云南省不同地區(qū)煙草上TSWV NSs 氨基酸序列分析*

王景文 ，王偲博，陶宏征，高 雪，賈志強(qiáng)，王宇琪，李永忠，劉雅婷

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，云南 昆明 650201；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 煙草學(xué)院，云南 昆明 650201)

煙草產(chǎn)業(yè)是云南省的支柱產(chǎn)業(yè)[1]。近年來(lái)，煙草上斑萎病毒嚴(yán)重，主要癥狀有葉片褪綠、皺縮、壞死斑和植株萎蔫等，導(dǎo)致局部煙區(qū)產(chǎn)量損失在60%以上[2-4]。

正番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt orthotospovirus，TSWV) 屬于布尼亞病毒目(Bunyavirales)番茄斑萎病毒科(Tospoviridae)正番茄斑萎病毒屬(Orthotospovirus)[5]，是侵染煙草的惡性病毒之一[6]。2011 年正番茄斑萎病毒被列為世界十大植物病毒之一，僅次于煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)，位居世界第二[7]。TSWV 由三分體基因組結(jié)構(gòu)組成，從小到大分別為S RNA、M RNA 和L RNA[8]。S RNA 正鏈編碼非結(jié)構(gòu)蛋白(nonstructural protein of RNA S，NSs)，互補(bǔ)鏈編碼核殼體蛋白(nucleocapsid，NP)。其中NSs是TSWV 重要的致病因子[9]，既能夠協(xié)助病毒復(fù)制、轉(zhuǎn)錄，還可以通過(guò)結(jié)合siRNA 和dsRNA抑制宿主RNA 沉默、增強(qiáng)其病毒癥狀[10-12]。目前，針對(duì)TSWV NSs 研究較少，本研究通過(guò)RTPCR、克隆、轉(zhuǎn)化和測(cè)序技術(shù)，利用生物信息學(xué)軟件對(duì)課題組前期采集的云南不同地區(qū)感染TSWV 的煙草樣品與GenBank 公布的五大洲不同國(guó)家茄科作物上TSWV NSs 氨基酸序列進(jìn)行分析；并且對(duì)云南不同地區(qū)煙草TSWV NSs 氨基酸序列進(jìn)行選擇壓力分析，闡明來(lái)自不同地理分布的不同寄主上TSWV NSs 氨基酸序列間的遺傳差異，為今后TSWV NSs 相關(guān)致病機(jī)制研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究材料

材料來(lái)自課題組前期從云南省玉溪市、昭通市、昆明市、紅河州、曲靖市和楚雄州采集并且已經(jīng)通過(guò)鑒定確定感染TSWV 的8 份煙草樣品，采集到的煙草癥狀表現(xiàn)為葉片褪綠、局部壞死、葉片皺縮、壞死斑和植株萎蔫(圖1)。

圖1 感染TSWV 后的煙草癥狀Fig.1 Tobacco symptoms caused by TSWV

1.2 研究方法

1.2.1 RT-PCR 擴(kuò)增、克隆及測(cè)序

用TransZol TM Up 試劑盒 (全式金，北京)，根據(jù)說(shuō)明書(shū)分別提取云南不同地區(qū)8 個(gè)煙草樣品的總RNA。用PrimeScriptTMⅡ1st strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa，大連)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。運(yùn)用Primer 5.0 軟件，設(shè)計(jì)1 對(duì)TSWV 的S 全序列擴(kuò)增引物(F：5′-AGAGCAATTGTGTCATAATTTTATTC-3′；R：3′-AGAGCAATTGTGTCAATTTTATTC-5′)進(jìn)行S 序列PCR 擴(kuò)增。20 μL PCR 反應(yīng)體系：cDNA 1 μL，上下游引物各1 μL，PrimeSTAR Max DNA Polymerase (TaKaRa，大連) 10 μL，ddH2O 7 μL。PCR 反應(yīng)程序：98 ℃ 20 s；98 ℃ 10 s，50 ℃ 10 s，72 ℃ 3 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。PCR 反應(yīng)完成后，取5 μL產(chǎn)物進(jìn)行1.2% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將獲得的PCR 產(chǎn)物按照Bioteke 公司多功能DNA 純化回收試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行純化，采用Lethal Based Fast Cloning Kit (天根，北京)進(jìn)行克隆轉(zhuǎn)化后將陽(yáng)性菌液送往鉑尚生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2 生物信息學(xué)分析

