甘薯根結(jié)線蟲病病原
——象耳豆根結(jié)線蟲的鑒定

章淑玲， 歐高政， 陳美玲

(1.福建農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學院園藝園林學院，福建 福州350119；2.南安市天禾綠保農(nóng)資有限公司，福建 泉州362300)

甘薯是重要的糧食作物，中國甘薯的種植面積和總產(chǎn)量均居世界第一，福建是中國最重要的甘薯主產(chǎn)區(qū)之一[1-2].甘薯根結(jié)線蟲病是甘薯生產(chǎn)上的重要線蟲病害，已報道的病原線蟲有南方根結(jié)線蟲(Meloido-gyne incognita)、北方根結(jié)線蟲(M.hapla)、花生根結(jié)線蟲(M.arenaria)、爪哇根結(jié)線蟲(M.javanica)等[3-4]，2014 年我國廣東省湛江甘薯上發(fā)現(xiàn)了象耳豆根結(jié)線蟲(M.enterolobii)[5].該線蟲最早于1983 年在我國海南儋州象耳豆樹上被發(fā)現(xiàn)、鑒定并命名[6]；隨后其相繼在我國廣東、湖南、福建、云南等多個省份的不同作物上被發(fā)現(xiàn)[7].象耳豆根結(jié)線蟲寄主范圍廣、致病力強，且能克服抗根結(jié)線蟲的Mi 基因，已成為全世界熱帶及亞熱帶地區(qū)農(nóng)作物生產(chǎn)上最具威脅性的重要病原之一[8-10].福建省的番石榴、荔枝[11]、胡蘿卜、香蕉、生姜、辣椒和空心菜等作物上曾發(fā)現(xiàn)了該線蟲的危害[12-15].2019 年福建省泉州石獅一塊6 ～7 hm2的甘薯地發(fā)生了嚴重的根結(jié)線蟲病，經(jīng)調(diào)查取樣、形態(tài)特征觀察及分子生物學鑒定，明確其為象耳豆根結(jié)線蟲，現(xiàn)將研究結(jié)果作如下報道.

1 材料與方法

1.1 樣本采集

于2019 年8 月采集福建省泉州石獅發(fā)病地病薯(品種:湖南2 號)根部及根系周圍的病土約500 g，分別放入封口袋內(nèi)，并注明采集日期、地點、前茬作物和土壤類型等，帶回實驗室作進一步觀察、分離與鑒定.

1.2 線蟲種群純化與保存

于體視顯微鏡(Nikon SMZ 745)下直接剖取甘薯病根中的單卵塊，接種到預先培植在滅菌砂質(zhì)土壤中長有兩三片真葉的番茄苗根部，后置于18～30 ℃、13 h 光照的溫室中培養(yǎng)60 d.

1.3 形態(tài)鑒定

用于形態(tài)鑒定的各蟲態(tài)線蟲均分離自單卵塊繁育的番茄根結(jié)線蟲種群.雌蟲由體視顯微鏡(Nikon SMZ 745)下直接剖解番茄病根組織所得；雄蟲通過改良貝爾曼漏斗法分離自染病番茄根部土壤；2 齡幼蟲由番茄病根上單卵塊孵化.線蟲的殺死、固定及會陰花紋的制作參考張紹升[16]的方法.各形態(tài)線蟲的體長、體寬、口針長、背食道腺開口至口針基部球的距離(DGO)、排泄孔至頭端距離(EP)和尾長等重要形態(tài)分類特征值采用De Man公式進行計量[16].每一蟲態(tài)取20 個樣本.

1.4 分子鑒定

1.4.1 DNA 提取 甘薯根結(jié)線蟲DNA 的提取參照陳淑君等[15]的方法.在體視顯微鏡(Nikon SMZ 745)下挑取1～3 條根結(jié)線蟲2 齡幼蟲，經(jīng)滅菌ddH2O 清洗2～3 次后加入4 μL WLB 裂解液，用滅菌挑針將線蟲切成2～3 段，用移液槍將線蟲液吸到含有1.2 μL 蛋白酶K 和17 μL WLB 的Eppendorf 管中，于-20 ℃冰箱中冷凍過夜.次日放入PCR 儀中65 ℃消化60 min，95 ℃滅活10 min，10 000 r·min-1離心2 min.離心后的上清液直接用于PCR 擴增或置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?

