基于多基因的分子分類技術(shù)在庫蠓鑒定中的應(yīng)用

楊美瓊， 張建慶， 蔡怡珊， 王飛鵬， 黃恩炯

(1.福州國際旅行衛(wèi)生保健中心，福建 福州350001；2.福建農(nóng)林大學(xué)植物保護學(xué)院，福建 福州350002)

庫蠓屬(Culicoides)屬節(jié)肢動物門(Arthropoda)昆蟲綱(Insecta)雙翅目(Diptera)蠓科(Ceratopogonidae)，是蠓科中最大的一個屬，也是分布最廣、種類最多、與人畜關(guān)系最密切的一類吸血蠓，還是多種人獸共患病的傳播媒介[1-2].庫蠓的種類鑒定是動植物檢疫和疾病預(yù)防控制的核心環(huán)節(jié).

目前，蠓類的鑒定仍主要依賴于傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法.但庫蠓不僅體型微小、鑒別特征少，而且具有表型可塑性和遺傳可變性，同時鑒定常受蟲態(tài)、性別和標(biāo)本完整性的影響，所以容易出現(xiàn)誤判[3].為彌補傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定的不足，亟需尋找一種快速準(zhǔn)確的鑒定技術(shù).

近年來，隨著以PCR 為基礎(chǔ)的DNA 序列測定方法的建立和廣泛使用，以DNA 條形碼技術(shù)為主的分子分類技術(shù)在昆蟲的鑒定中發(fā)揮了重要作用，極大地彌補了傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定的不足.線粒體COⅠ、COⅡ和核糖體DNA(rDNA)的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS 等基因也在蠓類的分子鑒定中得到應(yīng)用，澄清了蠓類一些近緣種和復(fù)合組的分類問題[4].然而，其主要以單基因檢測為主，仍難以實現(xiàn)對近緣種和復(fù)合組的準(zhǔn)確鑒定.

本研究選擇COⅠ、Cyt b、16S rDNA 和ITS 等多基因?qū)Σ勺晕覈?4 個省(自治區(qū))的77 種庫蠓進行分子鑒定，以期為庫蠓的準(zhǔn)確鑒定提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗標(biāo)本 庫蠓采自我國福建、海南、廣西、黑龍江、河北、安徽、湖南、新疆、青海、甘肅、四川、云南、西藏及臺灣等14 個省(自治區(qū))的36 個采樣點，共77 種284 份標(biāo)本.將每份標(biāo)本拍照并編號后用于試驗.所有標(biāo)本均保存于軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院醫(yī)學(xué)昆蟲標(biāo)本館.

1.1.2 主要試劑 昆蟲基因組DNA 提取試劑盒(Insect gDNA Minipre Kit)購自Biomiga 公司，凝膠回收試劑盒(E.Z.N.A.Gel Extraction Kit)購自O(shè)MEGA 公司，引物由Invitrogen 公司合成，克隆試劑盒(pMD 18-T Vector Cloning Kit)購自TaKaRa 公司.

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 采用燈誘法和牛帳誘法[5]采集庫蠓.采獲的庫蠓經(jīng)麻醉后保存于95%乙醇中.

1.2.2 標(biāo)本制作和形態(tài)鑒定 參照文獻[5]進行標(biāo)本制作和形態(tài)鑒定.鑒定結(jié)果由軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院虞以新研究員復(fù)核確認.

1.2.3 基因組DNA 提取 取庫蠓翅基部約1 mm3的組織，研碎，按照DNA 提取試劑盒說明書提取基因組DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆?

1.2.4 PCR 擴增 選用COⅠ、Cyt b、16S rDNA 和ITS 基因進行PCR 擴增，引物序列及相關(guān)信息見表1.除用于切膠回收的PCR 反應(yīng)體系為50 μL 外，其余均為25 μL 擴增體系.PCR 擴增體系(25 μL):DNA 模板1 μL，上、下游引物各0.5 μL，10×緩沖液2.5 μL，dNTPs 0.5 μL，Taq 酶1.25 μL，ddH2O 18.75 μL.反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃45 s，40～48 ℃45 s，72 ℃60 s，35 個循環(huán)，72 ℃延伸10 min.