將鉑尚生物技術(shù)有限公司測(cè)得的云南不同地區(qū)8 個(gè)煙草樣品的序列通過(guò)MEGA 7.0 呈現(xiàn)序列信息，通過(guò)人工方法除去引物及載體序列，最后獲得所擴(kuò)增的片段核酸序列。在DNAMAN 8.0 軟件下將各個(gè)片段進(jìn)行拼接，并且通過(guò)人工校正獲得它們的S 全序列。運(yùn)用NCBI ORF Finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)在線(xiàn)軟件分析，獲得云南不同地區(qū)8 個(gè)煙草樣品TSWV NSs 氨基酸序列。從GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到來(lái)自9 個(gè)國(guó)家和地區(qū)的3 種茄科作物上31 條TSWV NSs 氨基酸序列 (表1)。應(yīng)用DNAMAN 8.0 軟件，進(jìn)行云南不同地區(qū)8 個(gè)煙草樣品TSWV NSs 氨基酸序列與3 種茄科作物上31 條TSWV NSs 氨基酸序列一致性比對(duì)分析；再運(yùn)用MEGA 7.0 軟件通過(guò)鄰近法 (neighbor joining，NJ) 對(duì)其進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，其中Bootstrap 為1 000 次重復(fù)。運(yùn)用在線(xiàn)軟件The Selecton Server (http://Selecton.tau.ac.il)對(duì)8 個(gè)煙草樣品TSWV NSs 氨基酸位點(diǎn)所經(jīng)歷的進(jìn)化選擇情況進(jìn)行分析。

表1 TSWV NSs 氨基酸序列登錄號(hào)Tab.1 The accession numbers of amino acid sequences of TSWV NSs

2 結(jié)果與分析

2.1 RT-PCR 結(jié)果

通過(guò)RT-PCR 技術(shù)擴(kuò)增出云南不同地區(qū)8 個(gè)煙草樣品TSWV S RNA 序列，電泳檢測(cè)條帶大小約為2 970 bp (圖2)。

2.2 生物信息學(xué)分析

2.2.1 NSs 氨基酸序列一致性分析

圖2 S 片段擴(kuò)增PCR 結(jié)果Fig.2 The results of S fragment amplification PCR

運(yùn)用DNAMAN 8.0 軟件進(jìn)行一致性分析，結(jié)果顯示：云南不同地區(qū)8 個(gè)煙草樣品間TSWV NSs 氨基酸序列一致性高達(dá)99.4%～100%。云南不同地區(qū)8 個(gè)煙草樣品與GenBank 公布來(lái)自9 個(gè)國(guó)家和地區(qū)的煙草、番茄和辣椒上31 個(gè)TSWV NSs 氨基酸序列一致性在93.26%～100%之間；其中云南不同地區(qū)8 個(gè)煙草樣品與來(lái)自中國(guó)云南的1 份煙草、2 份番茄、1 份辣椒的TSWV NSs 氨基酸序列一致性最高達(dá)到97.68%～100%；與地理關(guān)系較近的韓國(guó)3 份番茄、3 份辣椒上TSWV NSs 氨基酸序列一致性次之，為96.21%～99.14%；而與地理關(guān)系較遠(yuǎn)的保加利亞且寄主同樣是煙草樣品的TSWV NSs 氨基酸序列一致性最低，達(dá)93.26%～96.57%。進(jìn)一步分析9 個(gè)國(guó)家和地區(qū)煙草、番茄和辣椒上31 條TSWV NSs 氨基酸序列，結(jié)果顯示：中國(guó)煙草(HQ 402595.1)與中國(guó)番茄(AEK 28761.1) TSWV NSs 氨基酸序列一致性為100%。

2.2.2 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析

采用MEGA 7.0 軟件，將云南不同地區(qū)8 個(gè)煙草樣品TSWV NSs 氨基酸序列與GenBank 中9 個(gè)國(guó)家和地區(qū)的煙草、番茄和辣椒上31 條TSWV NSs 氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果(圖3) 顯示：有3 個(gè)不同的TSWV NSs 分離物群。第Ⅰ組是來(lái)自中國(guó)和韓國(guó)的TSWV 分離物中NSs，包含煙草、辣椒和番茄寄主；其中，云南不同地區(qū)8 個(gè)煙草樣品與同樣來(lái)自中國(guó)云南煙草、番茄和辣椒TSWV 分離物中NSs 位于同一分支，并且與韓國(guó)番茄和辣椒TSWV 分離物中NSs 處于同一大支。第Ⅱ組是來(lái)自西班牙、阿爾及利亞和美國(guó)的TSWV 分離物中NSs，包含辣椒和番茄寄主。第Ⅲ組是來(lái)自南非、土耳其、澳大利亞和保加利亞的TSWV 分離物中NSs，包含煙草、番茄和辣椒寄主。

圖3 根據(jù)TSWV NSs 氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 The phylogenentc tree based on amino acid sequences of TSWV NSs

2.2.3 選擇壓力分析

通過(guò)The Selecton Server 軟件，對(duì)云南不同地區(qū)8 個(gè)煙草樣品TSWV NSs 氨基酸位點(diǎn)所經(jīng)歷的進(jìn)化選擇情況進(jìn)行分析。由圖4 所示：云南不同地區(qū)8 個(gè)煙草樣品TSWV NSs 氨基酸所經(jīng)歷的進(jìn)化沒(méi)有正向選擇位點(diǎn)，都是純化選擇(即負(fù)向選擇)位點(diǎn)。