1.4.2 rDNA-ITS 序列分析 選用線蟲rDNA-ITS 區(qū)PCR 擴增通用引物V5367(5′-TTGATTACGTCCCTGCCCTTT-3′)和26S(5′-TTTCACTCGCCGTTACTAAGG-3′)[17]進行PCR 擴增.本試驗所用引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成.25 μL PCR 反應體系:2.0 μL DNA 模板，上、下游引物(10 μmol·L-1)各1.0 μL，12.5 μL 10×PCR Master Mixture，8.5 μL ddH2O.擴增程序:94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s ，35 個循環(huán)；最后72 ℃延伸l0 min.取5 μL 擴增產(chǎn)物用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送至鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司進行雙向測序.將獲得的rDNA-ITS 區(qū)序列與GenBank 數(shù)據(jù)庫中常見根結(jié)線蟲序列進行Blast 比對分析，并通過MEGA Ⅹ軟件[18]中的MUSCLE 算法[19]比對，采用PhyloSuite 套件[20]中的IQ-tree[21]基于最大似然法(maximum likelihood， ML)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹.分支上的可靠性經(jīng)超快自展法(ultralfast bootsrap)10 000 次重復進行評估[22].

1.4.3 特異性引物檢測 根據(jù)線蟲形態(tài)與rDNA-ITS 序列分析結(jié)果，選用象耳豆根結(jié)線蟲特異性引物Me-F(5′-AACTTTTGTGAAAGTGCCGCTG-3′)和Me-R(5′-TCAGTTCAGGCAGGATCAACC-3′)[23]對供試的甘薯根結(jié)線蟲5 個DNA 樣本進行PCR 特異性擴增.25 μL PCR 反應體系同1.4.2，擴增程序:94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，38 個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min.取5 μL PCR 產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測.

1.5 盆栽接種試驗

選擇健康的湖南2 號甘薯莖蔓，扦插于裝有180 ℃高溫滅菌砂質(zhì)土壤的塑料盆(?=25 cm)內(nèi).待3～5 d植株成活后，于根部接種純化培養(yǎng)的2 齡幼蟲懸浮液(500 條·mL-1)5 mL，即每盆接種2 500 條；以不接種線蟲為對照.接種處理與對照各10 盆，置于18～30 ℃、13 h 光照的溫室中栽培50 d 后觀察植株癥狀.

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀

田間甘薯受根結(jié)線蟲嚴重侵染后，植株地上部常表現(xiàn)出葉片變黃或變紅，生長緩慢，呈萎蔫狀(圖1A～B)；地下部薯塊較小，表皮處常可見零散分布的大小不等的圓形或不規(guī)則形瘤狀凸起，病薯剖開后無明顯癥狀(圖1C～D)；側(cè)根上出現(xiàn)許多形狀不一、表面粗糙的大小根結(jié)，有的根結(jié)連成塊狀腫瘤，直徑為正常根系的2 倍以上，后期根系腐爛(圖1E ～F).室內(nèi)盆栽接種純化的線蟲50 d 后表現(xiàn)出與田間相似的癥狀(圖1G～I).在體視顯微鏡(Nikon SMZ 745)下觀察受害根部，可見近圓形的乳白色雌蟲及卵塊裸露或埋生于根組織內(nèi)(圖1J～L)，解剖卵塊有時可見雄蟲藏在其中(圖1M).

圖1 甘薯根結(jié)線蟲病癥狀Fig.1 Symptoms of root-knot nematode disease on sweet potato

2.2 形態(tài)特征

雌蟲:蟲體膨大成球形或梨形，乳白色，有一明顯突出的短頸，頭架骨質(zhì)化不明顯.口針纖細，針錐稍短于針桿，排泄孔位于中食道球同一水平處(圖2A).會陰花紋圓形或橢圓形，線紋細、較平滑，背弓高，呈近圓形或方形；側(cè)線不明顯，陰肛區(qū)無線紋(圖2B～C).

雄蟲:蠕蟲形，體較長，體環(huán)明顯，頭架骨質(zhì)化較明顯，稍縊縮.口針較發(fā)達，針錐與針桿等長，基部球明顯.排泄孔位置不定，后食道腺從腹面覆蓋于腸前端(圖2D).側(cè)區(qū)有明顯的4 條側(cè)線；尾短，交合刺發(fā)達，無交合傘(圖2E).

