基于系統(tǒng)藥理學(xué)探討消癌解毒方防治結(jié)直腸腺瘤性息肉癌變機制*

陳婷婷，沈衛(wèi)星，程海波

南京中醫(yī)藥大學(xué)/江蘇省中醫(yī)藥防治腫瘤協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇南京210023

結(jié)直腸癌已躍居全球癌癥相關(guān)死亡原因的第三位［1］。其中結(jié)直腸腺瘤性息肉作為結(jié)直腸癌主要的癌前病變，已有確鑿證據(jù)表明其是結(jié)腸癌發(fā)病的高危因素，流行病學(xué)資料顯示腺瘤發(fā)病率越高則腸癌發(fā)病率也越高，且相關(guān)機制研究已形成“腺瘤-癌變”假說［2］。腸鏡下切除術(shù)作為結(jié)直腸腺瘤性息肉的主要治療手段，可降低但不能長期預(yù)防腺瘤性息肉的再發(fā)或癌變，當前多采取非甾體抗炎藥、阿司匹林、適當補充鈣劑和維生素D、生活飲食習(xí)慣調(diào)護等來預(yù)防結(jié)直腸腺瘤性息肉的復(fù)發(fā)、癌變。目前，尚未見公認的預(yù)防結(jié)直腸腺瘤性息肉復(fù)發(fā)、癌變的標準治療方案［3］。

中醫(yī)“治未病”理論體系隨時代的不斷發(fā)展，促使中醫(yī)藥防治結(jié)直腸惡性腫瘤逐漸成為臨床研究重點。依托國醫(yī)大師周仲瑛教授的“癌毒”病機理論、臨床實踐，筆者提出結(jié)直腸腺瘤性息肉的基本病機為“脾虛毒蘊”，并創(chuàng)立了防治結(jié)直腸腺瘤性息肉復(fù)發(fā)、癌變的中藥復(fù)方“消癌解毒方”（白花蛇舌草、苦參、黨參、白術(shù)、烏梅、黃連），大樣本臨床隨機觀察尚在研究中。前期研究發(fā)現(xiàn)該藥能夠降低結(jié)直腸腺瘤性息肉再復(fù)發(fā)及疾病惡化（異型增生、癌變）。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一門從系統(tǒng)層面研究中醫(yī)藥的新興學(xué)科，運用生物網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫和相關(guān)分析技術(shù)構(gòu)建“藥物-靶點-疾病”之間復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，可快速、系統(tǒng)地預(yù)測和分析藥物作用潛在機制。本研究擬應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相關(guān)技術(shù)，分析消癌解毒方中主要核心藥物防治結(jié)直腸腺瘤性息肉癌變的作用靶標、信號通路，并進行相關(guān)潛在機制的分類富集分析，揭示消癌解毒方通過多靶點、多通路防治疾病不良病變的思路和依據(jù)［4-5］。

1 資料與方法

1.1 構(gòu)建消癌解毒方對應(yīng)化學(xué)成分數(shù)據(jù)集依托中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫（traditional Chinesemedicine systems pharmacology，TCMSP；http://lsp.nwu.edu.cn/index.php），檢索白花蛇舌草（Hedyotis Diffusae Herba）、苦參（Sophorae Flavescentis Radix）、黨參（Codonopsis Radix）、白術(shù)（Atractylodes Macrocephala Koidz）、烏梅（Mume Fructus）、黃連（Coptidis Rhizoma）對應(yīng)的化學(xué)成分，設(shè)定藥物口服生物利用度（oral Bioavailability，OB）值≥30%且藥物相似性（drug Similarity，DL）≥0.15為篩選條件，建立對應(yīng)中藥的化學(xué)成分數(shù)據(jù)集。

1.2 構(gòu)建消癌解毒方化學(xué)成分對應(yīng)靶點數(shù)據(jù)集

借助TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索篩選得到的各化學(xué)成分對應(yīng)靶點，構(gòu)建化合物對應(yīng)靶點數(shù)據(jù)庫。用于研究口服消癌解毒方防治結(jié)直腸腺瘤性息肉癌變的潛在機制。