圖4 TSWV NSs 各個(gè)氨基酸位點(diǎn)進(jìn)化壓力Fig.4 Pressure of each amino acid sites of TSWV NSs

3 討論

本研究結(jié)果表明：不同TSWV 分離物中NSs與其地理來(lái)源有明顯的相關(guān)性。TSOMPANA 等[13]對(duì)不同地理分布的不同寄主上TSWV編碼的5 種病毒蛋白進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析，發(fā)現(xiàn)TSWV NSs 與不同地理的分布有關(guān)。馬小方[14]對(duì)不同地理分布的梨和蘋(píng)果上蘋(píng)果莖痘病毒(Apple stem pitting virus，ASPV)編碼的外殼(CP)蛋白進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)：ASPV 分離物中CP 分布與寄主有關(guān)。另有研究發(fā)現(xiàn)：胡蔥黃條病毒(Shallot yellow stripe virus，SYSV) 分離物分布與地理分布及寄主都有顯著的相關(guān)性[15]。本研究通過(guò)TSWV NSs氨基酸序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)：云南8 個(gè)煙草樣品分別與中國(guó)云南煙草、番茄和辣椒上 4 個(gè)TSWV NSs 氨基酸序列一致性最高，而且在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中聚為同一支；與地理關(guān)系較近的韓國(guó)番茄和辣椒上 6 個(gè)TSWV NSs 氨基酸序列一致性次之，在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中位于同一大支，說(shuō)明這2 個(gè)國(guó)家TSWV NSs 親緣關(guān)系較近；而與地理關(guān)系較遠(yuǎn)歐洲保加利亞同樣是煙草分離物的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。這與TSOMPANA 等[13]的觀(guān)點(diǎn)相符。但TSOMPANA 的研究?jī)H選取了歐洲和美洲的樣本，而本研究除云南不同地區(qū)8 個(gè)煙草樣品TSWV NSs 氨基酸序列以外，還選取了來(lái)自5 個(gè)大洲9 個(gè)國(guó)家和地區(qū)的31 個(gè)TSWV NSs 氨基酸序列，更有力地證明了不同TSWV 分離物中NSs 與其地理來(lái)源有明顯的相關(guān)性。此外，我們選取辣椒、番茄和煙草3 種茄科寄主分析TSWV分離物中NSs 分布與寄主的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)TSWV分離物中NSs 未明顯按照寄主聚類(lèi)，并且在中國(guó)茄科作物上發(fā)現(xiàn)煙草(HQ 402595.1)和番茄(AEK 28761.1) TSWV NSs 氨基酸序列一致性達(dá)到100%，說(shuō)明不同TSWV 分離物中NSs 與寄主的相關(guān)性不大。這也提示我們，不同病毒種群分布的關(guān)鍵影響因子不同。

經(jīng)典理論表明：若一個(gè)基因存在正選擇則證明該基因已經(jīng)開(kāi)始為了適應(yīng)環(huán)境的巨變有新的功能產(chǎn)生，當(dāng)基因存在強(qiáng)烈的負(fù)選擇時(shí)，則說(shuō)明該基因是在穩(wěn)定保持原有的重要功能[16]。云南不同地區(qū) 8 個(gè)煙草樣品 TSWV NSs 氨基酸序列中未檢測(cè)到正選擇位點(diǎn)，說(shuō)明在云南不同地區(qū) 8 個(gè)煙草樣品 TSWV NSs 穩(wěn)定保持了其增強(qiáng)病毒癥狀、抑制沉默等功能。

4 結(jié)論

通過(guò)對(duì)云南不同地區(qū)8 個(gè)煙草樣品與Gen-Bank 公布來(lái)自9 個(gè)國(guó)家和地區(qū)的煙草、番茄和辣椒上31 個(gè)TSWV NSs 氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，說(shuō)明不同TSWV 分離物中NSs 與其地理來(lái)源有明顯的相關(guān)性，但跟寄主的相關(guān)性不大。再通過(guò)對(duì)云南不同地區(qū)8 個(gè)煙草樣品間TSWV NSs 氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，進(jìn)一步說(shuō)明了地理位置相近的地區(qū)TSWV NSs 具有更高的親緣關(guān)系，遺傳變異小，具有一定的穩(wěn)定性。云南不同地區(qū)8 個(gè)煙草樣品TSWV NSs 氨基酸序列中未檢測(cè)到正選擇位點(diǎn)，說(shuō)明在云南不同地區(qū)8 個(gè)煙草樣品TSWV NSs 穩(wěn)定保持了其增強(qiáng)病毒癥狀、抑制沉默等功能，未受云南不同地區(qū)復(fù)雜氣候的影響而發(fā)生適應(yīng)性進(jìn)化，這可能對(duì)TSWV 保持強(qiáng)侵染性相關(guān)，但仍需進(jìn)一步研究確定。NSs 是TSWV 重要的致病蛋白，對(duì)NSs 序列的分析將為研究TSWV 的致病機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。