表1 引物信息Table 1 Information on the PCR primers

1.2.5 PCR 產(chǎn)物純化、克隆及測序 PCR 產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測后，用凝膠回收試劑盒進行純化，需要克隆的樣品使用克隆試劑盒進行DNA 克隆，陽性克隆菌液用60%甘油保存.直接測序的產(chǎn)物，所用引物與PCR擴增所用引物相同；克隆的樣品，采用相應(yīng)載體的通用引物作為測序引物.為確保所獲基因序列的準(zhǔn)確性，所有產(chǎn)物均送至上海生工生物工程有限公司進行雙向測序.

1.2.6 序列分析 利用DNAMAN、BioEdit、Clustal W、MEGA 5.2、MrBayes 等生物信息學(xué)軟件對庫蠓基因序列進行分析；同時，應(yīng)用MEGA 5.2 計算庫蠓種間與種內(nèi)各基因基于Kimura 雙參數(shù)模型的遺傳距離，并以與庫蠓屬親緣關(guān)系最近的細蠓屬中的北域細蠓(Leptoconops borealis)[9-10]作為外群，通過貝葉斯推理法(Bayesian inference， BI)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹.

2 結(jié)果與分析

2.1 各基因的遺傳距離

2.1.1 COⅠ 93.48%庫蠓的種間遺傳距離為0.15～0.30，平均距離為0.22(圖1A).其中，安酋庫蠓(C.andrewsi)與印度庫蠓(C.indianus)、美麗庫蠓(C.bellulus)與長喙庫蠓(C.longirostris)、大和庫蠓(C.japonicus)與泊地庫蠓(C.toyamaruae)、馬來庫蠓(C.malayae)與類牛庫蠓(C.parabubalus)之間的遺傳距離最小，僅為0.002，而琉球庫蠓(C.actoni)與新竹庫蠓(C.liui)之間的遺傳距離最大(0.37).65.85%庫蠓的種內(nèi)遺傳距離小于0.02，平均距離為0.03(圖1B).其中，美麗庫蠓、長喙庫蠓、怒江庫蠓(C.nujiangensis)、異域庫蠓(C.peregrinus)、邊緣庫蠓(C.pictimargo)、色莖庫蠓(C.pictipennis)等6 個庫蠓的種內(nèi)遺傳距離為0，褐肩庫蠓(C.parahumeralis)的種內(nèi)遺傳距離最大(0.17).

圖1 庫蠓COⅠ基因序列K2P 遺傳距離頻度分布Fig.1 Frequency distribution of K2P distance of the COⅠgenes from Culicoides species

2.1.2 Cyt b 94.13%庫蠓的種間遺傳距離為0.15～0.30，平均距離為0.23(圖2A).其中，大和庫蠓與泊地庫蠓、馬來庫蠓與類牛庫蠓之間的遺傳距離最小(0.002)，類牛庫蠓與褐肩庫蠓之間的遺傳距離最大(0.35).69.44%庫蠓的種內(nèi)遺傳距離小于0.02，平均距離為0.04(圖2B).其中，安酋庫蠓、美麗庫蠓、沙庫蠓(C.desertorum)、赫氏庫蠓(C.hegneri)、屏東庫蠓(C.hui)、金娜庫蠓(C.kinari)、邊緣庫蠓、細須庫蠓(C.tenuipalpis)等8 種庫蠓的種內(nèi)遺傳距離為0，霍飛庫蠓(C.huffi)的種內(nèi)遺傳距離最大(0.19).