2 齡幼蟲:蠕蟲形，體細小，頭架骨質(zhì)化弱.口針纖細，針錐與針桿等長，基部球小.排泄孔位于后食道腺中部，后食道腺從腹面覆蓋于腸前端(圖2F).尾長錐狀，有一清晰的透明區(qū)，末端鈍圓，有1 ～3 個縊縮(圖2G).

圖2 供試甘薯根結(jié)線蟲形態(tài)特征Fig.2 Morphological characteristics of root-knot nematode on sweet potato

本研究所分離純化的甘薯根結(jié)線蟲的形態(tài)測量值見表1，除雄蟲測量值偏小外，其余蟲態(tài)各測量值均與象耳豆根結(jié)線蟲的原始描述[6]相符.因此，初步鑒定福建甘薯根結(jié)線蟲為象耳豆根結(jié)線蟲.

表1 供試甘薯根結(jié)線蟲與象耳豆根結(jié)線蟲原始描述群體的測量值比較1)Table 1 Comparison on the morphological measurements of root-knot nematode on sweet potato and the original records of M.enterolobii

2.3 分子生物學特征

利用通用引物V5367/26S 擴增供試甘薯根結(jié)線蟲3 個DNA 樣本的rDNA-ITS 區(qū)片段，擴增產(chǎn)物經(jīng)測序后得到3 條均為765 bp 的序列，GenBank 登錄號為MT406249 ～MT406251.Blast 比對分析顯示，福建甘薯根結(jié)線蟲與GenBank 中象耳豆根結(jié)線蟲的同區(qū)域序列(MG773548 ～MG773551，KX823372 ～KX823382，MT209950～MT209955)相似性達99%～100%.由IQ-tree 構(gòu)建的ML 系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)可以看出，福建甘薯根結(jié)線蟲的3 個序列與象耳豆根結(jié)線蟲位于同一分支，支持率為100%.

圖3 基于rDNA-ITS 序列構(gòu)建的ML 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 ML phylogenetic tree based on rDNA-ITS sequence

利用特異性引物Me-F/Me-R 擴增甘薯根結(jié)線蟲5個DNA 樣本，得到236 bp 的特異性片段，不含DNA的陰性對照沒有擴增條帶(圖4).該結(jié)果與文獻[18]報道的片段大小一致，由此可確定福建泉州石獅甘薯根結(jié)線蟲群體為單一種群，均為象耳豆根結(jié)線蟲.

3 討論

目前已報道的根結(jié)線蟲有100 多種，各種類間的形態(tài)特征相似，為準確地鑒定根結(jié)線蟲種類，往往需要將形態(tài)學與分子生物學方法相結(jié)合[7].本研究通過觀察供試甘薯根結(jié)線蟲不同蟲態(tài)的形態(tài)特征，以及對線蟲rDNA-ITS 區(qū)進行PCR 擴增、測序、序列比對與建樹分析，同時結(jié)合種特異性引物擴增的結(jié)果，證實福建省泉州石獅甘薯根結(jié)線蟲病的病原為象耳豆根結(jié)線蟲(Meloidogyne enterolobiiYang & Eisenback).這是福建省甘薯上發(fā)生象耳豆根結(jié)線蟲的首次報道.該線蟲致病力強，調(diào)查中發(fā)現(xiàn)發(fā)病田中80%以上的甘薯呈現(xiàn)受害癥狀，根系根結(jié)多，植株長勢差，受害薯塊呈明顯畸形，薯塊小且表面著生多個瘤狀凸起，嚴重降低了甘薯的產(chǎn)量與價值.泉州石獅位于福建的南部地區(qū)(即閩南)，根據(jù)孟永攀[24]建立的象耳豆根結(jié)線蟲潛在適生區(qū)預測模型，推測該地區(qū)是象耳豆根結(jié)線蟲高度或中度適生區(qū).此外，本研究中的發(fā)病地為砂質(zhì)土壤，前茬作物為胡蘿卜，福建多地已發(fā)現(xiàn)胡蘿卜象耳豆根結(jié)線蟲病[12，15]，這可能是此次甘薯象耳豆根結(jié)線蟲病發(fā)生的重要原因.鑒于甘薯在福建省糧食作物中的重要地位及象耳豆根結(jié)線蟲的危害性，今后農(nóng)業(yè)部門應加強警惕該線蟲在福建省尤其是閩南地區(qū)甘薯上的發(fā)生與流行，并及時做好線蟲的預警、監(jiān)測等相關(guān)工作.