1.3 構(gòu)建結(jié)直腸腺瘤性息肉和結(jié)直腸癌疾病對應(yīng)靶點庫分別以“Colorectal Adenoma”“Colorectal cancer”為關(guān)鍵詞，查閱人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM:https://omim.org/）、治療靶點數(shù)據(jù)庫（Therapeutic Target Database，TTD:http://db.idrblab.net/ttd/）、藥物基因組學(xué) 知 識 庫 （Pharmacogenomics Knowledgebase，PharmGkb:https://www.pharmgkb.org/）及疾病基因搜索系統(tǒng)（Disease Gene Search Engine with Evidence Sentences，DiGSeE:http://210.107.182.61/geneSearch/）收集對應(yīng)靶點，構(gòu)建對應(yīng)的疾病-靶點數(shù)據(jù)庫。

1.4 構(gòu)建“消癌解毒方-化合物-關(guān)鍵靶點”子網(wǎng)絡(luò)通過蛋白數(shù)據(jù)庫（Uniprot:http://www.uniprot.org/）對化合物對應(yīng)靶點和疾病對應(yīng)靶點進行校正和統(tǒng)一。運用生物信息學(xué)與進化基因組學(xué)平臺（Bioinformatics＆ Evolutionary Genomics:http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）將校準后的靶點取交集提取關(guān)鍵靶點。同時通過Cytoscape（3.2.1）（http://cytoscapeweb.cytoscape.org/）構(gòu)建中藥-化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)和疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)，將兩網(wǎng)絡(luò)進行整合，結(jié)合Bioinformatics＆Evolutionary Genomics平臺得到的關(guān)鍵靶點，最終提取整合后的網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵靶點所對應(yīng)的網(wǎng)絡(luò)圖，形成中藥-化合物-關(guān)鍵靶點網(wǎng)絡(luò)并進行分析。

1.5 對關(guān)鍵靶點進行GO和KEGG富集分析基因本體（gene ontology，GO）是一個基因功能分類的標準化系統(tǒng)，常見的3個主要分類包括生物學(xué)過程（biological process）、細胞成分（cellular components）和分子功能（molecular function）［6］，運用Enrichr數(shù)據(jù)庫（http://amp.pharm.mssm.edu/Enrichr/）對關(guān)鍵潛在靶點進行GO功能富集分析，同時下載京都基因和基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）信號通路相關(guān)數(shù)據(jù)，在omicshare軟件平臺（https://www.omicshare.com）進行富集，從系統(tǒng)生物學(xué)角度對消癌解毒方防治結(jié)直腸腺瘤性息肉癌變潛在機制進行預(yù)測。

2 結(jié)果

2.1 消癌解毒方對應(yīng)化合物TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索到符合篩選條件的中藥白花蛇舌草對應(yīng)的化合物7個、苦參對應(yīng)的化合物43個、黨參對應(yīng)的化合物19個、白術(shù)對應(yīng)的化合物7個、烏梅對應(yīng)的化合物8個、黃連對應(yīng)的化合物10個，為進一步檢索各化合物對應(yīng)靶點做準備。

2.2 消癌解毒方化學(xué)成分對應(yīng)靶點在TCMSP數(shù)據(jù)庫對符合篩選條件的各化學(xué)成分對應(yīng)靶點進行檢索，其中白花蛇舌草對應(yīng)的7個化合物中有5個化合物有對應(yīng)的靶點236個，苦參對應(yīng)的43個化合物可檢索到對應(yīng)靶點509個，黨參對應(yīng)的16個化合物可檢索到對應(yīng)靶點211個，白術(shù)對應(yīng)的4個化合物可檢索到對應(yīng)靶點23個，烏梅對應(yīng)的8個化合物可檢索到對應(yīng)靶點302個，黃連對應(yīng)的9個化學(xué)成分可檢索到對應(yīng)靶點264個。將上述各化合物對應(yīng)靶點合并，共得到1 545個對應(yīng)化合物靶點，其中唯一靶點243個，為進一步構(gòu)建化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)，研究口服消癌解毒方防治結(jié)直腸腺瘤性息肉癌變的潛在機制做準備。

2.3 結(jié)直腸腺瘤性息肉與結(jié)直腸癌疾病對應(yīng)靶點

以對應(yīng)的疾病名在OMIM、TTD、PharmGkb及DiGSeE數(shù)據(jù)庫進行檢索、收集對應(yīng)靶點，并通過Uniprot數(shù)據(jù)庫選擇“Homo sapiens”對兩種疾病及消癌解毒方所含化合物對應(yīng)靶點進行校正和統(tǒng)一，共得到“Colorectal Adenoma”對應(yīng)唯一靶點3 279個、“Colorectal cancer”對應(yīng)唯一靶點4 119個、消癌解毒方所含化合物對應(yīng)唯一靶點235個，將三者的靶點通過Bioinformatics＆Evolutionary Genomics平臺取交集（見圖1），結(jié)直腸癌、結(jié)直腸腺瘤性息肉與消癌解毒方共有相同靶點110個，將其設(shè)定為消癌解毒方治療結(jié)直腸腺瘤性息肉癌變的關(guān)鍵潛在靶點，為構(gòu)建中藥-化學(xué)成分-關(guān)鍵靶點網(wǎng)絡(luò)做準備。