圖2 庫蠓Cyt b 基因序列K2P 遺傳距離頻度分布Fig.2 Frequency distribution of K2P distance of the Cyt b genes from Culicoides species

2.1.3 16S rDNA 96.15%庫蠓的種間遺傳距離為0.10～0.25，平均距離為0.16(圖3A).其中，大和庫蠓與泊地庫蠓之間的遺傳距離最小(0)，類牛庫蠓與李拭庫蠓(C.riethi)之間的遺傳距離最大(0.27).72.09%庫蠓的種內(nèi)遺傳距離小于0.02，平均距離為0.02(圖3B).其中，美麗庫蠓、沙庫蠓、屏東庫蠓、赫氏庫蠓、大和庫蠓、金娜庫蠓、馬來庫蠓、迷你庫蠓(C.minimus)、異域庫蠓、泊地庫蠓等10 個蠓的種內(nèi)遺傳距離為0，細須庫蠓的種內(nèi)遺傳距離最大(0.09).

2.1.4 ITS 89.92%庫蠓的種間遺傳距離為0.15～0.30，平均距離為0.21(圖4A).其中，藍腹庫蠓(C.cyancus)與華鎣庫蠓(C.huayingensis)之間的遺傳距離最小(0.003)，克彭庫蠓(C.kepongensis)與異域庫蠓之間的遺傳距離最大(0.39).97.22%庫蠓的種內(nèi)遺傳距離在0.14 以內(nèi)，平均距離為0.04(圖4B).其中，盔狀庫蠓(C.cassideus)的種內(nèi)遺傳距離為0.003，短須庫蠓(C.brevipalpis)的種內(nèi)遺傳距離最大(0.17).

2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

為確保系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，對各個數(shù)據(jù)集的系統(tǒng)發(fā)育信號進行評估.結(jié)果表明，各數(shù)據(jù)集的堿基替換均未飽和，可用于系統(tǒng)發(fā)育樹的分析.

本研究獲得線粒體COⅠ+16S rDNA+Cyt b 聯(lián)合基因158 條(片段長度為1 530 bp)和COⅠ+16S rDNA+Cyt b+ITS 完全聯(lián)合基因118 條(片段長度為2 787 bp)，隸屬于屋室亞屬(subgenusOecactaPoey)、帶紋亞屬(subgenusBeltranmyiaVargas)、庫蠓亞屬(subgenusCulicoidesLatreille)、二囊亞屬(subgenusAvaritiaFox)、血色亞屬(subgenusHaemophoructusMacfie)、三囊亞屬(subgenusTrithecoidesWirth et Hubert)和單囊亞屬(subgenusMonoculicoidesKhalaf).

圖3 庫蠓16S rDNA 基因序列K2P 遺傳距離頻度分布Fig.3 Frequency distribution of K2P distance of the 16S rDNA genes from Culicoides species

圖4 庫蠓ITS 基因序列K2P 遺傳距離頻度分布Fig.4 Frequency distribution of K2P distance of the ITS genes from Culicoides species

根據(jù)AIC(Akaike information criterion)原則選擇最佳核苷酸替換模型進行系統(tǒng)發(fā)育分析，各單基因及聯(lián)合基因的最適模型都為GTR+I+G.從線粒體基因聯(lián)合數(shù)據(jù)集的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖5)可知，不同亞屬之間構(gòu)成了13 個平行支系.其中以二囊亞屬為最大的支系，主要包含琉球庫蠓、迷你庫蠓組成的琉球庫蠓組(actoni group)以及東方庫蠓(C.orientalis)、牧場庫蠓(C.pastus)、暗色庫蠓(C.fulvus)、連斑庫蠓(C.jacobsoni)、美麗庫蠓、長喙庫蠓、黑斑庫蠓(C.migromaculatus)、怒江庫蠓等組成的東方庫蠓組(orientalis group)；琉球庫蠓組與東方庫蠓組構(gòu)成姐妹群，并有較高的支持率(PP 值為0.73).此外，在另外一個較大的支系上，屋室亞屬與帶紋亞屬構(gòu)成姐妹群(PP 值為0.51).

