的含量最低，可能是由于全球變暖的背景下，溫室氣體促進(jìn)有害藻類的光合作用和生長(zhǎng)繁殖，有害水華向周圍生物釋放有害的毒素，抑制了產(chǎn)甲烷菌的生長(zhǎng)[42]。

4 結(jié)論

本研究?jī)H是基于mcrA基因采用熒光定量PCR 的方法揭示產(chǎn)甲烷菌豐度的空間分布特征，主要結(jié)論為高原湖泊滇池沉積物存在較高產(chǎn)甲烷菌豐度，且產(chǎn)甲烷菌空間分布特征為外海中＞外海南＞草海＞外海北。有關(guān)面源污染對(duì)滇池產(chǎn)甲烷菌影響機(jī)制和水華富集區(qū)藻類如何影響產(chǎn)甲烷菌等問(wèn)題有待后續(xù)探討研究。