2.4 “消癌解毒方-化合物-關(guān)鍵靶點”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建運用Cytoscape軟件分別構(gòu)建中藥-化合物-關(guān)鍵靶點網(wǎng)絡(luò)和疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)，并進行整合得到中藥-化合物-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)，結(jié)合2.3項下110個關(guān)鍵潛在靶點信息，提取關(guān)鍵靶點相關(guān)子網(wǎng)絡(luò)，形成“消癌解毒方-化合物-關(guān)鍵靶點”網(wǎng)絡(luò)（圖2，其中三角形代表消癌解毒方、六邊形代表各味中藥，圓形代表靶點和化合物，節(jié)點顏色越深代表節(jié)點度賦值越高）。圖2網(wǎng)絡(luò)中，共包含213個節(jié)點、556條邊，以節(jié)點度值Degree≥20為界，得到消癌解毒方包含的中藥苦參、黨參對應(yīng)的節(jié)點度值分別為44、20，為該網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵中藥；槲皮素（quercetin）、木樨草素（luteolin）、山柰酚（kaempferol）、7-甲氧基-2-甲基異黃酮（7-Methoxy-2-methyl isoflavone）節(jié)點度值分別為86、43、38、20，為該網(wǎng)絡(luò)中較為重要的有效成分；相關(guān)靶點中環(huán)加氧酶2（prostaglandin endoperoxide synthase 2，PTGS2）、環(huán)加氧酶1（prostaglandin endoperoxide synthase 1，PTGS1）、核受體輔激活蛋白2（nuclear receptor coactivator 2，NCOA2）、雌激素受體1（estrogen receptor 1，ESR1）節(jié)點度值分別為39、30、24、20，為該網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵作用靶點。

圖1 腸癌、腸腺瘤、消癌解毒方對應(yīng)靶點韋恩圖

圖2 關(guān)鍵潛在靶點的中藥-化合物-關(guān)鍵靶點網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 關(guān)鍵靶點的GO富集結(jié)果結(jié)合Enrichr數(shù)據(jù)庫功能，對110個關(guān)鍵潛在靶點進行GO功能富集（見圖3），富集后得到參與生物過程的關(guān)鍵靶點分別為:白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、細胞核因子κp65蛋白（nuclear factor-KBp65，RelA）、蘇氨酸蛋白激酶1（protein-threonine kinases AKT1）、血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothlial growth factor，VEGFA）、沉默信息調(diào)節(jié)因子1（Sirtuin1，SIRT1）、抑癌基因P53（Tumor Protein P53，TP53）等，作用的生物學(xué)過程主要集中在細胞對刺激因子的反應(yīng)、凋亡過程的調(diào)控、細胞因子介導(dǎo)的信號通路、程序性細胞死亡的負調(diào)控、基因表達的正調(diào)控、核酸轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、細胞對活性氧的反應(yīng)、轉(zhuǎn)錄正調(diào)控、細胞增殖調(diào)控、細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控、MAPK級聯(lián)激活（Mitogen-activated protein kinase cascade，MAPK cascade）的正向調(diào)節(jié)、細胞對氧化應(yīng)激的反應(yīng)、RNA聚合酶II啟動子轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白質(zhì)磷酸化的正調(diào)控等。富集得到的參與細胞成分的關(guān)鍵靶點分別為:TP53、沉默信息調(diào)節(jié)因子1（Silent information regulator，SIRT1）、核轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白1（Activator protein-1，AP-1）、重組人有絲分裂原激活蛋白激酶1（Recombinant Human Mitogen-Activated Protein Kinase 1，MAPK1）、過氧化物酶體增殖物激活受體（Peroxisome proliferators-activated receptors，PPARD）、轉(zhuǎn)錄因子1（E2F Transcription Factor 1，E2F1）、重組人谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶Pi1（Recombinant Human Glutathione S-Transferase pi 1，GSTP1）等，作用的細胞成分主要集中在細胞分泌顆粒管腔、細胞質(zhì)膜穴樣內(nèi)陷、細胞核染色體部分、脂膜筏、血小板α顆粒管腔、線粒體外膜、細胞質(zhì)囊腔等。富集得到參與分子功能的關(guān)鍵靶點有:TP53、RelA、ESR1、AP-1、EGFR、重組人受體酪氨酸激酶（recombinant human tyrosine kinase receptor ErbB-3，ErbB-3）、糖皮質(zhì)激素受體（nuclear receptor subfamily 3 group Cmember 1，NR3C1）等，作用的分子功能主要包括蛋白激酶結(jié)合因子、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合因子、轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)DNA結(jié)合因子、核心啟動子結(jié)合因子、細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶活性因子、RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合因子、核心啟動子近端序列特異性DNA結(jié)合因子等。