基于完全聯(lián)合數(shù)據(jù)集的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖6)分為2 個支系:其中一個小支系僅包含麥?zhǔn)蠋祗?C.mcdonaldi)和刺螫庫蠓(C.punctatus)兩種；另一個支系拓撲結(jié)構(gòu)基本同于線粒體基因聯(lián)合數(shù)據(jù)集，不同的是牧場庫蠓未與東方庫蠓組的其他蠓種聚在一起，而是與尖喙庫蠓(C.oxystoma)聚在一支.

在不同數(shù)據(jù)集的系統(tǒng)發(fā)育樹中，僅單囊亞屬是單系群，其余亞屬均不具有單系性.

3 討論與結(jié)論

本研究以近6 年來在我國14 個省(自治區(qū))采獲的庫蠓標(biāo)本為研究對象，初步建立了基于線粒體COⅠ、Cyt b、16S rDNA 和核糖體ITS 多基因的庫蠓分子分類體系.該體系與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果基本吻合，并從中發(fā)現(xiàn)了庫蠓屬7 個新種，9 個我國新記錄種(待發(fā)表).

種間與種內(nèi)的遺傳距離分析結(jié)果顯示，基于各基因序列K2P 校正的種間與種內(nèi)平均遺傳距離不同，以16S rDNA 的種間(0.16) 和種內(nèi)(0.02) 的平均遺傳距離最小，COⅠ(種間0.22、種內(nèi)0.03)和ITS(種間0.21、種內(nèi)0.04)的平均遺傳距離次之，而Cyt b 的種間(0.23)和種內(nèi)(0.04)的平均遺傳距離最大.在不同的基因標(biāo)記中，分布范圍較廣的蠓種的種內(nèi)遺傳距離常較大，如褐肩庫蠓基于COⅠ的種內(nèi)遺傳距離達0.17；而分布范圍較窄的蠓種的種內(nèi)遺傳距離較小，如美麗庫蠓基于COⅠ、Cyt b 以及16S rDNA 的種內(nèi)遺傳距離都為0.這提示大的種內(nèi)變異可能產(chǎn)生于地理隔離的不同族群[11]或存在隱存種[12].一些形態(tài)近似的庫蠓的種間遺傳距離較小，如安酋庫蠓與印度庫蠓、美麗庫蠓與長喙庫蠓、馬來庫蠓與類牛庫蠓、大和庫蠓與泊地庫蠓、藍腹庫蠓與華鎣庫蠓，基于不同基因的遺傳距離僅為0～0.003.

圖5 基于COⅠ+Cyt b+16S rDNA 聯(lián)合基因的BI 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree based on COⅠ+Cyt b+16S rDNA by Bayesian inference

系統(tǒng)發(fā)育樹表明，僅單囊亞屬是單系群，屋室亞屬、帶紋亞屬、庫蠓亞屬、二囊亞屬、血色亞屬、三囊亞屬都形成并系群，這與早先的研究結(jié)果[12]一致.

圖6 基于COⅠ+Cyt b+16S rDNA+ITS 聯(lián)合基因的BI 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree based on COⅠ+Cyt b+16S rDNA+ITS by Bayesian inference