圖3 關(guān)鍵潛在靶點的GO富集分析圖

2.6 關(guān)鍵靶點的KEGG富集結(jié)果從Enrichr數(shù)據(jù)庫下載KEGG通路相關(guān)數(shù)據(jù)，轉(zhuǎn)換為omicshare平臺相匹配的格式后進行分析，共得到KEGG富集通路108條，其中P＜0.01的有88條，基因富集數(shù)量最高為42個、最低為2個。采用P值和基因富集數(shù)量交叉篩選的方法，篩選出富集排名前20位的信號通路［7］（見圖4）?？梢娤┙舛痉椒乐谓Y(jié)直腸腺瘤性息肉癌變的關(guān)鍵潛在靶點富集得到的主要信號通路包括癌癥途徑、前列腺癌、AGE-RAGE信號通路、乙型病毒性肝炎、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、PI3K-Akt信號通路、IL-17信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、人巨細胞病毒感染、胰腺癌、EB病毒感染、麻疹、人T細胞白血病病毒1型感染、癌癥中的蛋白多糖、丙型病毒性肝炎、膀胱癌、細胞衰老、細胞凋亡、小細胞肺癌途徑等。

圖4 關(guān)鍵潛在靶點的KEGG富集分析圖

3 討論

防治結(jié)直腸腺瘤性息肉癌變和復(fù)發(fā)的消癌解毒方，主要由黨參、苦參、白術(shù)、黃連、烏梅、白花蛇舌草等組成。其中黨參、白術(shù)主補氣虛、血虛，調(diào)和健脾［8-10］；白花蛇舌草、苦參、黃連專于解毒，尤以熱毒、濕毒為主，并可防治癌毒；烏梅不僅可下虛火、固腸脫，其性多有收澀、瀉下、重鎮(zhèn)的特點，是為沉降之藥，而且可作為引經(jīng)藥，引藥入腸腑［11］。除核心藥物外，另有助祛腸腑寒濕藥輔助，這些藥物之間的制化協(xié)助關(guān)系，保持人身整體的協(xié)調(diào)平衡和機體內(nèi)環(huán)境的統(tǒng)一。

疾病與機體之間的相互關(guān)聯(lián)作用機制錯綜復(fù)雜，致病因素反饋過程的機理也縱橫交錯，治療的藥物只有通過多途徑、多系統(tǒng)協(xié)調(diào)，才能發(fā)揮相對有效的防治疾病作用。本研究通過網(wǎng)絡(luò)分析，預(yù)測消癌解毒方可對結(jié)直腸腺瘤性息肉、結(jié)直腸癌的多個靶點、多個通路發(fā)揮作用，其中槲皮素、木樨草素、山柰酚等成分已經(jīng)過論證具有防治結(jié)直腸癌變的作用［12］。既往研究顯示，姜黃素和槲皮素聯(lián)合防治腸腺瘤復(fù)發(fā)和癌變可能具有一定療效，作用機制主要為阻滯細胞周期、抑制細胞侵襲及轉(zhuǎn)移、調(diào)節(jié)腫瘤信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、抑制相關(guān)基因與蛋白的表達等［13］。木樨草素通過抑制Wnt/β-catenin/TCF-4信號通路來抑制結(jié)直腸癌［14］。山柰酚則通過上調(diào)p53的蛋白表達量抑制結(jié)腸癌細胞增殖［15］。上述已有的研究結(jié)果與預(yù)測結(jié)果基本一致，提示消癌解毒方主要有效成分對結(jié)直腸腺瘤性息肉癌變具有一定的防治作用。