不同基因數(shù)據(jù)集的聚類結(jié)果提示:(1)安酋庫蠓(同龍溪庫蠓C.lungchiensis)、印度庫蠓、異域庫蠓可能為同種異名.龍溪庫蠓與安酋庫蠓沒有明顯區(qū)別，因后者發(fā)表在先，故統(tǒng)一更名為安酋庫蠓；安酋庫蠓與印度庫蠓也非常近似[13-14]，且兩者間基于COⅠ的遺傳距離僅為0.002，明顯低于學(xué)者基于DNA 條形碼對種間遺傳距離大于2%的界定[15]；Borkent et al[16]將龍溪庫蠓(安酋庫蠓)作為異域庫蠓的同種異名，這與本研究中安酋庫蠓與異域庫蠓形成姐妹群的結(jié)果相一致.(2)馬來庫蠓、類牛庫蠓、南山庫蠓(C.lansangensis)、蘇島庫蠓(C.sumatrae)可能為一個種團.在不同基因的系統(tǒng)發(fā)育樹上，馬來庫蠓與類牛庫蠓都為姐妹群，且兩種間遺傳距離小(COⅠ和16S rDNA 均為0.002)；從形態(tài)上看，這兩種蠓的鑒定特征基本相似，用于辨別的主要特征僅為前者的受精囊一大一小[17]，后者的兩個受精囊基本等大[18].系統(tǒng)發(fā)育樹上，南山庫蠓、蘇島庫蠓與馬來庫蠓、類牛庫蠓聚于同一支且有高的支持率，PP 值均為1.00；形態(tài)上，這4 種庫蠓的翅斑也較為近似.(3)美麗庫蠓與長喙庫蠓可能是種內(nèi)的形態(tài)變異體或同種多態(tài)型.美麗庫蠓翅面徑脈端部2個明斑明顯呈不同程度的傾斜，而長喙庫蠓的明斑偏直，且前者的翅面明斑明顯小于后者；美麗庫蠓雄蟲的尾器第9 背板不呈弧形凹陷，而長喙庫蠓有寬而深的凹陷；前者雌蟲的2 個受精囊不等大，而后者雌蟲的2 個受精囊基本等大.但兩者在系統(tǒng)發(fā)育樹上為姐妹群，且基于不同基因數(shù)據(jù)集的遺傳距離均很小(COⅠ為0.002，16S rDNA 為0.001，Cyt b 和ITS 均為0.008).(4)泊地庫蠓可能是大和庫蠓的近緣種.系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，泊地庫蠓與大和庫蠓是單系群，且PP 值為1.00，這與兩者間較小的遺傳距離(COⅠ和Cyt b均為0.002，16S rDNA 和ITS 均為0)相符.但兩者在形態(tài)上有明顯區(qū)別:大和庫蠓翅面中肘叉和縱二室有明斑，而泊地庫蠓通常沒有，且前者的翅面明斑大于后者；前者雌蟲的受精囊呈卵形，而后者呈圓形.(5)注意迷你庫蠓與琉球庫蠓的準(zhǔn)確鑒別.兩者都屬于小型蠓種(體長約為1 mm)，是琉球庫蠓組里僅有的2 個種.形態(tài)上除受精囊大小外并無明顯區(qū)別，琉球庫蠓的兩個受精囊近乎等大，而迷你庫蠓的兩個受精囊大小不一；基于COⅠ基因的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，兩者形成姐妹群.因此，單靠形態(tài)學(xué)可能會造成錯誤的鑒定.

利用線粒體COⅠ、16S rDNA、Cyt b 和核糖體ITS 基因不僅能準(zhǔn)確鑒定蠓種，還能澄清庫蠓屬里的同種異名問題.但本研究仍有一些方面待改進:部分標(biāo)本因形態(tài)不完整而無法鑒定到具體種，或因保存方式不當(dāng)而未能提取出核酸；同時，所有試驗標(biāo)本均為單只處理，且僅有胸段翅基部組織用于核酸提取，提取的總DNA 濃度低、體積小，導(dǎo)致部分標(biāo)本的某些基因片段擴增失敗，造成數(shù)據(jù)不全；再者，吉林亞屬(subgenusJilinocoides)、橋莖亞屬(subgenusPontoculicoides)等個別亞屬種類數(shù)太少，分布地點較為局限，本研究未能采獲這些亞屬的標(biāo)本.因此，今后有待補充標(biāo)本并做進一步研究.