結(jié)合上述GO富集分析結(jié)果，消癌解毒方防治結(jié)直腸腺瘤性息肉癌變的潛在靶基因富集結(jié)果顯示，其作用的主要關(guān)鍵靶點有TP53、SIRT1、JUN、RELA、EGFR、IKBKB、IRF1等。TP53突變是惡性腫瘤發(fā)展的潛在預(yù)測因子，是促使腺瘤向腺癌轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵步驟［16-17］。SIRT1是腺瘤癌變過程中的重要物質(zhì)［18］。SIRT1與P53可能起協(xié)同作用促進結(jié)腸癌的發(fā)生［19］。JUN參與結(jié)直腸癌疾病進程，可能成為結(jié)直腸癌預(yù)防和治療的潛在靶點［20］。RELA通路促進腸上皮細胞趨向疾病［21］。EGFR、P53基因均參與結(jié)直腸腺瘤性息肉癌變，EGFR可能作用于早期，P53基因則可能作用于晚期［22］。因此檢測EGFR、P53對早期診斷結(jié)直腸腺瘤性息肉癌變有一定的臨床意義。IKBKB參與多種免疫細胞對激活刺激的反應(yīng)［23］，可能通過免疫受損促進腸上皮細胞癌變。IRF1通過抑制RAS-RAC1通路抑制大腸癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移［24］，其在結(jié)直腸癌組織中表達下調(diào)，功能上發(fā)揮抑癌作用［25］。通過分析可知，SIRT1、P53、JUN、RELA、IKBKB可促進腸癌的發(fā)生，為消癌解毒方預(yù)防和治療結(jié)直腸腺瘤性息肉癌變的潛在作用靶點；EGFR、P53基因則可作為消癌解毒方逆轉(zhuǎn)腺瘤癌變的關(guān)鍵靶點；IRF1則可作為消癌解毒方抑制結(jié)直腸癌變的潛在靶點進行深入研究。

KEGG通路富集結(jié)果主要集中在PI3K-Akt、IL-17、腫瘤壞死因子等通路上，涉及免疫炎癥反應(yīng)、代謝、細胞分化和凋亡等多個復(fù)雜的生物學(xué)系統(tǒng)。PI3K-AKT這一自噬經(jīng)典信號通路與結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移關(guān)系密切［26］。IL-17在結(jié)直腸癌組織中表達水平最高、癌旁組織次之、正常黏膜組織最低［27］。該信號通路可能為結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展過程中的重要促進因子。腫瘤壞死因子、表皮生長因子受體在結(jié)直腸腺瘤性息肉組織中表達均高于正常大腸黏膜組織，兩者相關(guān)的通路可能在結(jié)直腸腺瘤性息肉的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用［28］。晚期結(jié)腸癌腫瘤組織TNF-α、IL-6陽性表達率均高于早期，證明TNF-α和IL-6在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展中起免疫調(diào)節(jié)作用［29］。由此可見，與免疫炎癥反應(yīng)、細胞衰老和凋亡等疾病相關(guān)的通路也有可能成為消癌解毒方防治結(jié)直腸腺瘤性息肉癌變的靶點。

本研究基于系統(tǒng)思維的方法，運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相關(guān)技術(shù)，對消癌解毒方防治結(jié)直腸腺瘤性息肉癌變的潛在作用機制進行預(yù)測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，消癌解毒方中的槲皮素、木樨草素、山柰酚等有效化合物可能通過PI3K/Akt信號通路、IL-17信號通路、癌癥中的蛋白多糖、細胞衰老、細胞凋亡等信號通路，作用于PTGS2、PTGS1、IL6、EGFR、AKT1、TP53、JUN等關(guān)鍵靶蛋白而發(fā)揮防治結(jié)直腸腺瘤性息肉癌變的功效。從系統(tǒng)生物學(xué)角度對消癌解毒方防治結(jié)直腸腺瘤性息肉癌變潛在機制進行預(yù)測結(jié)果的分析，符合中醫(yī)運用復(fù)方中藥多組分、多系統(tǒng)、多靶點、多途徑整體調(diào)理機體、防治疾病的特點。但運用多個數(shù)據(jù)庫篩選核心化合物和靶標、多個軟件平臺處理數(shù)據(jù)、多組文獻研究進行印證分析結(jié)果，均不夠客觀，可能在以上研究中混雜較多影響因素，導(dǎo)致輸出或分析結(jié)果存在一定的局限性，故需要今后努力在基礎(chǔ)和臨床研究中將預(yù)測結(jié)果進行深入驗證。